Lo scopo di questa parte del lavoro è stato la ricerca delle condizioni sperimentali idonee alla determinazione della CMC della miscela binaria di tensioattivi scelta per la preparazione delle nanomicelle medicate attraverso la misura della tensione superficiale. È stato utilizzato l’angolo di contatto ottico (OCA 15, DataPhysicsInstrumentGmbH, Filderstadt, Germany)(Figura 16).Il sistema consisteva in una videocamera CCD ad alta risoluzione con uno zoom di 6x e un sistema integrato di focus. Le immagini ottenute venivano analizzate con il software SCA 20. Per la determinazione veniva utilizzata la tecnica della goccia pendente che consisteva nel far gocciolare il formulato su un vetrino ottico. Differenti volumi (5, 7, 8, 10 L) di formulato sono stati gocciolati a differenti velocità (30, 50, 70 L min-1) per avere le condizioni ottimali alla misurazione (Figura 17). Nel
momento in cui la goccia si adagiava sul piano e raggiungeva uno stato di equilibrio (Figura 18), veniva scattata la foto e analizzata secondo il metodo di integrazione di Laplace-Young:
σs = Ysl + σl ∙ cos θ
dove θ rappresenta l’angolo di contatto, σs è la tensione superficiale del solido, Ysl è la tensione interfacciale fra la superficie liquida e solida e infine σl rappresenta la tensione superficiale della componente liquida (Figura 19).
40
Il volume e la velocità selezionati in grado di permettere le migliori condizioni di misurazione sono stati 5Ledi 50 L min-1, rispettivamente. Per il test, è stato stabilito un
range di concentrazione in tensioattivo totale tra 0.0001 e 1% w/w.
RISULTATI E DISCUSSIONE
L’obiettivo principale del presente studio era quello di ottenere una formulazione acquosa per applicazione oculare contenente loteprednolo etabonato in forma solubilizzata, arduo compito visto la natura lipofila del principio attivo. La prima fase ha riguardato la selezione dei tensioattivi più efficaci a tale scopo. E’ stato valutato l’effetto solubilizzante di differenti tensioattivi non ionici con un range di HLB compreso tra 10 e 20, caratteristico di tensioattivi con carattere prettamente idrofilo all’aumentare del valore di HLB e sono stati utilizzati nelle rispettive concentrazioni massime ammesse dagli organi regolatori per l’applicazione oftalmica. I risultati di tali esperimenti sono riassunti in Tabella 4 e più schematicamente in istogramma Figura 20. La vitamina E TPGS si è rivelata la più efficace con differenze statisticamente significative (LE solubilizzato:0.2090.005 mg/ml) seguita da Kolliphor EL (0.141 0.004 mg/ml), Cremophor A6 (0.1390.010 mg/ml), HS15 (0.1270.005 mg/ml)e Soluplus (0.0940.004 mg/ml) che avevano un comportamento pressoché analogo. Poco efficace è risultato RH-40, completamente inefficaci Pluronic P407 e Brij 72. I tensioattivi migliori sono stati utilizzati per la preparazione del sistema nanostrutturato, utilizzando una miscela binaria di due tensioattivi come riportato in Tabella 3. Dapprima è stata eseguita una valutazione organolettica delle formulazioni nanomicellari preparate in termini di trasparenza e di filtrabilità secondo le indicazioni riportate nelle Tabelle 5 e 6, in cui ad ogni condizione è stato dato uno score. I risultati di tale analisi sono riportati in Tabella 7. Le formulazioni Nano S/H, Nano-E/S e Nano-S/T sono risultate le più critiche in termini sia di trasparenza che di filtrabilità. Tali formulazioni che si presentavano lattiginose e senza alcun miglioramento dopo filtrazione contenevano Soluplus che probabilmente era responsabile di questo effetto di pseudo-emulsione. In tutti i casi, le formulazioni preparate sono state caratterizzate dal punto di vista chimico fisico come riportato in Tabella 8.La vitamina E TPGS era il tensioattivo che contribuiva alla maggiore efficienza di incapsulazione indipendentemente da quale fosse l’altro tensioattivo abbinato: la quantità di LE incapsulata passava da 0,1920.0003 mg/ml nel caso dell’associazione con Soluplus a 0,20.01ml/ml con Kolliphor EL e 0.2530.009
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mg/ml quando la vitamina E TPGS era combinata con HS-15, che dava il migliore risultato anche in termini di dimensioni (13.570.493 nm) ed omogeneità dimensionale (PDI: 0.2710.110nm). Per quanto riguarda le formulazioni contenenti Soluplus è possibile notare che danno origine a sistemi nanostrutturati con dimensioni superiori a 60 nm (Nano-E/S: 68.271.626 nm; Nano-S/H: 85.130.808nm) con un maggiore indice di polidispersività oltre a non apportare significativi vantaggi in termini di solubilità del principio attivo (0.1210.004 e 0.1760.007 mg/ml per Nano-E/S e Nano-S/H, rispettivamente). La combinazione di vitamina E TPGS, tensioattivo non ionico idrofilo con Brij 72, tensioattivo non ionico lipofilo, più affine al farmaco, quindi capace di interagire maggiormente con il principio attivo, è risultata una strategia non praticabile; sembra che le nanomicelle non si strutturino.
Parallelamente è stata valutata la possibilità di aumentare la solubilità del LE in tampone fosfato mediante complessazione con ciclodestrine. I complessi di inclusione farmaco- ciclodestrine sono noti per migliorare le proprietà chimiche e biologiche della molecola considerata, per esempio possono aumentare la solubilità in acqua, la dissoluzione e la biodisponibilità di farmaci lipofili oltre che la loro stabilità chimico-fisica ed il tempo di emivita (Carneiro et al. 2019).
La complessazione del farmaco con ciclodestrine non è risultata efficace nel processo di solubilizzazione del loteprednolo etabonato. La quantità di farmaco solubilizzato per ml di PBS rimaneva nell’intervallo 0.021-0.0086 mg/ml (Tabella 9) con EI% compresi tra 2.33 e 0.99, notevolmente al di sotto di quello ottenuto con i sistemi nanostrutturati.
Sulla base dei risultati ottenuti in questa fase preliminare, la scelta è ricaduta sulla formulazione nanomicellare Nano-T/H contenente il 10% della miscela vitamina E TPGS e Kolliphor® HS-15 in rapporto ponderale 1:1. Un ulteriore tentativo per aumentare la capacità solubilizzante del sistema tensioattivo è stato fatto modificando la metodica preparativa e preparando le nanomicelle con il metodo per fusione. Come riportato in Tabella 8, i parametri chimico fisici del sistema nanostrutturato preparato sono pressoché equivalenti a quelli ottenuti con il metodo per dissoluzione, per cui quest’ultimo è stato il metodo selezionato. La formulazione scelta è stata Nano-T/H che conteneva il 10% di quantità totale di tensioattivi. Considerando che la formulazione è stata pensata per l’applicazione oculare, sarebbe stato auspicabile diminuire il più possibile, sempre in relazione al potere solubilizzante nei confronti del farmaco, il contenuto in tensioattivi per ridurre al minimo gli effetti collaterali a carico dell’occhio durante l’uso. A questo scopo è stata costruita una curva di solubilità del loteprednolo etabonato in presenza di quantità
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variabili (1, 2, 5, 7 e 10%) della miscela di tensioattivi, mantenendo il rapporto tra vitamina E TPGS e Kolliphor HS-15 1:1. La quantità di farmaco solubilizzato dal sistema nanomicellare (Figura 21) sembrava aumentare linearmente all’aumentare della quantità totale della miscela di tensioattivi in oggetto fino ad un plateau (7%) che corrispondeva ad una concentrazione di farmaco solubilizzata di 0.214 ± 0.019mg/ml. L’utilizzo del 10% di tensioattivi totali non sembrava migliorare significativamente la solubilità del farmaco in tampone fosfato per cui nell’ottica di ridurre il più possibile il quantitativo in tensioattivi è stato sottoposto alle prove di rilascio in vitro il sistema nano strutturato contenente il 7% di miscela di vitamina E TPGS e Kolliphor HS-15. Le suddette nanomicelle presentavano le seguenti caratteristiche chimico fisiche riportate come media di 3 determinazioni ± deviazione standard: EI%: 21.37± 1.88; DL%: 0.30 ± 0.025; Dh= 12.91 ± 0.395 nm con un
PDI pari a 0.124 ± 0.019 nm.
In Figura 22 è riportata la quantità di farmaco rilasciata (in microgrammi) dal sistema vescicolare nel tempo nel mezzo costituito da tampone fosfato pH 7.4. In questa prova preliminare, la formulazione nanomicellare mostrava una rapida diffusione del farmaco rilasciando in 4 ore 10.34 g di LE con notevole variabilità tra i set di prove. Il profilo di rilascio della formulazione nanomicellare preparata in questo lavoro di tesi è stato messo a confronto con quello ottenuto in un lavoro precedente con una formulazione, sempre a base di un sistema nanostrutturato ma di tipo liposomiale, con un’analoga quantità di farmaco incapsulato. Come mostrato in Figura 23, le due formulazioni si comportano in modo notevolmente diverso, nonostante abbiano un carico analogo di farmaco: la formulazione nanomicellare, che si presenta come dispersione limpida da applicare nell’area precorneale come collirio, ha permesso la solubilizzazione del farmaco sfruttando la capacità dei tensioattivi di formare nanostrutture micellari e porta ad un rilascio più veloce con una velocità di rilascio pari a 2.83 g/ora; la formulazione liposomiale contenente Lipoid S100 (94% di fosfatidilcolina) e colesterolo con una quantità di LE incapsulato di 0.19mg/ml, dispersione grossolana (intorno 200nm)ha mostrato un rilascio di tipo lineare e prolungato nel tempo portando ad un rilascio di farmaco dopo 4 ore di 1.43g con una velocità ridotta a circa un decimo (0.255g/h) rispetto alla formulazione nanomicellare. La formulazione nanomicellare sembra rispondere alle esigenze di una facile somministrazione e di non interferenza con i normali processi fisiologici. La formulazione liposomiale era pensata,invece, per avere un rilascio graduale e prolungato nel tempo. Entrambe potrebbero essere buoni candidati come alternativa al prodotto commerciale Lotemax sospensione acquosa.
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50
TABELLE
Tabella 1. Composizione delle dispersioni tensioattivo/farmaco per prove di solubilità del loteprednolo etabonato (LE) in tampone fosfato (pH 7.4, 66 mM)
Tensioattivo HLB % (p/p) LE (mg) Soluplus (S) 14 5.0 10 RH-40 (R) 14-16 0.5 10 HS-15 (H) 16 7.0 10 TPGS (T) 16 5.0 10 P407 (P) 20 0.2 10 EL (E) 12-14 5.0 10 A6 (A) 10-12 1.0 10 Brij 72 (B) 4-5 1.0 10
Tabella 2. Rapporti molari utilizzati nella complessazione tra idrossipropil-β ciclodestrine (HPβ-CD) e loteprednolo etabonato (LE)
Formulazione HPβ-CD (mg) LE (mg) Rapporto molare HPβ-CD: LE HPβ-CD-1 11.3 1.0 3.78 : 1.0 HPβ-CD-2 11.3 0.8 4.76 :1.0 HPβ-CD-3 11.3 0.9 4.2 :1.0 HPβ-CD-4 2.8 0.9 1.04: 1.0
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Tabella 3. Composizione delle formulazioni nanomicellari sviluppate espresse in %p/p Formulazione TPGS HS-15 EL Soluplus® Brij 72
Nano-S/H - 5 - 5 - Nano-T/H 5 5 - - - Nano-E/T 4.5 - 1 - - Nano-E/H - 5 1 - - Nano-E/S - - 1 5 - Nano-S/T 5 - - 5 - Nano-T/B 5 - - - 1
Tabella 4. Solubilità apparente del loteprednolo etabonato (LE) in diverse dispersioni a base di tensioattivo a concentrazione variabile(Media ± SD, n=3) Tensioattivo, tipo Tensioattivo, % LE solubilizzato (mg/ml) Soluplus (S) 5.0 0.094±0.004 RH-40 (R) 0.5 0.015± 0.005 HS-15 (H) 7.0 0.127± 0.007 TPGS (T) 5.0 0.209± 0.005 P 407 (P) 0.2 0.003± 0.002 EL (E) 5.0 0.141±0.004 A6 (A) 1.0 0.139±0.010 Brij 72 (B) 1.0 0.001 ±0.001
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Tabella 5. Valutazione del grado di trasparenza delle formulazioni sviluppate
Grado di trasparenza Grado
Torbido: la formulazione acquisisce un aspetto lattiginoso. + Opaco: la formulazione si presenta con una colorazione e con presenza di materiale
sospeso. ++
Leggera opalescenza: la formulazione rimane omogenea ma perde di nitidezza. +++ Limpida: la formulazione appare completamente trasparente. ++++
Tabella 6. Valutazione della resistenza alla filtrazione sterilizzante (0.22 µm) delle formulazioni sviluppate Grado di filtrabilità della formulazione Grado Non filtrabile: la formulazione dava resistenza alla pressione effettuata con
intasamento del filtro,impedendo la filtrazione.
* Poco filtrabile: la formulazione dava resistenza alla pressione effettuata tendendo ad
intasare il filtro, consentendo comunque la filtrazione. ** Filtrabile: la formulazione veniva filtrata senza alcuna resistenza. ***
Tabella 7. Valutazione delle formulazioni ottenute sulla base della trasparenza e filtrabilità Formulazione Gradi di trasparenza Filtrabilità
Nano- S/H + * Nano- E/T ++ ** Nano- E/H ++ ** Nano- E/S + * Nano- T/H ++++ *** Nano- T/HFusione +++ *** Nano- ST + * Nano- TB ++ *
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Tabella 8. Contenuto di farmaco (LE, mg/ml), efficienza di incapsulazione (EI, %), capacità di carico, (DL, %) dimensioni (Dh, nm) e indice di polidispersività(PDI) delle formulazioni nanostrutturate a base di loteprednolo
etabonato(Media ± SD, n=3) Formulazioni LE (mg/ml) EI % DL % Dh (nm ± SD) PDI (nm ± SD) Nano- S/H 0.176± 0.007 17.6± 0.68 0.17± 0.007 85.13 ± 0.808 0.507 ± 0.020 Nano- T/H 0.253± 0.009 25.3± 0.91 0.25± 0.008 13.57 ± 0.493 0.271 ± 0.110 Nano- T/HFusione 0.251± 0.013 25.1±1.33 0.24± 0.013 11.70 ± 0.557 0.085 ±0.240 Nano- E/T 0.200± 0.010 20.1± 0.96 0.36± 0.018 12.03 ± 0.252 0.303 ± 0.091 Nano- E/H 0.129± 0.002 12.9± 0.21 0.21± 0.003 13.47 ± 0.305 0.145 ± 0.115 Nano- E/S 0.121± 0.004 12.1± 0.40 0.19± 0.006 68.27 ± 1.626 0.471 ± 0.034 Nano- S/T 0.192± 0.003 19.2± 0.31 0.19± 0.003 17.93 ±0.908 0.343 ± 0.150 Nano-T/B 0.216± 0.006 21.5± 0.61 0.35± 0.010 26.60 ± 0.500 1.089 ± 0.023
Tabella 9. Solubilità del loteprednolo etabonato (LE) complessato in diversi rapporti molari con idrossipropil- βciclodestrine(HPβ-CD)(Media ± SD, n=3)
Formulazione LE(mg/ml) EI% CF% HPβ-CD-1 0.016 ±0.0002 1.59± 0.03 0.13±0.006 HPβ-CD-2 0.011 ± 0.0008 1.50± 0.13 0.10± 0.001 HPβ-CD-3 0.021 ±0.0003 2.33± 0.06 0.17± 0.006 HPβ-CD-4 0.009 ± 0.0006 0.99± 0.11 0.24± 0.030
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FIGURE
Figura 13. Aspetto delle dispersioni di farmaco in tampone fosfato contenenti i tensioattivi testati dopo filtrazione
55
Figura 15. Analisi quantitativa del loteprednolo etabonato mediante HPLC: curva di taratura in tampone fosfato pH 7.4
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Figura 17. Tecnica della goccia pendente
Figura 18. Condizioni di equilibrio di una goccia adagiata su un vetrino, prima della misurazione dell’angolo di contatto
Figura 19. Esempio di misurazione dell’angolo di
Figura 20. Solubilità del loteprednolo etabonato in PBS in presenza dei singol
Solup lus, 5 RH 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 L E , m g/ m L 57
Esempio di misurazione dell’angolo di contatto secondo il metodo di integrazione di Laplace Young
Solubilità del loteprednolo etabonato in PBS in presenza dei singoli tensioattivi (Media ± SD, n=3)
s, 5% RH-4 0, 0. 5% HS-1 5, 7 % TPGS , 5% P407 , 0.2 % Kollip hor E L, 5 % Crem opho r A6, 1% Brij 7 2, 1 %
todo di integrazione di Laplace-
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Figura 21. Curva di solubilità del loteprednolo etabonato in relazione alla percentuale totale della miscela Vitamina ETPGS/Kolliphor HS-15 (1:1)
Figura 22. Profilo di rilascio in vitro del loteprednolo etabonato dalla formulazione nanomicellare Nano-T/H (7% in tensioattivi totali)
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Figura 23. Profilo di rilascio in vitro del loteprednolo etabonato dalle formulazioni nanomicellare e liposomiale