Esistono numerosi metodi di preparazione delle vescicole liposomiali, dai quali dipendono sia il tipo che le dimensioni dei liposomi ottenuti. È possibile però, identificare tre fasi generali comuni:
1. Preparazione delle vescicole liposomiali 2. Dimensionamento
3. Purificazione
6.1.1 Fase di preparazione delle vescicole liposomiali
I metodi di preparazione si possono suddividere in:
Metodi meccanici. Uno dei metodi più semplici è il metodo di idratazione a film sottile. Tale metodo prevede la preparazione di una soluzione organica solubilizzando in essa i componenti lipidici. Il solvente organico maggiormente utilizzato è il cloroformio o una miscela di cloroformio e metanolo. Per l’evaporazione del solvente organico si utilizza un evaporatore rotante mantenendolo sotto vuoto, consentendo così la formazione di un film lipidico sottile sulle pareti del recipiente.
Il film lipidico viene idratato con acqua o con tampone. L’idratazione, effettuata mantenendo in rotazione l’evaporatore rotante, provoca la separazione dei doppi strati lipidici presenti nel film i quali, curvandosi opportunamente formano strutture vescicolari chiuse: i liposomi. Il processo di idratazione del film lipidico può essere condotto a temperatura ambiente o ad una temperatura superiore alla temperatura di transizione. del
lipide utilizzato. Spesso, al fine di favorire il completo distacco del film dal pallone, si aggiungono delle sferette di vetro che aumentano la superficie di contatto tra i lipidi e la soluzione.
Il farmaco da incapsulare all’interno del liposoma può essere aggiunto alla fase acquosa o alla fase organica, a seconda delle caratteristiche fisico-chimiche del farmaco (Godbole e Mathur, 2018).
Metodi basati sulla sostituzione di solventi organici con mezzi acquosi. Il processo di evaporazione inversa (REV) si basa sulla formazione di gocce d’acqua circondate da lipidi e disperse in un solvente organico. La tecnica viene eseguita sciogliendo i lipidi in un solvente organico, aggiungendo un piccolo volume di fase acquosa, quindi sonicando la soluzione vengono prodotte micelle invertite. Il solvente organico viene rimosso usando un
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evaporatore rotante con formazione di un gel viscoso. Quando il solvente è stato sufficientemente rimosso, il gel collassa e si forma una sospensione acquosa di vescicole.
Metodi basati sulla rimozione di detergenti:Il metodo si basa sulla formazione di micelle detergente-lipide, seguita dalla rimozione del detergente per formare liposomi. Micelle detergente-lipide possono essere formate idratando un lipide con una soluzione detergente o asciugando sia lipidi che detergente da una soluzione organica, quindi aggiungendo una soluzione acquosa. Il detergente si associa al lipide, proteggendo le porzioni idrofobe dall'interazione con la fase acquosa, e quindi si formano micelle anziché vescicole. Il detergente viene rimosso dalla soluzione micellare, mediante diluizione da 10 a 100 volte, dialisi, cromatografia su colonna o adsorbimento, per formare le vescicole.
6.1.2 Fase di dimensionamento
I metodi di produzione delle vescicole liposomiali devono consentire la produzione di sospensioni liposomiali di dimensioni adatte al fine della somministrazione farmacologica, caratterizzate da una distribuzione dimensionale riproducibile ed omogenea.
La dimensione e l’omogeneità sono caratteristiche molto importanti che influenzano la stabilità, l’incapsulamento, l’efficienza, il profilo di rilascio del farmaco e l’assorbimento cellulare dei carrier lipidici (Danaei et al., 2018).
Le tecniche più utilizzate sono:
Applicazione di ultrasuoni: gli ultrasuoni possono essere applicati tramite sonda ad ultrasuoni o sonicatori a bagno. A causa della minore energia che sono in grado di fornire al campione, non sono in grado di ottenere liposomi di piccole dimensioni (Sharma et al., 2018).
Omogeneizzazione: la sospensione liposomiale viene pompata ripetutamente ad alta pressione attraverso un piccolo orifizio o camera di reazione fino ad ottenere la dimensione media desiderata delle particelle liposomiali(Ahmed et al., 2018).
Estrusione: la sospensione liposomiale viene estrusa attraverso filtri di membrana di policarbonato con pori di diametro ben definito applicando una pressione di 5-7 atm. Il processo di estrusione viene condotto ad una temperatura superiore alla Tc del fosfolipide. Questa procedura ha dei vantaggi rispetto ai metodi di omogeneizzazione e sonicazione in quanto sono disponibili gamme di filtri di membrana con una varietà di dimensioni dei pori, e inoltre, permette di ottenere un
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range distribuzionale delle dimensioni dei liposomi piuttosto ristretto, in particolare estrudendo più volte il materiale attraverso il filtro di membrana (Ahmed et al., 2018).
“French press”: questa tecnica consiste nel far passare la sospensione liposomiale attraverso un orifizio, applicando pressioni estremamente elevate. Questa tecnica porta all’ottenimento di liposomi unilamellari di piccole dimensioni (Patil e Jadhav, 2014).
6.1.3 Fase di purificazione
Questa fase ci permette di separare le vescicole liposomiali dal farmaco non incapsulato. La purificazione della sospensione liposomiale può essere effettuata mediante:
Dialisi: vengono utilizzate membrane con cut-off compreso fra 10 e 100 kDa, in relazione al peso molecolare del farmaco da allontanare
Ultracentrifugazione: l’ultracentrifuga può essere condotta in mezzo continuo (tampone) o in gradiente di densità. Variando la velocità di rotazione e la durata della centrifugazione è possibile frazionare i liposomi in base alle dimensioni
Gel – filtrazione: questa tecnica, definita anche cromatografia ad esclusione dimensionale, è usata frequentemente per separare il farmaco non incapsulato dal liposoma carico. La cromatografia ad esclusione si basa sul principio che il liposoma non è trattenuto dal gel della colonna cromatografica e viene dunque eluito in un volume di eluente piuttosto basso; il farmaco non incapsulato viene invece eluito più lentamente e con un volume maggiore di eluente. Questa tecnica prevede l’utilizzo di colonne Sephadex®, Sepharose®, e Bio-Gel®, che differiscono per la granulometria del gel: questa viene scelta in base alle dimensioni dei liposomi che devono essere sottoposti al processo di purificazione. Un’ulteriore applicazione della gel-filtrazione è la possibilità di separare i liposomi MLV, di dimensioni più grandi, dai liposomi SUV. La purificazione per gel – filtrazione presenta il vantaggio di essere un processo rapido, ma porta, come svantaggio, alla diluizione del campione.(Li e Qi, 2019).
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