Università di Pisa
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Magistrale a Ciclo Unico in
Farmacia
Tesi di Laurea:
Sviluppo di nuovi sistemi nanomicellari per la
somministrazione oftalmica di Loteprednolo Etabonato
Relatori:
Candidato:
Prof.ssa Daniela Monti
Letizia Luisotti
Dott.ssa Eleonora Terreni
RIASSUNTO
Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di sviluppare nuovi sistemi nanomicellari per la somministrazione oftalmica di loteprednolo etabonato (LE), con l’obiettivo di aumentare la solubilità in ambiente acquoso del principio attivo di natura estremamente lipofila, di ottenere una formulazione limpida e trasparente adatta all’instillazione nell’area precorneale senza provocare fastidi e conseguentemente di aumentare la biodisponibilità. La messa a punto delle formulazioni nanomicellari di loteprednolo è partita dalla valutazione della capacità solubilizzante in tampone fosfato di una serie di tensioattivi adatti,dal punto di vista della struttura e della concentrazione, per l’applicazione oculare. Inoltre,come alternativa all’uso dei tensioattivi è stata presa in considerazione la complessazione con ciclodestrine. I tensioattivi che hanno permesso la maggiore solubilizzazione di farmaco sono stati usati per lo sviluppo di sistemi nanomicellari binari (misti). Tali formulati sono stati caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico determinando il diametro idrodinamico, l’indice di polidispersività, il grado di trasparenza e filtrabilità, la capacità di incapsulazione e di carico di farmaco nel sistema nanostrutturato. Le nanomicelle venivano preparate per semplice dissoluzione dei differenti componenti della formulazione. Gli studi di questa prima fase hanno dimostrato che le ciclodestrine portavano ad un aumento limitato della solubilità del LE in tampone fosfato. Per quanto riguarda i sistemi nanostrutturati, le nanomicelle miste hanno presentato una buona capacità di incapsulare il farmaco, con dimensioni piccole e un ristretto indice di polidispersività, con differenze in base alla composizione. Una fase discriminate nella scelta della formulazione più idonea è stata la filtrazione. Dopo filtrazione alcune formulazioni rimanevano lattiginose e torbide. Sulla base dei risultati ottenuti in questa fase preliminare, la scelta è ricaduta sulla formulazione nanomicellare Nano-T/H contenente il 10% della miscela vitamina E TPGS e Kolliphor® HS-15 in rapporto ponderale 1:1. Considerando che la formulazione è stata pensata per l’applicazione oculare, sarebbe stato auspicabile diminuire il più possibile, sempre in relazione al potere solubilizzante nei confronti del farmaco, il contenuto in tensioattivi per ridurre al minimo gli effetti collaterali a carico dell’occhio durante l’uso. A questo scopo è stata costruita una curva di solubilità del loteprednolo etabonato in presenza di quantità variabili (1, 2, 5, 7 e 10%) della miscela di tensioattivi, mantenendo il rapporto tra vitamina E TPGS e Kolliphor HS-15 1:1. Lo studio ha evidenziato che il 7% di tensioattivi totale permetteva l’incapsulazione di quantità di farmaco non molto diverse dal 10% per cui è stata scelta la formulazione contenente questo quantitativo totale di tensioattivi per gli studi di rilascio in
vitro. La formulazione nanomicellare mostrava una rapida diffusione del farmaco con una velocità di rilascio pari a 2.83 g/ora. La formulazione nanomicellare sembra rispondere alle esigenze di una facile somministrazione e di non interferenza con i normali processi fisiologici, diventando un buon candidato come alternativa al prodotto commerciale Lotemax sospensione acquosa.
Sommario
PARTE INTRODUTTIVA ... 1
1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DELL’APPARATO VISIVO ... 2
1.1 Il bulbo oculare ... 2 1.2 La cornea ... 3 1.3 La sclera ... 4 1.4 L’uvea ... 4 1.5 La retina ... 5 1.6 Il cristallino ... 5 1.7 Il corpo vitreo ... 5 1.8 Umore acqueo ... 6 1.9 Le vie ottiche... 6
1.10 L’apparato protettore del bulbo oculare ... 6
2 La TERAPIA OFTALMICA ... 7
2.1 La Somministrazione Oculare Topica ... 10
3 SISTEMI PER IL RILASCIO OCULARE DI FARMACI ... 13
3.1 Forme Farmaceutiche Liquide ... 13
3.2 Forme Farmaceutiche Semisolide ... 15
3.3 Forme Farmaceutiche Solide ... 16
4 NUOVI SISTEMI DU DRUG DELIVERY ... 16
5 NANOMICELLE... 18
5.1 Metodi di preparazione delle nanomicelle ... 20
5.2 Nanomicelle contenenti farmaci lipofili per applicazione topica oculare ... 22
6 LIPOSOMI ... 24
6.1 Metodi di preparazione dei liposomi ... 25
6.1.1 Fase di preparazione delle vescicole liposomiali ... 25
6.1.2 Fase di dimensionamento ... 26
6.2 Liposomi come drug delivery per formulazioni oftalmiche ... 28
PARTE SPERIMENTALE ... 29
1 Scopo del lavoro... 30
2 MATERIALI ... 30
2.1 Loteprednolo Etabonato ... 31
2.2 Vitamina E-TPGS (Vit E-TPGS)... 33
2.3 Polyoxil15- hydroxystearate (HS-15) ... 34
3 METODI ... 35
3.1 Studio di solubilità ... 35
3.1.2 Complessazione con idrossipropil-ciclodestrine ... 35
3.2 Preparazione delle formulazioni nanomicellari contenenti loteprednolo etabonato ……….36
4 CARATTERIZZAZIONE DELLE NANOMICELLE ... 37
4.1 Analisi dimensionale mediante light-scattering ... 37
4.2 Determinazione dell’efficienza di incapsulamento e capacità di carico delle nanomicelle contenenti LE ... 37
4.3 Solubilità del loteprednolo etabonato in relazione al quantitativo di tensioattivo utilizzato ... 38
4.4 Studi di rilascio in vitro ... 38
4.5 Analisi quantitativa del LE mediante HPLC ... 38
4.6 Determinazione della concentrazione micellare critica della miscela di tensioattivi attraverso l’angolo di contatto ... 39
RISULTATI E DISCUSSIONE ... 40
1
2
1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DELL’APPARATO VISIVO
L’apparato visivo è costituito da organi pari e simmetrici. Di tali organi, il principale è l’occhio o bulbo oculare; gli altri organi, denominati organi accessori dell’occhio, si possono raggruppare in un apparato motore e in apparato protettore.
I costituenti principali dell’apparato visivo sono:
Il bulbo oculare: organo pari e simmetrico situato all’interno della cavità orbitale, deputato alla ricezione degli stimoli luminosi;
Le vie ottiche: insieme di fibre nervose che si dipartono dal bulbo oculare per raggiungere la corteccia cerebrale;
Gli annessi oculari: composti da strutture accessorie di varia natura e funzione, situate intorno al bulbo oculare.
1.1 Il bulbo oculare
ll bulbo oculare (Figura 1) è contenuto per cinque sesti all’interno della cavità orbitaria, formata da tessuto osseo. È un organo sferoidale, leggermente appiattito in senso verticale, la cui parete è formata da tre tonache concentriche:
Tonaca esterna o fibrosa, che protegge le strutture più interne e si differenzia in cornea (anteriormente) ed in sclera (posteriormente);
Tonaca intermedia o vascolare, che prende il nome di uvea, rappresentata anteriormente dall’iride, medialmente dal corpo ciliare e posteriormente dalla coroide;
Tonaca interna o nervosa, formata interamente dalla retina.
Il globo oculare non è una sfera solida, ma contiene una grande cavità divisa in due parti, ovvero:
La cavità anteriore, costituita a sua volta da camera anteriore e camera posteriore, si trova davanti alla lente. La camera posteriore è delimitata dall’iride e dal cristallino, mentre la camera anteriore è delimitata dall’iride e dalla cornea. L’umor acqueo, liquido trasparente ed acquoso, riempie entrambe le camere. Non è ancora noto il meccanismo secondo il quale si forma l’umor acqueo: esso deriva principalmente dal sangue che circola nei capillari dei corpi ciliari. Inoltre, l’umor
acqueo può derivare anche dalla secrezio
secernono all’interno della camera posteriore, oppure dalla filtrazione passiva del sangue papillare.
La cavità posteriore, è molto più grande di quella anteriore, poiché essa occupa tutto lo spazio che si trova dieconsistenza gelatinosa.
1.2 La cornea
La cornea è una membrana trasparente, priva di vasi, ma ricchissima di fibre nervose. Ha un’area superficiale di circa 1.
tonaca fibrosa. Ha l’aspetto di calotta sferica, con raggio di curvatura inferiore a quello della sclera: la superficie anteriore è convessa ed è direttamente in rapporto con l’ambiente esterno, mentre la superficie posteriore è concava e delimita, in avanti, la camera anteriore dell’occhio.
La cornea è composta, dall’esterno verso l’interno, da
Epitelio pavimentoso: normalmente a contatto con l’aria; in condizioni di
delle palpebre, viene a trovarsi a contatto con la congiuntiva palpebrale, mediante la sola interposizione del film lacrimale. È costituito da cinque ad otto piani di cellule, ricche di tonofibrille ed unite da desmosoni;
Stroma o sostanza propri
cinquanta lamelle di sostanza amorfa glicoproteica, all’interno della quale si trovano 3
acqueo può derivare anche dalla secrezione attiva da parte
secernono all’interno della camera posteriore, oppure dalla filtrazione passiva del
, è molto più grande di quella anteriore, poiché essa occupa tutto lo spazio che si trova dietro alla lente; contiene il corpo vitreo, sostanza di
.
Figura 1. Anatomia dell'occhio
La cornea è una membrana trasparente, priva di vasi, ma ricchissima di fibre nervose. Ha .3 cm2, in quanto occupa un sesto della parte anteriore della tonaca fibrosa. Ha l’aspetto di calotta sferica, con raggio di curvatura inferiore a quello della sclera: la superficie anteriore è convessa ed è direttamente in rapporto con te esterno, mentre la superficie posteriore è concava e delimita, in avanti, la
La cornea è composta, dall’esterno verso l’interno, dai seguenti strati:
: normalmente a contatto con l’aria; in condizioni di
delle palpebre, viene a trovarsi a contatto con la congiuntiva palpebrale, mediante la sola interposizione del film lacrimale. È costituito da cinque ad otto piani di cellule, ricche di tonofibrille ed unite da desmosoni;
o sostanza propria: è lo stato fondamentale e prevalente. È formato da circa cinquanta lamelle di sostanza amorfa glicoproteica, all’interno della quale si trovano dei capillari, che lo secernono all’interno della camera posteriore, oppure dalla filtrazione passiva del
, è molto più grande di quella anteriore, poiché essa occupa tro alla lente; contiene il corpo vitreo, sostanza di
La cornea è una membrana trasparente, priva di vasi, ma ricchissima di fibre nervose. Ha , in quanto occupa un sesto della parte anteriore della tonaca fibrosa. Ha l’aspetto di calotta sferica, con raggio di curvatura inferiore a quello della sclera: la superficie anteriore è convessa ed è direttamente in rapporto con te esterno, mentre la superficie posteriore è concava e delimita, in avanti, la
: normalmente a contatto con l’aria; in condizioni di chiusura delle palpebre, viene a trovarsi a contatto con la congiuntiva palpebrale, mediante la sola interposizione del film lacrimale. È costituito da cinque ad otto piani di
a: è lo stato fondamentale e prevalente. È formato da circa cinquanta lamelle di sostanza amorfa glicoproteica, all’interno della quale si trovano
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fasci di fibre di collagene posti ortogonalmente tra loro, in modo da annullare la diffrazione della luce causata dai singoli piani. Negli spazi tra le lamelle si trovano le cellule corneali o cheratociti, di natura connettivale e di forma appiattita, provviste di prolungamenti lamellari;
Membrana di Descemet o lamina elastica posteriore: è prodotta dalle cellule dell’endotelio corneale sottostante. Il suo spessore dipende dalla specie e dall’età dell’individuo.
Endotelio corneale: costituito da un singolo strato di cellule appiattite di forma poligonale. Delimita anteriormente la camera anteriore.
La cornea è costituita principalmente da circa il 78% di acqua, da collageno (12-15%) e proteoglicani (1-3%). All’interno della cornea troviamo, in misura minore, proteine solubili, glicoproteine, lipidi, soluti a basso peso molecolare ed elettroliti. Il trasporto degli elettroliti (Na,Cl) a livello della cornea è fondamentale nel controllo dell’idratazione. Essendo la cornea un tessuto non vascolarizzato, i composti necessari per mantenerla vitale, quali ossigeno e glucosio, sono forniti rispettivamente dal film lacrimale e dall’umore acqueo.
1.3 La sclera
La sclera è una membrana compatta, di colore biancastro, dotata di marcata consistenza ed elasticità: confina anteriormente con la cornea e posteriormente con il nervo ottico. In realtà, il colore della sclera cambia col trascorrere degli anni, infatti risulta leggermente azzurra in età infantile, biancastra nell’adulto ed infine tendente al giallo in età senile. La sclera ha funzione di contenimento, di mantenimento della pressione intraoculare, di protezione e di supporto per i muscoli extraoculari.
1.4 L’uvea
La tonaca vascolare dell’occhio, definita anche uvea, è situata tra la tonaca fibrosa e quella nervosa, ed è riccamente vascolarizzata. Ha la funzione di assicurare un adeguato apporto nutritivo alla retina, grazie alla presenza dell’arteria oftalmica. Si divide in tre parti, che da dietro in avanti, sono la coroide, il corpo ciliare e l’iride (parte colorata dell’occhio).
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1.5 La retina
La tonaca nervosa dell’occhio, definita anche retina, è la parte più interna della membrana dell’occhio ed è incompleta, in quanto non è presente nella parte anteriore. È una membrana molto sottile e trasparente in condizioni normali. Nel complesso, essa è composta da due strati:
Lo strato esterno, formato da uno strato di cellule pigmentate e separato dalla coroide per mezzo della membrana di Bruch;
Lo strato interno, a struttura molto complessa, è formato principalmente da catene di neuroni a conduzione centripeta, quali neuroni fotorecettori, neuroni bipolari, e neuroni ganglionari.
L’apporto di sangue alla retina viene svolto dai capillari coroidali e dall’arteria retinica centrale, diramazione dell’arteria oftalmica.
1.6 Il cristallino
Il cristallino è una struttura trasparente, dalla consistenza elastica e solida, e dalla forma a lente biconvessa di circa 10 mm. Esso è l’unico organo del sistema diottrico dell’occhio in grado di adattare la propria capacità rifrattiva al variare della distanza dell’oggetto, modificando il proprio raggio di curvatura. Il cristallino è situato tra l’iride e il corpo vitreo.
1.7 Il corpo vitreo
Il corpo vitreo è situato posteriormente al cristallino: è un gel chiaro e trasparente, ad alto grado di idratazione, che contiene il 98% di acqua, lo 0.1% di colloidi e la restante parte è costituita da soluti a basso peso molecolare. È costituito principalmente da collageno e acido ialuronico.
Il corpo vitreo non contiene vasi sanguigni e il suo nutrimento deriva dalle strutture che lo circondano, come la coroide, i corpi ciliari e la retina.
Questo materiale semisolido ha la funzione di conservare una pressione intraoculare sufficiente a prevenire il collasso del globo oculare. Tra le funzioni del corpo vitreo, oltre quella di sostegno, troviamo la funzione diottrica, di assorbimento degli shock, sostegno della forma dell’occhio e della superficie posteriore delle lenti; inoltre, permette la circolazione dei metaboliti e dei nutrienti.
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1.8 Umore acqueo
L’umore acqueo è un liquido trasparente incolore, contenuto all’interno della camera anteriore e in quella posteriore dell’occhio. Esso si estende dalla cornea, attraverso il foro pupillare, fino al cristallino. Ha pH 7.3 ed una pressione osmotica superiore a quella del sangue; contiene alcuni elettroliti in concentrazione maggiore rispetto a quella del sangue, mentre proteine e glucosio sono presenti in concentrazione inferiore.
Ha funzioni nutritive nei confronti del cristallino e della cornea, e presenta funzione diottrica.
1.9 Le vie ottiche
Le vie ottiche sono quell’insieme di strutture, che partendo dalla retina, collegano il bulbo oculare al cervello nella sua porzione occipitale. Rappresentano strutture sensoriali e percettive che permettono la visione delle immagini grazie alla ricezione di un impulso luminoso: quest’impulso viene convertito in impulso elettrico in modo tale da formare la sensazione visiva, con conseguente interpretazione.
Le fibre ottiche retiniche, in corrispondenza della papilla ottica, si raccolgono in fasci per costituire il nervo ottico, fondamentale per la trasmissione delle informazioni visive dalla retina al cervello.
Il nervo ottico rappresenta il II paio di nervi cranici, ed ha un andamento non rettilineo, in quanto presenta un’incurvatura ad S che consente all’occhio di svolgere i propri movimenti di rotazione, impendendone così il suo stiramento.
1.10 L’apparato protettore del bulbo oculare
L’apparato protettore del bulbo oculare è costituito da tutti gli annessi oculari dell’occhio tra cui la congiuntiva, gli organi dell’apparato lacrimale e le vie lacrimali.
La congiuntiva rappresenta una mucosa che riveste la porzione anteriore della sclera (congiuntiva bulbare) e, continuando posteriormente e ripiegandosi in avanti (fornice congiuntivale), riveste anche la superficie interna delle palpebre (congiuntiva palpebrale). L’apparato lacrimale è costituito dalle ghiandole lacrimali e dalle vie lacrimali, mediante le quali, il secreto lacrimale viene drenato nel sacco congiuntivale e versato nelle fosse nasali. Esso ha il compito di facilitare lo scorrimento delle palpebre sul bulbo oculare e può
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presentare una debole azione antibatterica, dovuta alla presenza di lisozima al suo interno.
Il film lacrimale è una pellicola trasparente e sottile, che bagna continuamente l’epitelio corneale e la congiuntiva. Le sue principali funzioni sono quelle di mantenere una superficie regolare per permettere la rifrazione della luce, di lubrificare le palpebre, la congiuntiva e la cornea, di trasportare nutrienti e globuli bianchi alla cornea e alla congiuntiva, di rimuovere materiali estranei e funzione antibatterica.
2 LA TERAPIA OFTALMICA
Le formulazioni destinate a trattare le malattie oculari possono agire sia a livello del segmento anteriore che posteriore dell'occhio. Per il trattamento delle malattie che colpiscono la superficie oculare più esterna ed il segmento anteriore dell’occhio (come ad esempio la congiuntivite, sindrome dell’occhio secco, le cheratiti ecc.)la somministrazione topica rappresenta la via preferenziale. Infatti, i colliri rappresentano oltre il 90% dei medicinali commercializzati ad uso oftalmico (Boddu et al., 2014).
Negli ultimi anni, lo studio dei processi fisiopatologici legati alle malattie che colpiscono il tessuto nervoso retinico, ha portato ad un forte interesse nello sviluppo di nuove formulazioni in grado di rilasciare il farmaco a livello del segmento posteriore dell’occhio. In particolare, la retina risulta essere il sito più colpito, infatti, un danno a questo tessuto può portare allo sviluppo di malattie degenerative come ad esempio le maculopatie, glaucoma,la retinite pigmentosa o le retinopatie diabetiche. In generale, per poter raggiungere il segmento posteriore dell’occhio con una concentrazione terapeutica efficace, il farmaco deve attraversare numerose barriere sia di tipo anatomico che fisiologico legate alla struttura stessa dell’occhio. Pertanto, le principali vie di somministrazione dei farmaci utilizzate per cercare di ottenere un’azione efficace a livello del segmento posteriore dell'occhio risultano attualmente quattro: la via topica, sistemica, intravitreale e perioculare (Figura 2), che vengono qui di seguito argomentate.
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Figura 2. Percorsi di consegna dei farmaci nell'occhio (Mandal et al. 2017.)
La via sistemica: l’ottenimento di concentrazioni terapeutiche dell’attivo a livello della retina è spesso difficile da raggiungere attraverso l’utilizzo di forme farmaceutiche classiche. Infatti, il rilascio di farmaci è limitato principalmente dalla presenza di due barriere: la barriera emato-acquosa e la barriera emato-retinica che ostacolano il passaggio dei farmaci nelle strutture più interne dell'occhio. Di conseguenza sono necessarie dosi elevate di farmaco che portano ad un rischio significativo di effetti avversi, rendendo problematico l’uso di farmaci con un indice terapeutico particolarmente basso. Corticosteroidi, immunosoppressori e antibiotici sono esempi di farmaci che vengono somministrati per via orale, soprattutto per il trattamento di patologie a carico del segmento posteriore dell’occhio. (Battaglia et al., 2016).
L’iniezione intravitreale offre diversi vantaggi in quanto l’attivo viene direttamente iniettato nel corpo vitreo che è a diretto contatto con la retina. Tramite questa via possono essere somministrate varie forme farmaceutiche tra le quali soluzioni acquose anche viscose (preparate con polimeri idrofili) e sospensioni. È noto che i principi attivi a basso peso molecolare (PM) diffondono più rapidamente e quindi richiedono somministrazioni ripetute rispetto a molecole con PM superiori (>500 Da), le quali possono rimanere nel corpo vitreo per diversi giorni o addirittura settimane. Questa via di somministrazione permette quindi di ottenere una concentrazione più alta di farmaco a livello della retina ma allo stesso tempo
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potrebbe portare a diversi effetti collaterali come ad esempio insorgenza di emorragia intraoculare, distaccamento della retina, ipertensione oculare e progressione della cataratta. Ad ogni modo, oltre a rimanere la via di somministrazione preferenziale nel caso del trattamento di malattie in fase acuta, risulta essere una via altrettanto sicura in quanto,ricerche dell’ultimo decennio hanno dimostrato che l’incidenza di reazioni avverse gravi, come ad esempio l’endoftalmite, sono molto rare (SJ Bakri et al., 2014).
L’Iniezione perioculare coinvolge principalmente la regione retrobulbare, peribulbare, subtenoniana, subcongiuntivale ed è meno invasiva di quella intravitreale. Tramite questa via di somministrazione, il farmaco può infatti raggiungere sia il segmento posteriore sfruttando la via transclerale e/o la circolazione sistemica, attraverso la coroide, oppure può raggiungere il segmento anteriore attraverso il film lacrimale, raggiungendo successivamente la cornea, poi l’umor acqueo ed in fine il corpo vitreo (Gaudana et al., 2010). Questo tipo di approccio terapeutico determina, però, una minore biodisponibilità a livello del tessuto retinico. Inoltre, iniezioni frequenti possono portare ad assorbimento non specifico del farmaco con conseguente tossicità sistemica indesiderata, soprattutto nel caso di farmaci aventi un basso indice terapeutico (Peptu et al., 2015).
La via topica sta emergendo negli ultimi anni come via di somministrazione alternativa per il trattamento delle malattie che interessano il segmento posteriore dell’occhio. Per questi tipi di malattie infatti, la somministrazione di farmaci sotto forma di colliri potrebbe portare a numerosi vantaggi come: la possibilità di auto-somministrazione del medicinale, una conseguente riduzione degli effetti collaterali e del dolore associato alla somministrazione del farmaco con conseguente aumento della compliance da parte del paziente. Uno dei problemi principali legati a questa via risulta però essere la bassa biodisponibilità del farmaco a causa della presenza di diverse barriere sia di tipo dinamico che statico, ma anche metabolico che insieme impediscono all’attivo somministrato di raggiungere la retina; per questo motivo, i ricercatori stanno lavorando a nuove strategie per superare la bassa biodisponibilità (Boddu et al., 2014).
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2.1 La Somministrazione Oculare Topica
L'occhio possiede numerosi meccanismi protettivi contro le minacce esterne come polvere, xenobiotici e agenti patogeni. Questi meccanismi di difesa, quali il riflesso di ammiccamento, lacrimazione e turn-over lacrimale, sono estremamente efficienti nell’eliminazione di elementi estranei dalla superficie oculare. Tuttavia portano anche ad una scarsa capacità di penetrazione dei farmaci applicati topicamente (Lallemand et al., 2017). Le ragioni principali che portano ad una bassa biodisponibilità dell’attivo includono: il breve tempo di permanenza del farmaco a livello pre-corneale (circa cinque minuti dall'instillazione negli esseri umani) e le numerose barriere che un farmaco deve attraversare prima di raggiungere i tessuti oculari bersaglio. Queste possono essere sia di tipo anatomico che fisiologico; tra quelle di tipo anatomico troviamo la struttura della cornea e il volume ridotto del sacco congiuntivale nel quale si raccoglie parte del formulato instillato, mentre tra le barriere fisiologiche possiamo menzionare il film lacrimale pre-corneale a cui è legato il sistema di drenaggio lacrimale, la lacrimazione riflessa ed infine il deflusso acquoso all'interno dell'occhio (Awwad et al., 2017). In particolare, il drenaggio della formulazione dall'area pre-corneale risulta essere il fattore principale che influenza la permanenza del farmaco in questa zona. Subito dopo l'instillazione delle gocce oculari abbiamo una forte diminuzione della concentrazione dell’attivo a causa della diluizione lacrimale, del legame farmaco- proteine lacrimali e dalla clearance.
Solitamente, il contagocce fornisce un volume di circa 50-75 µl di formulazione. Se il paziente non sbatte le palpebre, l'occhio può contenere circa 30 µl di formulazione all’interno del sacco congiuntivale che però tende a ridursi fino ad un volume di 7-10 µl facendo sì che la dose somministrata in eccesso venga drenata via ed entri in parte nel circolo sistemico attraverso il dotto naso-lacrimale e la mucosa congiuntivale. Infatti, sia la mucosa congiuntivale che la mucosa nasale sono stati indicati come principali potenziali siti per l'assorbimento sistemico di farmaci applicati topicamente (Cholkar et al., 2012 e Shahwal, 2011). Inoltre, il fenomeno della lacrimazione contribuisce sia alla diluizione del farmaco che al turnover lacrimale (tasso di 0,5-2 μl/min), rimuovendo la soluzione di farmaco dal sacco congiuntivale subito dopo 15-30 secondi dall’instillazione, causando una riduzione significativa del tempo di contatto della formulazione con il tessuto oculare. Infine, anche se il contenuto di proteine (albumina, globuline, lisozima) nel fluido lacrimale è molto basso (circa lo 0,7%), il ricambio continuo produce nuove proteine, la maggior parte delle quali possono legare le molecole di farmaco. Inoltre, un ulteriore ostacolo è
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rappresentato dalla presenza di proteine di trasporto, come la P-glicoproteina (P-gp), che si trovano sulla cornea e la congiuntiva le quali limitano l'assorbimento dei farmaci.
Tutti questi fattori possono influenzare la biodisponibilità dei farmaci applicati topicamente sull’occhio; infatti, la biodisponibilità a livello oculare è stata stimata essere minore del 5% rispetto alla dose instillata (Awwad et al., 2017).
La penetrazione dei farmaci nei tessuti dipende generalmente dal gradiente di concentrazione, dalla lipofilia e dal peso molecolare del farmaco, anche se, nella cornea sono presenti meccanismi di trasporto attivo. Il meccanismo in grado di descrivere correttamente il comportamento del farmaco verso le barriere è la diffusione passiva a seguito della prima legge di Fick:
J = −D dC dx
dove J è la velocità di trasporto attraverso la membrana; D è il coefficiente di diffusione che dipende dalle proprietà fisico-chimiche del farmaco come le dimensioni molecolari; dC/dx è il gradiente di concentrazione, cioè il rapporto tra la differenza di concentrazione ai due lati della barriera e lo spessore della barriera. Un altro parametro che influenza il trasporto del farmaco attraverso il tessuto oculare è il coefficiente di ripartizione (K), che indica l'affinità del farmaco per i compartimenti lipofili o idrofili. L'equilibrio tra le due caratteristiche (lipofile o idrofile) è essenziale per promuovere la permeazione transoculare. K può essere determinato sperimentalmente utilizzando come una miscela di ottanolo (con caratteristiche lipofile) ed acqua (porzione idrofila).
La cornea è una membrana trasparente con funzione di barriera che limita l'assorbimento del farmaco a causa della presenza di giunzioni strette e di una struttura multistrato. L'epitelio corneale, la prima barriera, è costituito da un singolo strato di cellule appiattite di forma poligonale. Tale strato può essere attraversato da due vie: transcellulare (attraverso le cellule) e paracellulare (tra le cellule) (Figura 3). Le molecole lipofile e molecole con processo di trasporto specializzato, preferiscono il percorso transcellulare, mentre le molecole idrofile, prive di processi di trasporto di membrana, preferiscono il percorso paracellulare (Ramsay et al., 2018). La maggior parte dei farmaci predilige la via trans cellulare e riesce a penetrare la cornea tramite un meccanismo di diffusione semplice, diffusione facilitata, trasporto attivo o per endocitosi. Le proprietà fisico-chimiche dei farmaci che vanno ad influenzare la penetrazione del farmaco attraverso la via
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transcellulare, puramente lipofila, sono: la lipofilicità del farmaco,il suo coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua; la sua pKa (costante di dissociazione), ed il peso molecolare. Il trasporto attraverso il percorso paracellulare,è passivo e limitato solo dalle dimensioni degli spazi intercellulari e dalla carica presente. Si tratta di un percorso acquoso che comporta la diffusione del soluto tra cellule epiteliali limitate dalla presenza delle giunzioni strette nota come zonula occludens.
Un'altra barriera dinamica che limita il trasporto del farmaco attraverso la cornea è la presenza di pompe transmembranali. Queste pompe, espresse sulla superficie corneale, costituiscono una barriera significativa nella somministrazione di farmaci oculari limitando l'ingresso di farmaci nei tessuti oculari più profondi (Bennet, 2017).
Figura 3. La cornea. Organizzazione cellulare di vari livelli per la limitazione del trasporto
La sclera, con i suoi 16-17 cm2 di superficie, rappresenta il 95% dell'estensione totale della superficie dell’occhio. Il tessuto, quindi, fornisce una via significativa per la diffusione del farmaco nell'occhio. Risulta essere più permeabile ai soluti rispetto alla cornea, in particolare ai composti idrofili. La somministrazione di farmaci attraverso la sclera dipende dallo spessore del tessuto che il soluto deve passare così come dalla superficie disponibile per la diffusione. La sclera è relativamente vicina al limbo (0.53 mm). La somministrazione transsclerale potrebbe essere migliorata sfruttando le regioni più sottili del tessuto. Infatti, la sclera si assottigliata per poi diventare significativamente più spessa vicino al nervo ottico.
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La permeabilità transssclerale, inoltre, è fortemente influenzata dalla carica della molecola, a differenza della permeazione transcorneale, le molecole cariche positivamente mostrano una scarsa permeabilità a causa del loro avvicinamento alla matrice proteoglicana carica negativamente (Huang, 2017).
3 SISTEMI PER IL RILASCIO OCULARE DI FARMACI
Le forme farmaceutiche più comunemente utilizzate nel campo oftalmico possono essere classificate in base allo stato fisico in:
Liquido: soluzioni e sospensioni; Semisolido: unguenti oftalmici e gel; Solido: inserti oculari e impianti.
3.1 Forme Farmaceutiche Liquide
Le forme farmaceutiche liquide più comunemente utilizzate sono le soluzioni acquose (collirio) e le sospensioni. La soluzione offre alcuni vantaggi come maggior sicurezza da parte del paziente, uniformità del dosaggio ed una semplice riproducibilità, dal momento che sono facili da preparare, filtrare e sterilizzare. Inoltre, grazie al loro semplice metodo di somministrazione, le gocce oculari consentono di eseguire automedicazioni senza provocare alcuna alterazione della vista, oltre ad avere buona compliance da parte del paziente. Tuttavia, le soluzioni portano ad una bassa biodisponibilità del farmaco dovuta a molteplici fattori come il rapido drenaggio del farmaco a livello pre-corneale, la sua perdita attraverso il dotto naso-lacrimale con possibili effetti collaterali causati dall’assorbimento sistemico,ma anche un elevato assorbimento attraverso la congiuntiva. Le gocce oculari sono comunemente costituite da un farmaco solubilizzato in un mezzo acquoso contenente tamponi, agenti isotonici e conservanti.
Quando il farmaco non è sufficientemente solubile in un veicolo idrofilo, potrebbe essere formulata una sospensione. Le sospensioni, sebbene non siano così comuni come le soluzioni, trovano largo impiego sia per il trattamento di malattie a lungo termine, come ad esempio il glaucoma, ma più comunemente sono utilizzate per il trattamento di malattie a breve termine, come infezioni e infiammazioni. Infatti,la maggior parte degli agenti antinfiammatori steroidei (come prednisolone acetato, desametasone) sono formulati
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come sospensioni oftalmiche (Le Merdy et al. 2020). Il fattore critico di questo tipo di formulazioni è la dimensione delle particelle. Infatti, particelle micronizzate con dimensioni <10 µm sono accettate per le preparazioni oftalmiche, poiché non causano irritazione oculare oltre a garantire una maggiore uniformità della preparazione. Tuttavia, ci sono molte limitazioni legate sia alla preparazione che alla stabilità di una sospensione. Infatti, per garantire un corretto dosaggio e ottenere un aumento della biodisponibilità del farmaco, è necessario che la preparazione sia adeguatamente agitata prima dell'uso. Inoltre, in termini di costi di produzione, le sospensioni sono più costose delle gocce oculari.
Un altro metodo utilizzato per migliorare il tempo di residenza della formulazione nell’area precorneale, e di conseguenza migliorare l’assorbimento transcorneale dei farmaci consiste nell’aumentare la viscosità delle formulazioni oftalmiche per addizione di materiali polimerici in concentrazioni opportune in base al target (Simta et al. 2020).
I polimeri idrofili più comunemente utilizzati in campo oculare sono l'alcol polivinilico (PVA), il polivinil-pirrrolidone (PVP), derivati della cellulosa come idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), la metilcellulosa (MC) e gli acidi poliacrilici (Carbopol®) che sono in grado di formare, in situ, gel a pH fisiologico (Shahwal et al., 2011).
Esistono vari esempi sul mercato di colliri contenenti modificatori reologici come Fluaton®, contenente PVA, Flarex® contenente HEC, Flumetol® contenente una miscela di PVA e HPMC, Retaine® gocce oculari lubrificanti HPTM contenenti HPMC.
Esiste una relazione diretta tra viscosità e biodisponibilità fino ad un determinato margine, dopo di che un ulteriore aumento della viscosità produce solo un leggero, o nessun, aumento dell'effetto terapeutico. Numerosi lavori di ricerca hanno evidenziato che un limite di viscosità compreso tra 20 a 50 cP tale da garantire una ridotta interferenza con la visione e una permanenza ottimale nell'area precorneale, riducendo la velocità di drenaggio con aumento della biodisponibilità del farmaco (Račić et al., 2019).
Merdy et al. (2019) hanno valutato l’influenza della viscosità di due prodotti commerciali a base di desametasone (con farmacocinetica simile) sul tempo di resistenza nell’ area pre- corneale. Le formulazioni prese in esame sono state: TOBRADEX ST ® ad alta viscosità e una bassa concentrazione di DEX(sospensione oftalmica tobramicina / desametasone 0,3% / 0,05%, 72,9 cP) e TOBRADEX ® a bassa viscosità e alto contenuto di DEX (sospensione oftalmica tobramicina / desametasone 0,3% / 0,1%, 1,67 cP). I test hanno dimostrato che sulla base dei test effettuati, è stato trovato che quando la viscosità della è superiore a 40 cP, l'impatto della viscosità sul tempo di residenza pre-corneale raggiunge
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la massima capacità del sistema fisiologico e quindi un ulteriore aumento della viscosità non migliorerebbe la biodisponibilità del farmaco oculare. Al contrario, quando la viscosità è inferiore a 40 cP, la biodisponibilità del farmaco si riduce rapidamente.
Oltre ad un effetto addensante, molti polimeri possiedono proprietà mucoadesive, cioè la capacità di stabilire legami (non di tipo covalente) con gli strati di mucina che ricoprono l'epitelio corneale-congiuntivale, garantendo alle forme farmaceutiche oftalmiche tempi più lunghi di contatto con i tessuti. I requisiti che un polimero deve soddisfare per un’attività mucoadesiva efficiente sono: contenere gruppi idrofili, avere una forte carica anionica, un alto peso molecolare e sufficiente flessibilità delle catene polimeriche. La combinazione della capacità mucoadesiva con un effetto viscosizzante può portare ad un un'attività ottimale (Račić et al., 2019).
3.2 Forme Farmaceutiche Semisolide
L'aggiunta di agenti addensanti (polimeri naturali, semisintetici o sintetici) ad un mezzo acquoso può portare alla formazione di un gel o al miglioramento della viscosità di una dispersione, la quale aumenta o diminuisce in modo proporzionale rispetto alla concentrazione del polimero. In questo modo, è possibile ridurre l’effetto drenante dato dal turnover lacrimale ed ottenere un aumento del tempo di residenza della formulazione nell'area precorneale con conseguente aumento della penetrazione del farmaco a livello intraoculare ed una migliore attività terapeutica. I polimeri più utilizzati sono l'alcool polivinilico (PVA), il polivinilpirrolidone (PVP) e i derivati della cellulosa come l’idrossipropilmetilcellulosa (HMPC), e l'acido poliacrilico (Rawat et al., 2020). Soluzioni troppo viscose devono essere evitate perché possono causare irritazione e quindi una rapida eliminazione del farmaco dalla superficie oculare oltre a dare offuscamento della vista.
Gli unguenti sono fatti da composti semisolidi o solidi, a base di oli di vaselina e oli vegetali, aventi un punto di fusione vicino alla temperatura corporea umana. Infatti, dopo aver applicato l'unguento sulla superficie dell’occhio, si formano lentamente delle piccole gocce che rimangono più a lungo nel sacco congiuntivale. Anche se queste formulazioni sono ben tollerate e sicure, non vengono utilizzate frequentemente perché possono offuscare la vista; per questo motivo, sono preferibilmente utilizzati nella terapia notturna e occlusiva (Baranowski et al., 2014).
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3.3 Forme Farmaceutiche Solide
Gli inserti oculari sono definiti come dispositivi sterili, sottili, multistrato, carichi di farmaci, solidi o semisolidi da inserire nel sacco congiuntivale o nella struttura interna dell'occhio durante l'intervento chirurgico (impianti). L'obiettivo principale di questa forma di dosaggio è quello di aumentare il tempo di contatto tra la formulazione e le strutture oculari, garantendo un rilascio di farmaco sostenuto. Gli inserti hanno numerosi vantaggi come ad esempio una minore suscettibilità ai meccanismi di difesa naturali dell’occhio come il deflusso attraverso il condotto nasolacrimale limitando l'assorbimento sistemico; assicurano anche un dosaggio accurato, la possibilità di un rilascio lento con velocità costante, un’attività farmacologica prolungata ed una maggiore biodisponibilità. Lo svantaggio principale degli inserti oculari è la loro scarsa compliance del paziente, spesso causata dalla sensazione di corpo estraneo nell'occhio.
Gli inserti sono generalmente composti da supporto polimerico monolitico che contiene il farmaco. I materiali polimerici includono la metilcellulosa e i suoi derivati come l’idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), l'etilcellulosa, il polivinilpirrolidone (PVP), l'alcool polivinile, il chitosano e i suoi derivati, come carbossimetilchitosano, gelatina.
A seconda del tipo di materiale polimerico utilizzato per preparare gli inserti, possono essere classificati in tre classi principali: inserti insolubili (ad esempio, Ocusert®), inserti solubili (Lacrisert®) e inserti biodegradabili (Beena et al., 2019).
4 NUOVI SISTEMI DI DRUG DELIVERY
Negli ultimi decenni, sono stati utilizzati nuovi approcci nella ricerca per il trattamento delle malattie oculari. In particolare, la nanoscienza e la nanotecnologia stanno svolgendo un ruolo significativo nello sviluppo di nuove formulazioni che siano a rilascio controllato, ma anche garantendo una bassa irritazione oculare, migliorando la biodisponibilità dei farmaci, aumentando la solubilità del farmaco in acqua e migliorando la compatibilità dei tessuti.
Sono stati sviluppati diversi tipi di nanocarrier (Figura 4), alcuni dei quali hanno mostrato risultati promettenti per la somministrazione di farmaci sia nel segmento anteriore che posteriore dell'occhio.
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Figura 4. Diversi sistemi di somministrazione oculare basati sulla nanotecnologia
Le nanoparticelle sono carrier colloidali che possono essere composti da lipidi, proteine, polimeri naturali o sintetici. Possono essere suddivisi in: nanosfere, dove il farmaco è distribuito nella matrice polimerica, e nanocapsule dove il farmaco è incapsulato in un guscio polimerico. I vantaggi di questi nanocarrier sono le loro piccole dimensioni che favoriscono una maggiore area di dissoluzione e una maggiore capacità di penetrazione nelle strutture oculari, oltre ad abbassare l’insorgenza di fenomeni di irritazione a livello della superficie oculare. Tuttavia, questi sistemi hanno limitazioni sia legate alla bassa capacità di carico che alla rapida eliminazione, per questo motivo sono associate a polimeri mucoadesivi per migliorare il tempo di residenza precorneale.
I liposomi sono sistemi vescicolari che comprendono un nucleo interno acquoso e uno strato esterno costituito da strati fosfolipidici di origine naturale o sintetica. Di solito sono fatti da fosfatidilcolina, stearilammina, e varie quantità di colesterolo o lecitina e L-dipalmitoilfosfatidilcolina. La dimensione varia a seconda del tipo di liposoma. Infatti, sono classificati come piccole vescicole unilamellari (10-100 nm), grandi vescicole unilamellari (100-300 nm) e vescicole multilamellari, contenenti più strati di fosfolipidi. Per le applicazioni oftalmiche, i liposomi rappresentano un sistema di rilascio promettente sia per la loro eccellente biocompatibilità che è data dalla loro somiglianza con la struttura della membrana cellulare, che per la loro versatilità vista la capacità di incapsulare sia farmaci di natura idrofila che lipofila. Tuttavia, presentano problemi di stabilità rispetto ai sistemi di natura polimerica e la loro produzione risulta più costosa e più complessa dal punto di vista tecnologico.
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I dendrimeri sono sistemi polimerici ramificati a forma di stella con dimensioni comprese tra 2 e 20 nm. La struttura polimerica può creare legami elettrostatici o covalenti con il farmaco che si lega alla superficie grazie alla presenza di gruppi funzionali come ad esempio quello carbossilico, idrossilico e amminico. Durante il processo di sintesi, le dimensioni e la forma dei dendrimeri possono essere controllate, quindi la macromolecola finale avrà una specifica "architettura" e gruppi terminali specifici. La loro struttura altamente ramificata può consentire il legame di più attivi contemporaneamente oltre a favorire un carico di farmaco maggiore rispetto ai tipici polimeri lineari; inoltre, si presentano in forma sferica e mostrano una buona capacità di penetrare le membrane cellulari, caratteristiche che li rende un sistema carrier ideale per il rilascio di farmaci.
Le nanomicelle sono un tipo di carrier innovativo costituito da tensioattivi, ovvero molecole anfifiliche che vengono sfruttate per favorire la solubilizzazione di farmaci altrimenti insolubili in acqua al fine di ottenere una soluzione limpida; questi nano-sistemi sono generalmente caratterizzati da una elevata biodisponibilità per il delivery di farmaci destinati ad agire sui tessuti oculari.
Le lenti a contatto sono dischi sottili a forma curva, progettati per coprire la cornea. A causa della tensione superficiale, dopo l'applicazione, aderiscono al film di strato corneale che porta ad un tempo di residenza più alto rispetto alle semplici soluzioni di gocce oculari e migliora il flusso di farmaco attraverso la cornea con meno afflusso di principio attivo nel condotto nasolacrimale. Il farmaco può essere caricato in lenti a contatto in diversi modi: immergendo le lenti in soluzioni farmacologiche (metodo di ammollo) o aggiungendo le molecole di farmaco prima della polimerizzazione da parte delle unità polimeriche in modo che i monomeri si organizzino in funzione alla loro capacità di interagire con le molecole di farmaco (impronta molecolare).
Nanoparticelle, microparticelle e liposomi possono anche essere caricati su matrice di lenti a contatto per fornire il farmaco all'occhio (Patel et al., 2013; Weng et al., 2016; Maulvi et al., 2016).
5 NANOMICELLE
Le nanomicelle sono utilizzate principalmente per preparare soluzioni acquose di farmaci insolubili in acqua. Si tratta di sistemi formati da uno o più sostanze di natura anfifilica
(tensioattivi o polimeri) con proprietà
sistemi termodinamici più stabili, chiamati micelle. Le sostanze anfifiliche che le compongono tendono a formare quindi un
idrofilo a contatto diretto con il solvente acquoso; diretto del nucleo (contenente il
tensione superficiale del sistema.
alla loro natura anfifilica, infatti possono avere anche miglior contatto ed interazione
ridotte (dai 10 ai 100 nm),
tessuti. Inoltre, essendo solubili in acqua, queste micelle polimeriche
soluzioni acquose limpide, permettendo una facile applicazione sotto forma di colliri senza alcuna interferenza visiva (Mandalet al. 2017).
quando viene raggiunta la
concentrazione alla quale l’interfaccia diventa satura di monomeri di tensioattivo; infatti, un aumento della concentrazione di
formazione di micelle in soluzione micella avviene attraverso la formazi Waals e grazie alla formazione
Figura 5. Formazione di micelle sferiche con incapsulamento del farmaco
Le nanomicelle sono un eccellente sistema di
piccole dimensioni trovano una buona applicabilità a livello proprietà aumentala capacità di
limitando o annullando fenomeni di attraversare il tessuto corneale
dopo l'applicazione topica. La via transclerale permette 19
sioattivi o polimeri) con proprietà auto assemblanti in acqua, in grado di fo
più stabili, chiamati micelle. Le sostanze anfifiliche che le a formare quindi un nucleo idrofobico circondato da un guscio a contatto diretto con il solvente acquoso; in questo modo, viene
del nucleo (contenente il farmaco idrofobico)con l'acqua andando a ridurre tensione superficiale del sistema. Presentano diversi vantaggi rispetto ad altri si
infatti possono avere anche attività mucoadesiva permette ed interazione con la superficie oculare e, grazie
possono consentire una miglior penetrazione attraverso i , essendo solubili in acqua, queste micelle polimeriche
soluzioni acquose limpide, permettendo una facile applicazione sotto forma di colliri senza alcuna interferenza visiva (Mandalet al. 2017). Il fenomeno di micellarizzazione
quando viene raggiunta la concentrazione micellare critica
alla quale l’interfaccia diventa satura di monomeri di tensioattivo; infatti, un oncentrazione di polimeri/tensioattivi al di sopra di questa
in soluzione. L'incapsulamento del farmaco lipofilo la formazione di interazioni di tipo idrofobico, forze
zione di legami ad idrogeno (Figura 5, Mahmoodi et al., 2017)
Formazione di micelle sferiche con incapsulamento del farmaco
Le nanomicelle sono un eccellente sistema di trasporto dei farmaci trovano una buona applicabilità a livello ocular
capacità di penetrazione del farmaco attraverso
fenomeni di irritazione oculare. Le nanomicelle possono versare il tessuto corneale oppure possono sfruttare il percorso congiuntiva
La via transclerale permette infatti la diffusione
in grado di formare più stabili, chiamati micelle. Le sostanze anfifiliche che le circondato da un guscio viene evitato il contatto andando a ridurre la diversi vantaggi rispetto ad altri sistemi oltre attività mucoadesiva permettendo un alle loro dimensioni etrazione attraverso i , essendo solubili in acqua, queste micelle polimeriche possono generare soluzioni acquose limpide, permettendo una facile applicazione sotto forma di colliri senza nomeno di micellarizzazione si ottiene critica (CMC), ovvero la alla quale l’interfaccia diventa satura di monomeri di tensioattivo; infatti, un al di sopra di questa, porta alla farmaco lipofilo all’interno della co, forze di Van der Mahmoodi et al., 2017).
Formazione di micelle sferiche con incapsulamento del farmaco
farmaci e grazie alle loro oculare. Infatti, questa attraverso i tessuti oculari e nanomicelle possono uttare il percorso congiuntivale-sclerale fusione laterale delle
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micelle,che trasportano il farmaco,fino a raggiungere il segmento posteriore dell'occhio; inoltre, grazie alla loro porzione esterna idrofila possono ulteriormente usufruire per il trasporto del farmaco dei canali acquosi presenti a questo livello (Figura6). Successivamente, dal segmento posteriore, le micelle possono essere ulteriormente incorporate dalle cellule RPE (epitelio pigmentato retinico) per endocitosi e rilasciare il farmaco per esplicare la sua attività terapeutica nei tessuti oculari segmento posteriore dell’occhio. Tale assorbimento, sia da parte dei tessuti che da parte delle cellule, dipende dunque dalle dimensioni delle micelle ma anche dalla loro tensione superficiale (Mandal et al., 2017).
Figura 6. Rappresentazione schematica delle nanomicelle che raggiungono la camera posteriore dell'occhio attraverso la via transclerale dopo applicazione topica della formulazione
Le nanomicelle sono solitamente classificate in micelle polimeriche, tensioattive e poliioniche (PIC); la scelta della tipologia del carrier avviene sulla base delle proprietà fisico-chimiche del farmaco, interazioni tra farmaco e tensioattivo/farmaco e polimero, sito d’ azione, target del farmaco, biocompatibilità e la stabilità fisica.
5.1
Metodi di preparazione delle nanomicelle
I metodi più comunemente utilizzati per preparare le nanomicelle sono la solubilizzazione diretta, l'evaporazione del solvente, l'idratazione del film e il metodo di dialisi (Figura 7).
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La solubilizzazione diretta è la tecnica più semplice per la preparazione delle micelle cariche di farmaco, a partire dai copolimeri con solubilità nell'acqua relativamente alta. Questo metodo consiste nel solubilizzare il farmaco direttamente nell'acqua deionizzata o nel tampone. Tuttavia, questo metodo è associato ad una bassa capacità di carico di farmaco che può essere migliorata aumentando la temperatura del sistema prima dell'aggiunta del copolimero o per sonicazione.
Il metodo della dialisi è spesso impiegato quando si utilizzano polimeri anfifilici con bassa solubilità in acqua e anche per farmaci solubili in solventi organici. In primo luogo, il farmaco insieme al copolimero vengono solubilizzati in un solvente organico, come di metilsulfossido (DMSO),N,N-dimetilformammide (DMF), acetonitrile (ACN), tetraidrofurano (THF), acetone o dimetilacetammide, e la soluzione finale viene poi dializzata con acqua. In particolare, durante il processo di dialisi, il solvente organico viene sostituito da acqua che induce l'autoassociazione dei copolimeri e il conseguente intrappolamento del farmaco. La membrana semipermeabile fa sì chele micelle polimeriche contenenti il farmaco rimangano all'interno del sacchetto, mentre quello non incapsulato rimarrà al suo esterno. Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato solo per la produzione su scala di laboratorio (Mandal et al.,2017).
Emulsione olio in acqua consiste nella dissoluzione del farmaco in un solvente organico (fase organica) che viene aggiunto alla fase acquosa sotto agitazione vigorosa. Il polimero può essere disciolto nella fase organica o acquosa a seconda della sua natura (idrofila o lipofila) e il solvente organico viene rimosso successivamente per evaporazione (Mandal et al.,2017).
Evaporazione del solvente consiste nella dissoluzione del farmaco e del copolimero in uno stesso solvente organico o in una miscela di due solventi miscibili,i quali devono essere volatili. Dopo aver mescolato ed essiccato il solvente organico viene a formarsi un film sottile di farmaco e polimero. Questo film viene poi formato nuovamente per idratazione con acqua calda di una soluzione tampone per ottenere la dispersione nanomicellare. Per evitare la separazione di fase durante il processo di evaporazione, deve essere selezionato un solvente, in cui sia il farmaco che il copolimero sono solubili. Questo metodo può essere applicato per i polimeri che hanno valori di equilibrio
lipofilo-22
idrofilo elevato (HLB) in modo che il film polimerico possa essere facilmente ricostituito in un mezzo acquoso (Mandal et al.,2017).
La liofilizzazione è applicabile a solventi organici, come il ter- butanolo, che possono sciogliere il polimero e il farmaco. La soluzione farmaco/polimero viene quindi mescolata con acqua e liofilizzata. La miscela liofilizzata può essere ricostituita per ottenere nanomicelle cariche di farmaco. Inoltre, il metodo di preparazione delle nanomicelle può influenzare notevolmente le proprietà fisiche del prodotto finale e l'efficienza di incapsulamento dei farmaci, mentre le dimensioni e l'indice di polidispersività dipendono dalla natura della fase organica, dall'ordine di aggiunta di solventi e dalla concentrazione del copolimero nel solvente organico (Cholkar et al., 2014; Mandal et al.,2017).
Figura 7. Metodi di preparazione nanomicelle: (1) dissoluzione semplice (2) dialisi (3) emulsione olio in acqua (4) evaporazione del solvente (5) liofilizzazione
5.2 Nanomicelle contenenti farmaci lipofili per applicazione topica
oculare
Molti ricercatori hanno studiato l'uso delle nanomicelle per la somministrazione di farmaci lipofili sia nella camera anteriore dell'occhio che in quella posteriore per la loro capacità stabilizzante e solubilizzante, sequestrando il farmaco nel core lipofilo costituito dalle code non polari dei tensioattivi ed interagendo con l’ambiente idrofilo attraverso un guscio esterno costituito dalle teste polari. Alcuni studi hanno evidenziato il ruolo delle nanomicelle nel migliorare la penetrazione di farmaci attraverso la cornea dopo instillazione nell’area precorneale, aumentando la biodisponibilità. In letteratura sono
23
presenti numerosi studi che coinvolgono la messa a punto di formulazioni nanomicellari contenenti farmaci con caratteristiche chimico fisiche differenti.
Alvarez- Rivera et al (2016) hanno sviluppato formulazioni nanomicellari contenenti acido α-lipoico (ALA), un potente antiossidante per la prevenzione e il trattamento delle cheratopatia diabetica e retinopatia con lo scopo di migliorare la solubilità, la stabilità e la permeabilità della cornea dell’ALA. Sono state preparate nanomicelle utilizzando come tensioattivo Soluplus® (polivinil caprolattame-polivinil acetato-polietilenglicol) confrontandole con nanomicelle a base di un tensioattivo più tradizionale (sodio diottilsolfosuccinato). Gli autori hanno dimostrato come il Soluplus portasse alla formazione di micelle più piccole (70-80nm)rispetto a quelle ottenute con sodio diottilsolfosuccinato (240-528 nm) con una miglior capacità di solubilizzazione del principio attivo, pur mantenendo una buona compatibilità oculare.
Il Soluplus è stato utilizzato anche da Varela- Garcia (et al 2018) nella messa a punto di nanomicelle a base di aciclovir, noto per avere una bassa solubilità in acqua ed una scarsa capacità di permeare la cornea. Le caratteristiche chimico fisiche e biologiche delle nanomicelle costituite da Soluplus sono state confrontate con quelle ottenute utilizzando il tensioattivo polyoxil15- hydroxystearate (HS-15). Le dispersioni nanomicellari sono state preparate in acqua e PBS(pH 7.4) e caratterizzate per dimensioni e potenziale Z. Le micelle di a base di HS-15 tendevano ad aumentare le proprie dimensioni quando il farmaco veniva incorporato passando da 19 nm senza farmaco a 135nm con farmaco. Nel caso del Soluplus, le micelle si mantenevano della dimensione di circa 137 nm. Queste ultime avevano inoltre dimostrato una ottima capacità solubilizzante del farmaco ed inoltre avevo risposto positivamente ai test di stabilità in seguito a diluizione. Il progressivo aumento di viscosità all’aumentare della temperatura delle nanomicelle contenenti Soluplus può essere un ulteriore vantaggio nell’aumentare il tempo di permanenza della formulazione nell’area precorneale. Gli studi di permeazione/penetrazione transcorneale e transclerale hanno dimostrato che in termini di permeazione la formulazione nanomicellare non ha dato risultati molto diversi rispetto a quando il farmaco è somministrato in una formulazione tradizionale, ma la quantità di aciclovir accumulati sia nella cornea che nella sclera è risultata decisamente migliore.
Negli ultimi anni numerosi studi sono stati effettuati per la messa a punto di formulazioni nanomicellari per la veicolazione oculare di ciclosporina. Nel 2018 la FDA ha approvato un prodotto commerciale contenente lo 0.09% di ciclosporina basato sulla tecnologia della micellizzazione brevettato con il nome di Cequa® (SunPharmaceuticalInd., Cranbury, NJ,
USA), sfruttando la capacità di tensioattivi non ionici di formare nanomicelle al di sopra della concentrazione micellare critica, agevolando la solubilizzazione del farmaco in ambiente acquoso. Il prodotto si presenta come dispersione colloidale trasparente, caratteristica peculiare di formulazioni somministrate a livello oculare.
L’uso di sistemi nanostrutturati per la veicolazione della ciclosporina è molto interessante ed i ricercatori stanno cercando di sfruttare questa tecnologia per aumentare la biodisponibilità oculare di farmaci con elevato peso molecolare e / o caratteristiche lipofile Terreni et al (2020) hanno messo a punto una formulazione contenente nanomicelle polimeriche mucoadesive (ASMP
A. La strategia combinata basata sull'associazione di nanomicelle e polimero mucoadesivo è risultata vantaggiosa sia per l’ottenimento di una dispersione limpida contenente lo 0.1% di farmaco solubilizzato che per il prolungamento del tempo di residenza della formulazione nell’area precorneale in relazione alla presenza dell’acido ialuronico
polimero mucoadesivo.
6 LIPOSOMI
I liposomi sono piccole vescicole artificiali di forma sferica costituite principalmente da fosfolipidi, molecole anfipatiche dotate di una testa idrofila e di una coda lipofila.
I fosfolipidi in soluzione acquosa si dispongono spontaneamente in doppi strati detti bilayer in cui le teste polari si allineano per formare una superficie che attrae l’acqua mentre le code lipofile si fronteggiano per formare una zona priva di acqua. So
riscaldamento i doppi strati di fosfolipidi vanno a costituire sistemi vescicolari chiusi in cui i gruppi idrofili (le teste polari) sono rivolti
interno e le code idrofobiche si dispongono invece verso l’interno del bilayer.
Questa struttura ci permette di comprendere la capacità dei liposomi di incapsulare e veicolare sia molecole idrofile che idrofobe
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USA), sfruttando la capacità di tensioattivi non ionici di formare nanomicelle al di sopra della concentrazione micellare critica, agevolando la solubilizzazione del farmaco in ambiente acquoso. Il prodotto si presenta come dispersione colloidale trasparente, caratteristica peculiare di formulazioni somministrate a livello oculare.
temi nanostrutturati per la veicolazione della ciclosporina è molto interessante ed i ricercatori stanno cercando di sfruttare questa tecnologia per aumentare la biodisponibilità oculare di farmaci con elevato peso molecolare e / o caratteristiche lipofile
hanno messo a punto una formulazione contenente nanomicelle polimeriche mucoadesive (ASMP-nano) per la somministrazione oculare di ciclosporina A. La strategia combinata basata sull'associazione di nanomicelle e polimero mucoadesivo è risultata vantaggiosa sia per l’ottenimento di una dispersione limpida contenente lo 0.1% di farmaco solubilizzato che per il prolungamento del tempo di residenza della formulazione nell’area precorneale in relazione alla presenza dell’acido ialuronico
I liposomi sono piccole vescicole artificiali di forma sferica costituite principalmente da fosfolipidi, molecole anfipatiche dotate di una testa idrofila e di una coda lipofila.
I fosfolipidi in soluzione acquosa si dispongono spontaneamente in doppi strati detti bilayer in cui le teste polari si allineano per formare una superficie che attrae l’acqua mentre le code lipofile si fronteggiano per formare una zona priva di acqua. So
riscaldamento i doppi strati di fosfolipidi vanno a costituire sistemi vescicolari chiusi in cui i gruppi idrofili (le teste polari) sono rivolti sia verso l’ambiente acquoso esterno sia quello interno e le code idrofobiche si dispongono invece verso l’interno del bilayer.
Questa struttura ci permette di comprendere la capacità dei liposomi di incapsulare e veicolare sia molecole idrofile che idrofobe (Figura 8).
Figura 8.
USA), sfruttando la capacità di tensioattivi non ionici di formare nanomicelle al di sopra della concentrazione micellare critica, agevolando la solubilizzazione del farmaco in ambiente acquoso. Il prodotto si presenta come dispersione colloidale trasparente,
temi nanostrutturati per la veicolazione della ciclosporina è molto interessante ed i ricercatori stanno cercando di sfruttare questa tecnologia per aumentare la biodisponibilità oculare di farmaci con elevato peso molecolare e / o caratteristiche lipofile. hanno messo a punto una formulazione contenente nanomicelle nano) per la somministrazione oculare di ciclosporina- A. La strategia combinata basata sull'associazione di nanomicelle e polimero mucoadesivo è risultata vantaggiosa sia per l’ottenimento di una dispersione limpida contenente lo 0.1% di farmaco solubilizzato che per il prolungamento del tempo di residenza della formulazione nell’area precorneale in relazione alla presenza dell’acido ialuronico come
I liposomi sono piccole vescicole artificiali di forma sferica costituite principalmente da fosfolipidi, molecole anfipatiche dotate di una testa idrofila e di una coda lipofila.
I fosfolipidi in soluzione acquosa si dispongono spontaneamente in doppi strati detti bilayer in cui le teste polari si allineano per formare una superficie che attrae l’acqua mentre le code lipofile si fronteggiano per formare una zona priva di acqua. Sotto agitazione o per riscaldamento i doppi strati di fosfolipidi vanno a costituire sistemi vescicolari chiusi in cui i l’ambiente acquoso esterno sia quello interno e le code idrofobiche si dispongono invece verso l’interno del bilayer.
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6.1 Metodi di preparazione dei liposomi
Esistono numerosi metodi di preparazione delle vescicole liposomiali, dai quali dipendono sia il tipo che le dimensioni dei liposomi ottenuti. È possibile però, identificare tre fasi generali comuni:
1. Preparazione delle vescicole liposomiali 2. Dimensionamento
3. Purificazione
6.1.1 Fase di preparazione delle vescicole liposomiali
I metodi di preparazione si possono suddividere in:
Metodi meccanici. Uno dei metodi più semplici è il metodo di idratazione a film sottile. Tale metodo prevede la preparazione di una soluzione organica solubilizzando in essa i componenti lipidici. Il solvente organico maggiormente utilizzato è il cloroformio o una miscela di cloroformio e metanolo. Per l’evaporazione del solvente organico si utilizza un evaporatore rotante mantenendolo sotto vuoto, consentendo così la formazione di un film lipidico sottile sulle pareti del recipiente.
Il film lipidico viene idratato con acqua o con tampone. L’idratazione, effettuata mantenendo in rotazione l’evaporatore rotante, provoca la separazione dei doppi strati lipidici presenti nel film i quali, curvandosi opportunamente formano strutture vescicolari chiuse: i liposomi. Il processo di idratazione del film lipidico può essere condotto a temperatura ambiente o ad una temperatura superiore alla temperatura di transizione. del
lipide utilizzato. Spesso, al fine di favorire il completo distacco del film dal pallone, si aggiungono delle sferette di vetro che aumentano la superficie di contatto tra i lipidi e la soluzione.
Il farmaco da incapsulare all’interno del liposoma può essere aggiunto alla fase acquosa o alla fase organica, a seconda delle caratteristiche fisico-chimiche del farmaco (Godbole e Mathur, 2018).
Metodi basati sulla sostituzione di solventi organici con mezzi acquosi. Il processo di evaporazione inversa (REV) si basa sulla formazione di gocce d’acqua circondate da lipidi e disperse in un solvente organico. La tecnica viene eseguita sciogliendo i lipidi in un solvente organico, aggiungendo un piccolo volume di fase acquosa, quindi sonicando la soluzione vengono prodotte micelle invertite. Il solvente organico viene rimosso usando un
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evaporatore rotante con formazione di un gel viscoso. Quando il solvente è stato sufficientemente rimosso, il gel collassa e si forma una sospensione acquosa di vescicole.
Metodi basati sulla rimozione di detergenti:Il metodo si basa sulla formazione di micelle detergente-lipide, seguita dalla rimozione del detergente per formare liposomi. Micelle detergente-lipide possono essere formate idratando un lipide con una soluzione detergente o asciugando sia lipidi che detergente da una soluzione organica, quindi aggiungendo una soluzione acquosa. Il detergente si associa al lipide, proteggendo le porzioni idrofobe dall'interazione con la fase acquosa, e quindi si formano micelle anziché vescicole. Il detergente viene rimosso dalla soluzione micellare, mediante diluizione da 10 a 100 volte, dialisi, cromatografia su colonna o adsorbimento, per formare le vescicole.
6.1.2 Fase di dimensionamento
I metodi di produzione delle vescicole liposomiali devono consentire la produzione di sospensioni liposomiali di dimensioni adatte al fine della somministrazione farmacologica, caratterizzate da una distribuzione dimensionale riproducibile ed omogenea.
La dimensione e l’omogeneità sono caratteristiche molto importanti che influenzano la stabilità, l’incapsulamento, l’efficienza, il profilo di rilascio del farmaco e l’assorbimento cellulare dei carrier lipidici (Danaei et al., 2018).
Le tecniche più utilizzate sono:
Applicazione di ultrasuoni: gli ultrasuoni possono essere applicati tramite sonda ad ultrasuoni o sonicatori a bagno. A causa della minore energia che sono in grado di fornire al campione, non sono in grado di ottenere liposomi di piccole dimensioni (Sharma et al., 2018).
Omogeneizzazione: la sospensione liposomiale viene pompata ripetutamente ad alta pressione attraverso un piccolo orifizio o camera di reazione fino ad ottenere la dimensione media desiderata delle particelle liposomiali(Ahmed et al., 2018).
Estrusione: la sospensione liposomiale viene estrusa attraverso filtri di membrana di policarbonato con pori di diametro ben definito applicando una pressione di 5-7 atm. Il processo di estrusione viene condotto ad una temperatura superiore alla Tc del fosfolipide. Questa procedura ha dei vantaggi rispetto ai metodi di omogeneizzazione e sonicazione in quanto sono disponibili gamme di filtri di membrana con una varietà di dimensioni dei pori, e inoltre, permette di ottenere un
