Per la determinazione dei flavonoidi i metodi analitici più comunemente usati sono: HPLC (High performance liquid chromatography), la Gas cromatografia e la CE (elettroforesi capillare).
La metodica in cromatografia liquida (HPLC, CE) risulta essere una delle più efficaci per la separazione e l'identificazione della rutina e della quercetina, come singoli composti o insieme ai principali flavonoidi (Molnàr-Perl et al, 2005; Rijke et al, 2006).
Infatti la determinazione di questi composti è stata effettuata in diverse matrici, come: nel vino (Kumar et al, 2009; Malovanà et al., 2001), nel miele (Pyrzynska et al., 2009; Michalkiewicz et al., 2008), nei succhi di frutta (Merken et al., 2000; Chen H. et al., 2001), nella frutta fresca (Schieber et al., 2001; Sultana B. et al., 2008), nelle verdure (Wach et al., 2007) e nelle piante (Biesaga et al, 2009; Williams et al., 2006; Adam M. et al., 2009); per la loro determinazione quantitativa ma anche in ricerche finalizzate a studi di correlazione tra contenuto di flavonoidi in diverse specie di piante e nei relativi prodotti trasformati.
La strumentazione HPLC si compone da un sistema formato da una pompa, una colonna cromatografica e un rivelatore. Generalmente le colonne cromatografiche più utilizzate per la determinazione di questi flavonoidi presentano uno stato stazionario a fase inversa con particelle sferiche di diametro 4-5 micron, e a volte anche inferiori ai 2 micron (Spacil et al, 2008).
Tra i diversi tipi di colonne, le monolitiche offrono notevoli vantaggi idrodinamici, aumentando la velocità di flusso dell'eluente, diminuendo il tempo per il lavaggio e per raggiungere l'equilibrio e riducendo il rapporto segnale/rumore. Castellari et al. (2002) hanno separato 17 composti fenolici, nei quali è inclusa la quercetina, con una colonna monolitica C18 in un tempo di 35 minuti (Castellari et al., 2002).
Normalmente, per queste fasi stazionarie, sono stati utilizzati eluenti binari come acetonitrile-acqua o acqua-metanolo con diverse percentuali di componente organica.
Affinchè i flavonoidi con bassi valori di pKa conservino la forma indissociata nella fase acquosa viene aggiunto l’acido formico o l’acido fosforico per avere un pH della soluzione acquosa inferiore alla pKa dell’analita. La modalità di eluizione può essere di tipo isocratico (quando la miscela eluente con proporzionalità costante) o in gradiente di concentrazione, quest’ultima permette di separare miscele complesse di flavonoidi che altrimenti presenterebbero tempi di ritenzione sovrapponibili (Merken et al., 2000; Schieber et al., 2001; Michalkiewicz et al., 2008; Fang et al., 2007; Castellari et al., 2002).
Per la determinazione della quercetina e della rutina sono comunemente usati i rivelatori fotometrici UV DAD (Wach et al., 2007; Yang et al., 2008) nel range di lunghezza d’onda tra i 360-370 nm. A tali condizioni
d’onda la sensibilità per determinazione di tali analiti risulta essere di 0,01-0,5 mg / mL. In alcuni casi, come in fluidi biologici, i limiti di rilevazione possono essere anche inferiori a pochi ng / mL (Hsiu et al., 2001).
Un altro tipo di rivelatore associato all’HPLC risulta essere l’amperometro accoppiato a una HPLC che viene utilizzato non solo per determinare la quercetina, la rutina e altri flavonoidi in diverse tipologie di matrici (Aguilar-Sanchez et al., 2005, Mullen et al., 2002; Buratti et al., 2001), ma anche per valutare l'attività antiossidante associata a prodotti alimentari, bevande e medicinali. Infatti per la valutazione dell'attività antiossidante, le sostanze di riferimento più utilizzate sono proprio: quercetina, rutina e didroquercetina.
Negli ultimi anni, è sempre più utilizzato il rivelatore di massa che permette la determinazione dei flavonoidi e dei suoi metaboliti in percentuali molte basse, come in studi cinetici o biochimici (Pang et al., 2009; Wang et al., 2005; Careri et al., 2000).
Per quanto riguarda la gascromatografia, la difficoltà principale per la determinazione della quercetina, della rutina e di altri flavonoidi è dovuta alla bassa volatilità, alta polarità e alla termodegradabiltà di tali sostanze; Per cui, la determinazione è preceduta da una fase di derivatizzazione che consiste nel trasformare tali composti in forme volatili come, derivati metilici e trimetilsililici (Molnar-Perl et al., 2005; Rijke et al., 2006). Un esempio di tale procedura è stata condotta su foglie di papaya. Infatti gli trattati secchi sono stati trattati con una miscela (1:1) di N, O-bis-(trimethylsilyl) trifluoroacetammide contenente 1% trimetil- clorosilano e piridina anidra. Tale soluzione viene riscaldata per 1 ora a 90 °С, fino a ottenere i derivati trimetilsililici dei flavonoidi, quantificati tramite GC-MS (Canini et al., 2007).
L’elettroforesi capillare (CE) risultata essere un’altra tecnica utilizzata per la determinazione dei flavonoidi (Molnar-Perl et al., 2005; Rijke et al., 2006; Xu et al., 2007). I vantaggi del metodo sono: l’elevata efficienza di separazione, la velocità e la semplicità di analisi, il piccolo volume di campione (diversi nanolitri) utilizzato e un minor consumo di eludenti (solventi).
Zhang et al., (2008) hanno determinato simultaneamente la quercetina, la rutina e altri flavonoidi (apigenina, luteolina, kaempferolo, (+)-catecolo, e (-)-epicatecolo), contenuti in fiori di crisantemo, sono stati contemporaneamente separati e determinati in meno di 20 minuti utilizzando una CE accoppiato a un rivelatore amperometrico in un tempo inferiore ai 20 minuti. Tali analiti sono stati separati attraverso le seguenti condizioni sperimentali: una potenziale di di 0,90 V; un voltage di 18kV; un tempo di ingresso elettrocinetico di 10 sec; con una soluzione di 36 mM tampone borato-fosfato (pH 8.8) con l'aggiunta di 3,0 mM β-ciclodestrina. Il campione non pretrattato è stato analizzato utilizzando una soluzione acqua-metanolo
o acqua-etanolo al 25%. Il limite di rilevamento per la quercetina e rutina è risultato essere del 2,8 × 10-7 g /
mL.
Per la determinazione della quercetina e miricetina nel vino, Wang et al., (2004) hanno utilizzato come soluzione elettrolitica il tampone borato (pH 8,9), un capillare di 45 cm e con diametro di 75 micron, l'intensità del campo elettromagnetico di 240 V / cm e un voltaggio di 16,8 kV.
Attraverso queste condizioni, è stata ottenuta una eccellente risoluzione per la quercetina, la rutina e la miricetina con una corsa globale di 16 minuti con i limiti di determinazione (LOD) sia della quercetina che della rutina di 0,06 mg / ml.
E’ sempre associato alla tecnica analitico-strumentale una preliminare fase estrattiva dei campioni al fine di semplificare la matrice di analizzare.
Numerosi metodi di estrazione sono stati messi a punto per ottenere la rutina in modo ottimale da diversi materiali vegetali per il rinnovato interesse verso la rutina di origine vegetale. Nell’ambito dei metodi di estrazione sono state utilizzate varie tecniche tra le quali: la tradizionale estrazione con solvente a metodi innovativi come
, l’
estrazione con fluidi supercritici (Dimitrieska-Stojkovic et al., 2003), l’estrazione con liquidi pressurizzati (Zhang et al., 2008; Macikova et al., 2012),
l’estrazione assistita da microonde (Zhanget al., 2009)
, l’
estrazione in fase solida (Michalkiewicz et al., 2008) e l’estrazione assistita da ultrasuoni(Yang and Zhang, 2008).
I metodi di astrazione applicati possono essere: 1. estrazione continua;
2. estrazione assistita da ultrasuoni;
3. estrazione assistita con metodo meccano-chimico; 4. estrazione assistita da microonde (MAE);
5. estrazione assistita da infrarossi; 6. estrazione con liquido pressurizzato;
7. estrazione in fase solida per la purificazione della rutina.
!
1.Estrazione continua
L’estrazione continua è un metodo di estrazione convenzionale che prevede il riscaldamento, l’evaporazione e il reflusso del solvente usato per l’estrazione per un certo periodo di tempo (Yang et al., 2008). Questo metodo è ampiamente diffuso per la semplicità della strumentazione richiesta. Tuttavia, la resa può essere
bassa a causa di processi quali: idrolisi, ossidazione e ionizzazione per l’elevata durata dell’estrazione (Ohnishi et al., 1994; Paganga et al., 1999).
Diversi studi descrivono come elevate quantità di solventi estraggano con maggior efficacia rispetto a estrazioni fatte con un rapporto tra le quantità di materiale vegetale e il quella di solvente maggiore (Pinelo et al., 2005; Altiok et al., 2008)
.
In estrazioni con rapporto più basso, il solvente diffonde nella pianta più facilmente. Di conseguenza le sostanze fitochimiche possono diffondere al di fuori del materiale vegetale con più facilità. L’estrazione infatti è un processo basato sulla diffusione e la dissoluzione.Secondo il principio che “similia similibus solvatarum”, il solvente con polarità vicina a quella del composto di interesse avrà maggiore possibilità di dare all’estrazione una resa elevata.
Per questo motivo la rutina che è polare viene generalmente estratta utilizzando solventi alcolici polari come etanolo e metanolo (Fathiazad et al., 2006). L'etanolo è preferibile perché è meno costoso e meno tossico.
Nel 1924, la rutina e stata estratta da fiori di sambuco (Sambucus Canadiensis L. Adoxacea) da alcuni studiosi statunitensi utilizzando etanolo al 95% (Sando et al., 1924).
Nel 1948, Koones e Clifton hanno brevettato un metodo di estrazione per la rutina da materiali vegetali mediante solvente alcolico.
Benché i solventi organici siano preferibili per l'estrazione rutina, una piccola quantità di acqua può migliorare l'efficienza dell’ estrazione (Altiok et al., 2008)
.
L’acqua può aumentare la diffusione dei polifenoli attraverso i tessuti vegetali. L’idratazione dei tessuti vegetali può aumentare la superficie di contatto fra il materiale vegetale da estrarre e il solvente (Li et al., 2004b).Kreft et al. (1999) e Kim et al. (2005) hanno riscontrato che l’etanolo al 55% circa produce il più alto rendimento dell’estrazione della rutina dal grano saraceno. La resa dell’estrazione non è solo dovuta alla solubilità della rutina nel solvente, ma anche all'effetto dell'interazione tra rutina e l’amido del grano saraceno. La temperatura ed il tempo di estrazione sono altri due fattori che sono stati presi in considerazione per l'estrazione in continuo. L'alta temperatura di estrazione aumenta normalmente il processo di trasferimento di massa e potrebbe degradare la rutina, specialmente nelle estrazione con solventi acquosi. In questo tipo di estrazioni la temperatura può raggiungere i 100 °C ma la maggior parte dei flavonoidi sono termolabili. In teoria estrazioni di lunga durata dovrebbero avere un alta resa. Tuttavia è stato osservato che la quantità di rutina estratta sarà inversamente proporzionale alla durata dell’estrazione, in particolare quando l'estrazione è effettuata ad alta temperatura.
Sono stati pubblicati anche degli studi che descrivono estrazioni semplici con diversi solventi (non continue). Una singola estrazione non è efficace di più estrazioni. I primi cicli di estrazioni hanno una resa più elevata rispetto all’ultimo ciclo di estrazione. Xie et al. (2011) hanno mostrato che i primi due cicli di estrazione hanno una resa elevata, circa il 90% della resa totale (Altiok et al., 2008). Pertanto, alcuni ricercatori per le difficoltà dell’estrazione dal materiale vegetali hanno eseguito più estrazioni successive per aumentare l'efficienza di estrazione stessa. Successive estrazioni possono aumentare la diffusione della sostanza da estrarre nel solvente.
!
2. Estrazione assistita da ultrasuoni
Per l’estrazione della rutina, il metodo che prevede l’uso degli ultrasuoni è probabilmente più efficiente di quello continuo. Rispetto all’estrazione continua a 80 °C per 2 ore
, quella
assistita da ultrasuoni per 1 ora a 50 °C da una resa che è superiore del 50%(
Zhao et al., 1991).È interessante notare che, l’estrazione della rutina con ultrasuoni è risultata essere il metodo meno adatta utilizzando un mezzo acquoso. Nel processo di estrazione la rutina è apparentemente più stabile all’ossidazione in metanolo che in acqua (Paniwnyk et al., 2001). Questo fenomeno è riconducibile alla cavitazione acustica nella soluzione (Paniwnyk et al., 2001; Yang et al., 2008). La cavitazione acustica prodotta dal passaggio di un’onda ultrasonica è maggiormente riscontrabile in mezzo acquoso. Le cavità (o micro-bolle) sono prodotte dagl’ultrasuoni durante il ciclo di espansione quando l'intensità di questi è sufficientemente elevata. I radicali liberi che sono generati all'interno delle bolle di cavitazione possono produrre effetti chimici indesiderati.
La sonicazione (o trattamento con ultrasuoni) in acqua è considerata la causa della formazione di radicali idrossilici altamente reattivi. Questi ultimi portano alla formazione di acqua ossigenata che può decomporre la rutina durante l’estrazione.
Sia Paniwnyk et al. (2001) che Yang et al., (2008) descrivono come la riduzione della resa dell’estrazione della rutina dalla Sophora japonica L.(Fabacae) è principalmente dovuta alla degradazione della rutina stessa causata da radicali idrossilici altamente reattivi durante la sonicazione in soluzioni acquose.
Diversamente dalla sonicazione con solventi acquosi, l’estrazione con sonicazione in metanolo sembra essere più efficace per aumentare la resa e ridurre la durata (Paniwnyk et al., 2001)
.
La sonicazione inmetanolo non produce una elevata quantità di radicali per effetto della cavitazione (Paniwnyk et al., 2001). L'effetto della cavitazione sembra essere inferiore perché la temperatura di estrazione applicata in metanolo è bassa (punto di ebollizione del metanolo 64,7 °C). Inoltre, la rutina è più solubile in metanolo.
L’aumento dell’efficienza dell’estrazione con ultrasuoni in metanolo può avere altre spiegazioni (Paniwnyk et al., 2001)
.
La onde ultrasoniche favoriscono una maggiore area di contatto tra matrice vegetale e la massa del solvente. L'onda ultrasonica provoca il collasso delle bolle di cavitazione che si riempiono con il vapore del solvente. Prima dell’esplosione, queste bolle assorbono energia dalle onde sonore, provocando una compressione del solvente allo stato gassoso. La compressione aumenta la temperatura e la pressione nella soluzione. Questo fenomeno favorisce il trasferimento di massa, oltre alla rottura delle cellule vegetali con il rilascio di fitochimici nel massa del mezzo (Toma et al., 2001).Osservando al microscopio elettronico parti di Euonymus alatus (Thunb.) Siebold (Celastraceae), Yang and Zhang (2008) hanno verificato la trasformazione degli steli macinati in particelle di dimensioni più piccole e la distruzione della parete cellulare per effetto degli ultrasuoni. Inoltre quest’ultimi provocano il successivo aumento della tensione superficiale della cellulosa con conseguente indebolimento della struttura della pianta.
Oltre che per la rutina, la sonicazione è stata ampiamente impiegata per estrarre da materiali vegetali altri composti quali: alcuni idrocarburi (Jacques et al., 2007)
, alcuni
esteri di acidi grassi (Stavarache et al., 2007), alcuni composti con attività
antiossidanti (Albu et al., 2004),
alcuni composti steroidi (Schinor et al., 2004) e alcuni antrachinoni (Hemwimol et al., 2006). L'ampia applicazione degli ultrasuoni per l'estrazione di sostanze fitochimiche dimostra l’utilità e l'affidabilità di questa tecnica per la separazione rutina.Inoltre, precedenti risultati hanno dimostrato che tre successive estrazione mediante sonicazione possono produrre una resa maggiore in rutina (Yang et al., 2008). Il confronto è stato effettuato considerando una estrazione o più estrazioni. In entrambi i casi tempo di estrazione complessivo è stato di 90 min.
!
3. Estrazione assistita con metodo meccano-chimico
Recentemente, una nuova tecnologia di estrazione chiamata estrazione meccanochimica è stata usata per separare efficacemente e rapidamente la rutina dall’ Hibiscus mutabilis L. (Malvaceae) (Xie et al., 2011). Uno dei vantaggi di questo metodo di estrazione è la combinazione della azione chimica e quella meccanica
a temperature di gran lunga inferiori. L’azione meccanica è applicata per agevolare la diffusione della rutina dalle cellule vegetali al solvente, mentre l’azione chimica agevola la salificazione della rutina stessa per effetto di un agente neutralizzante, il carbonato di sodio (Na2CO3) o il tetraborato di sodio (Na2B4O7).
Essendo la rutina un acido debole e la sua pKa è circa 4.3 (Jovanovic et al., 1994).
Questo metodo ha una elevata efficienza per i composti che hanno una bassa solubilità in acqua come rutina (12,5 g/100 mL). L'aggiunta di agenti alcalinizzanti solidi provocano la conversione della rutina in forma di sale. Il sodio tetraborato è utilizzato anche per prevenire l’ossidazione dei gruppi ossidrilici della rutina. Infatti la rutina ha diversi gruppi idrossilici acidi legati ad anelli aromatici. A causa di questi gruppi ossidrilici la rutina può essere trasformata in un composto altamente polare per effetto dell’azione chimica (Xie et al., 2011).
La concentrazione minima di sostanze alcalinizzanti solide necessarie per completare l’estrazione è legata alla quantità di composto da estrarre e alla capacità di salificare per effetto dell’elevata energia dell’azione meccanica. Inoltre, un altro fattore critico per efficienza dell’estrazione meccanochimica è il tempo di macinazione. E’ stato osservato che tempo di macinazione troppo lungo riduce la resa dell’ estrazione a causa dell’ossidazione rutina. La formazione di aggregati nel materiale vegetale può ridurre la superficie di contatto e il trasferimento di massa (Xie et al., 2011).
Già nel 1948 Koones e Clifton hanno osservato che l’aggiunta di una soluzione acquosa di borato facilita l’estrazione di rutina da materiale vegetale. Il metodo di estrazione riportato da loro è puramente chimico poiché hanno usato degli acidi per precipitare le impurezze dalla soluzione di estrazione contenete rutina. In quel caso, nessuna forza meccanica è stata esercitata per aumentare l'efficienza dell’ estrazione. La solubilizzazione di rutina è stata aumentata con l’aggiunta di una quantità sufficiente di soluzione di borato a portare il pH della soluzione a circa 7,4. Aggiungendo il 25% circa di agenti precipitanti come il cloruro di sodio, il solfato di ammonio o il cloruro di magnesio è possibile ottenere la precipitazione di una parte delle impurità. Le restanti impurità furono eliminate portando pH a un valore tra 5,2 e 5,5 con acido cloridrico, acido acetico o acido fosforico e quindi filtrando la soluzione. Rendendo la soluzione leggermente acida, la quercetina che nell'estrazione della rutina è considerata come un’ impurità, potrebbe essere precipitata. Ulteriori acidificazioni del filtrato con acido solforico diluito fino ad un pH tra 1,0 e 4,0 porterebbero alla purificazione della rutina dopo la rimozione delle impurità dalla soluzione acquosa.
!
!
!
4. Estrazione assistita da microonde (MAE)
L’energia fornita delle microonde è nota per il suo effetto di riscaldamento aumentando così la velocità di vari processi (Deng et al., 2006). I vantaggi significativi dell’ estrazione assistita da microonde sono la riduzione del tempo di estrazione e la riduzione della quantità di solvente usato (Li et al., 2004a).
Secondo Deng et al., (2006) le microonde possono provocare un improvviso aumento della temperatura all'interno della struttura cellulare, un eventuale rottura delle pareti cellulari e il rapido rilascio di sostanze vegetali nel mezzo circostante. Benché il meccanismo di estrazione con microonde non sia del tutto chiaro, esso ha suscitato particolare interesse per la sua applicazione con piante erbacee (Deng et al., 2006).
Questo metodo è stato applicato da Zhang et al. (2009) per estrarre la rutina a partire dai campioni di Euonymus alatus (Thunb.) Siebold (Celastraceae). Questi ricercatori hanno valutato che l’estrazione della rutina con il metodo assistito da microonde è più efficace di quella continua con l’estrattore Soxhlet (360 min) e di quello assistito da ultrasuoni (30 min); infatti il tempo di estrazione si riduce notevolmente (6 min). Anche alcuni liquidi ionici, per la loro l’elevata capacità di estrarre in presenza di microonde sono stati utilizzata per separare la rutina. Zeng et al. (2010) hanno dimostrato che l'estrazione assistita da microonde con un liquido ionico ha dato risultati eccelenti in termini di resa in diverse piante quali la Sophora japonica L. (Fabaceae) e la Schisandra chinensis (Turcz.) Baill (Schisandraceae). Soluzioni contenenti sali dell’1- butil-3-metilimidazolio sono stati considerati come solventi per l’estrazione assistita da microonde. E’ risultato che la soluzione acquosa del bromuro dell’1-butil-3-metilimidazolio è delle più efficaci per l’estrazione della rutina. Come per altri metodi di estrazione, il rapporto tra il liquido e il solido è molto importate per l’efficienza dell’estrazione. Più alto è il rapporto tra il solvente e il materiale vegetale e migliore è la resa dell’estrazione. Questo per l’elevata area di contatto tra la matrice vegetale e il liquido ionico.
Anche se elevate temperatore riducono la viscosità del solvente, la temperatura ottimale per l’estrazione della rutina è di 65 °C circa; per estrazione dalla Sophora japonica L. (Fabaceae) e dalla Schisandra chinensis (Turcz.) Baill (Schisandraceae). A temperature superiori la rutina si decompone (Zeng et al., 2010).
I liquidi ionici sono una nuova classe di solventi tra i quali ci sono: soluzioni di sali di cationi eterociclici organici e anioni inorganici o organici; queste soluzioni sono liquide a temperature ambiente (Du et al., 2009). I liquidi ionici hanno caratteristiche non molecolari e proprietà intrinseche come: un ampio intervallo liquido, una buona capacità di solvatazione, un eccellente capacità di assorbire le microonde, un eccellente conducibilità ionica e bassa tensione di vapore, nonché una elevata stabilità chimica e termica (Van Rantwijk et al., 2007). A causa della bassa tensione di vapore, i liquidi ionici difficilmente evaporano e
possono anche essere riciclati. Pertanto, i liquidi ionici stanno suscitando interesse per il loro basso impatto ambientale. In generale, sia la selettività che l'efficienza dell’estrazione con liquidi ionici sono state migliorate, in particolare per l'estrazione di composti della medicina tradizionale cinese. Diversi studi hanno dimostrato che i liquidi ionici esercitano molteplici tipi di interazioni con la rutina tra le quali quelle dovute al legame idrogeno, la polarità e la carica ionica della rutina stessa (Beyene et al, 2004). Queste interazioni aumentano la solubilità di rutina (Dursun et al., 2004).
!
5. Estrazione assistita da infrarossi
Recentemente, l'estrazione assistita dall’esposizione a radiazioni elettromagnetiche nel campo degli infrarossi ha dimostrato di essere un metodo alternativo per l'estrazione dei principi attivi dalle piante medicinali (Chen et al., 2010; Duan et al., 2010). Questo metodo utilizza l’energia di radiazioni infrarosse per riscaldare il solvente a contatto con il materiale vegetale per poter separare alcune sostanze dalla matrice. Una elevata efficienza di riscaldamento si ottiene utilizzando radiazioni a lunghezza d'onda del riscaldatore a infrarossi adeguate alle caratteristiche di assorbimento dei campioni e del solvente (Duan et al., 2010). In termini di resa di estrazione, questo metodo, può non esser efficiente come quello assistito da microonde, ma è più semplice ed economico.
!
6. Estrazione con liquido pressurizzato
Le particolari proprietà dei liquidi ionici hanno fatto si che il loro utilizzo fosse esteso all’estrazione con il liquido pressurizzato. L’estrazione con il liquido pressurizzato è avvolte chiamata anche estrazione accelerata con solvente.
Il vantaggio di questa tecnica è l'uso dell’alta pressione per accelerare estrazione dalla matrice del campione; l’estrazione avviene in una colona in cui è presente sia la matrice (ossia il materiale vegetale) che del materiale inerte.
L'efficacia del metodo di estrazione può essere migliorata aumentando il numero di estrazioni, utilizzando solventi più adatti oppure variando le proporzioni dei componenti del solvente stesso. Wu e al. (2012) hanno descritto una nuova procedura di estrazione con liquidi ionici pressurizzati. Con questa