La struttura utilizzata come punto di partenza è quella risolta a 2.80 Å da Pan et al. [7] alla quale mancano i primi 87 aminoacidi che sono stati degradati durante la procedura di purificazione. Per ovviare a questa mancanza abbiamo aggiunto un
31 gruppo terminale acetilico (ACE) ai primi residui aminoacidici della struttura. Le sei molecule d’acqua presenti nell’ambiente vicino ai cofattori sono state mantenute nella struttura.
Per quanto riguarda lo stato di protonazione dei residui abbiamo seguito la procedura messa a punto da Müh et al [24]. Tutti i residui sono nello stato di protonazione standard a pH=7 ad eccezione di due residui di Glutammato (Glu128 e Glu151) ed uno di Istidina (His235) che sono protonati. Gli altri residui di Istidina hanno carica netta uguale a zero.
Tutti i residui di istidina sono nella configurazione eccezion fatta per His 99, 200 e 229 che si trovano invece nella configurazione poiché quest’ultima permette l’interazione con l’atomo di Mg delle clorofille. La carica totale del sistema è -3. Le posizioni degli idrogeni sono state minimizzate utilizzando la suite di programmi Amber12 [25].
Per descrivere la matrice proteica è stato utilizzato il force field ff99SB [26], per i lipidi è stato impiegato lipid11[27] mentre per le clorofille sono stati utilizzati parametri presi da FF ottimizzati già presenti in letteratura [28;29]. Per poter modellizzare i carotenoidi con una buona accuratezza è invece stato necessario sviluppare un nuovo force field derivato da calcoli quanto meccanici.
Nell’intento di riprodurre l’architettura di CP29 in vivo, il complesso è stato “immerso” in un doppio strato fosfolipidico che simulasse la membrana dei grana tilacoidali creato con 450 unità lipidiche di Fosfatidilcolina (PC) (225 per layer) ed uno strato di acqua di solvatazione di spessore 30 nm (Fig.12) usando CHARMM- GUI[30] website tool.
32 La dinamica molecolare si è stata realizzata fondamentalmente in tre step:
1. Minimizzazione della struttura così da permettere un rilassamento del sistema; 2. Lento riscaldamento del sistema fino a raggiungere una temperatura di 300 K
in un run di 100 ps e le posizioni dei lipidi sono vincolate ad un potenziale armonico.
3. Simulazione di 80 ns in condizioni NPT (numero di atomi, pressione e temperatura costanti) ed uno step di integrazione di 2 femtosecondi.
Il controllo di temperatura e pressione è effettuato utilizzando gli strumenti implementati in Amber12 ossia un Termostato di Langevin ed un barostato anisotropico.
Le molecole d’acqua sono trattate utilizzando il modello TIP3P; le distanze O-H e l’angolo H-O-H, così come gli altri legami del sistema che coinvolgono l’idrogeno,sono stati vincolati utilizzando l’algoritmo SHAKE [31]. Le condizioni periodiche al contorno sono state applicate insieme all’approccio Particle Mesh Ewald per quanto riguarda le interazioni elettrostatiche a lungo raggio. Per le interazioni di non legame in genere è stato impiegato un raggio di cutoff di 10 Å. Dagli ultimi 20 nanosecondi di traiettoria sono state estratte quattrocento configurazioni non correlate utilizzate poi nei calcoli QM. Sono stati scelti gli ultimi 20 nano secondi perché dall’analisi dei grafici di RMSD (Rooth Mean Square Distance) che rappresenta la posizione di ogni
33 atomo rispetto al valore di riferimento durante la dinamica emerge che in questo intervallo di tempo il sistema ha raggiunto l’equilibrio (Figura13).
Fig.12: Complesso CP29 (gialla)-Clorofille(verdi)-carotenoidi(arancio), inserito in un bilayer lipidico per simulare le condizioni ”in vivo”.
Fig.13: La figura riporta i valori di RMSD (rooth mean square distance) per violaxantina in blu, per lo
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Capitolo 3
Risultati e discussione.
Nel presente capitolo riportiamo e commentiamo i risultati ottenuti applicando le tecniche appena esposte al complesso pigmento-proteina CP29.
Come detto nell’introduzione, CP29 sembra essere coinvolta in due diverse funzioni, quella di light-harvesting e quella di fotoprotezione. La sua struttura presenterà quindi alcune specificità che la rendono capace di svolgere questo doppio ruolo. Per esempio, in maniera del tutto analoga al sistema principale usato da PSII per il light- harvesting (LHCII) anche CP29 ha due siti di legame per Luteina ma in L2 si lega un altro carotenoide, la Violaxantina (Vio). È in questo sito che si verificano le reazioni del ciclo delle Xantofille ed è per questo motivo che rispetto al sito L1, questo ha una conformazione più “aperta”. Non è un caso che Vio si leghi in un sito di legame originariamente identificato come elettivo per la Luteina: Bassi et al. [4] hanno infatti dimostrato che attraverso una mutagenesi sito specifica che rende di fatto la pianta non in grado di convertire VIO in ZEA (mutante npq1), la Luteina, viene “sovra” espressa. La conversione VIO-ZEA comporta inoltre una variazione nel numero di legami coniugati dei carotenoidi, che cambia dopo il ciclo delle Xantofille passando da 9 a 11 (Fig.5). Come descritto da Polivka e Frank [32] questo cambiamento si ripercuote anche sui meccanismi di trasferimento di energia da carotenoide a clorofilla e viceversa.
35 Nella sezione 1.2 abbiamo presentato una breve descrizione del processo di trasferimento di energie tra un donatore ed un accettore. Lo stesso fenomeno è qui esteso al caso di un sistema multicromoforico in cui, cioè, esistono molti cromofori (le clorofille ed i carotenoidi) interagenti ed ognuno di loro può agire da donatore ed accettore. Inoltre tali cromofori sono immersi in un ambiente che può modificarne le proprietà e le interazioni.
Per descrivere un processo così complesso, introduciamo una semplificazione associando i processi di Light-Harvesting soltanto all’insieme delle 13 clorofille e limitando quello di fotoprotezione ad un piccolo cluster formato da un carotenoide e le tre clorofille a lui più vicine. La prima assunzione, cioè che il processo di light- harvesting in CP29 ed in sistemi LH simili sia dominato da trasferimenti tra eccitazioni di tipo Qy delle clorofille, in realtà è comune alla quasi totalità degli studi fatti su questo sistema.