Nella sezione 1.1 abbiamo descritto nel dettaglio la struttura di CP29 come risolta da Pan e collaboratori [5] e da Shabestari et al., per quanto riguarda l’ N-terminale [8] ed abbiamo detto che presenta tre siti distinti per i tre diversi carotenoidi L1, L2, N1 ( Lut Vio e Neo rispettivamente). Abbiamo anche spiegato come la conformazione
degli stessi sia strettamente correlata alla funzione. Infatti, se prendiamo in esame L1 ed L2, possiamo notare come il primo abbia conservato la specificità per il carotenoide originale (come in LHCII) che forma un cluster molto attivo nel quenching dell’energia interagendo con le tre clorofille a 610, 612 e 613. Il secondo sito per la Luteina invece (a differenza del complesso maggiore), come dimostrato da Bassi et al. [4] ha subito un’evoluzione in senso strutturale in modo tale da poter legare Violaxantina e da consentirne la commutazione in Zeaxantina attraverso il ciclo delle Xantofille e, di conseguenza, l’acquisizione di quelle qualità energetiche che permettono il quenching non fotochimico all’interno del cluster formato da
43 VioZea con le tre clorofille a602, a603 ed a604. Diversi lavori hanno poi avanzato l’ipotesi che la clorofilla 604 possa fungere anche da “canale” dell’energia da trasferire al “Core”. Questo risultato è anche confermato dall’analisi delle site energies riportata nella sezione precedente: come si vede dalla figura 17 la clorofilla 604 risulta essere una delle clorofille con energia di eccitazione più bassa.
Le due caratteristiche appena esposte ovvero quella strutturale del carotenoide e quella energetica delle clorofille ci hanno portati a focalizzare l’attenzione su questo cluster (Figura 19) piuttosto che su quello formato dalla Luteina con 610,612 e 613, effettuando su di esso un’analisi dettagliata.
Fig. 19: Cluster Clorofille-Violaxantina con le distanze dei centri di massa di a602 , a603 ed a604 dal centro di massa del carotenoide. Per chiarezza illustrativa sono state omesse le catene laterali delle clorofille.
Identificato il cluster , lo abbiamo studiato dal punto di vista geometrico analizzando prima le tre clorofille senza il carotenoide (Figura 20) poi abbiamo aggiunto
Violaxantina
a603
44 Violaxantina e da ultimo, Zeaxantina. Per tutti questi tre sistemi abbiamo estratto distanze inter molecolari ed orientazioni relative dei dipoli di transizione che sappiamo essere componenti fondamentali del coupling (paragrafi 1.2 e 3.1)
L’analisi dei couplings riportati nella sezione precedente viene qui approfondita per le tre clorofille di interesse. In Tabella 2 riportiamo i valori dei coupling calcolati sia con l’approccio QM/MMPol (gli stessi valori rappresentati graficamente in fig. 18) che con quello approssimato di tipo dipolo-dipolo (si veda eq. 1.3).
Dimeri Chl Vcoul(QM) Vdip-dip
602-603 109.02 117.97
602-604 17.46 17.06
603-604 -7.09 -7.79
Tab.2 : In tabella sono riportati i valori in cm-1 delle componenti coulombiane dei Coupling tra le coppie del nostro cluster.
Analizzando la tabella possiamo immediatamente notare che per questo cluster di clorofille la rappresentazione in termini di dipoli di transizione riesce a descrivere molto bene l’interazione coulombiana: questo risultato era prevedibile data la distanza abbastanza elevata tra le clorofille dell’ordine di 12-25 Angstrom che rendono applicabile una descrizione dipolare. Il buon accordo osservato tra la descrizione approssimata e quella completa del calcolo quantomeccanco ci permette quindi di poter analizzare l’effetto delle fluttuazioni strutturali indotte dall’ambiente in termini dei due parametri del modello dipolo-dipolo, e cioè la distanza tra i centri
45 delle clorofille (qui rappresentate dalle distanze tra gli atomi di magnesio) e il parametro orientazionale k definito come in sezione 1.2. In questa analisi si assume che il dipolo di transizione delle clorofille non cambi orientazione durante la dinamica ma rimanga nella direzione indicata in Fig.9.
Fig.20: Le tre clorofille a del cluster studiato: in verde cla 602, in malva cla 603 ed in verde oliva cla 604. In blu le distanze Mg-Mg estratte nell’analisi.
Nella figura 20 sono state messe in evidenza, le distanze Mg-Mg che nell’ analisi geometrica che segue verranno estratte dalla MD, mediate e confrontate con il valore cristallografico. (Figg. 21-23) Dalla stessa immagine, si nota che gli anelli dei tre cromofori, giacciono su tre piani diversi. Poiché il dipolo di transizione (Qy) per ciascuna clorofilla è sullo stesso piano dell’anello, andremo anche ad analizzare le orientazioni relative di questi piani con il parametro “k”. (Figg.24-26)
a602 a603
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Fig.21: Distribuzione dei valori delle distanze intercromoforiche Mg-Mg tra a602 ed a603 ottenuto dalla dinamica, in viola lo stesso valore estratto dalla cristallografia.
Fig.22: Distribuzione dei valori delle distanze intercromoforiche Mg-Mg tra a602 ed a604 ottenuta dalla dinamica, in viola lo stesso valore estratto dalla cristallografia.
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Fig.23: Distribuzione dei valori delle distanze intercromoforiche Mg-Mg tra a603 ed a604 ottenuta dalla dinamica, in viola lo stesso valore estratto dalla cristallografia.
La prima osservazione è che le fluttuazioni delle distanze durante la dinamica sono diverse per le tre coppie: in particolare si osserva che la distribuzione più larga è quella tra a603 e a604. Questo risultato è coerente con le informazioni che ci fornisce la figura 19 poiché questi due cromofori sono relativamente più liberi di muoversi della clorofilla a602 che si trova in stretta relazione con l’anello terminale del carotenoide che ne impedisce grandi spostamenti.
Andiamo adesso ad analizzare per questi dimeri anche il parametro dell’orientazione relativa “k” e facciamo le stesse valutazioni rispetto al dato cristallografico.
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Fig.24: Confronto tra i valori che il parametro “k” assume durante la dinamica (distribuzione in azzurro) e quello assunto nella struttura cristallografica.
Fig.25: Confronto tra i valori che il parametro “k” assume durante la dinamica (distribuzione in azzurro) e quello assunto nella struttura cristallografica.
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Fig.26: Confronto tra i valori che il parametro “k” assume durante la dinamica (distribuzione in azzurro) e quello assunto nella struttura cristallografica.
Dai grafici, è evidente che il dato cristallografico non rappresenta correttamente la orientazione media dei pigmenti nel cluster, in particolare per quanto riguarda la a603, tant’è che in entrambi i “dimeri” di cui essa fa parte, la distribuzione di “k” durante la dinamica è spostata rispetto al dato cristallografico. Per quanto riguarda invece la coppia a602-a604 non solo la distribuzione è praticamente centrata sul dato cristallografico ma anche la sua ampiezza è molto più piccola che nelle coppie che coinvolgono la a603.
Dall’analisi strutturale delle distanze e dei k possiamo ora avere una comprensione migliore dei dati riportati in Tabella 2. Il coupling V(602-603) è molto maggiore di quello tra le altre due coppie perché la distanza 602-603 è molto minore. Risulta inoltre chiaro adesso che la ragione per cui V(602-604) è maggiore di V(603-604) è
50 puramente di tipo orientazionale, infatti pur essendo le due clorifille 602 e 604 più vicine, il loro parametro k è significativamente più piccolo (e negativo come confermato dal segno del coupling).
Adesso che abbiamo caratterizzato il cluster delle clorofille, possiamo “aggiungere” il carotenoide e ripetere le stesse analisi per il sistema coinvolto nella fotoprotezione. Per fare questo andiamo a scomporre la figura 18 ed analizziamo le singole clorofille separatamente: possiamo notare che per la Cla 602 la presenza dell’ossigeno epossidico sul gruppo laterale di VIO ad essa vicino, comporta un’interazione più forte tra i due atomi pesanti, quindi una distanza minore, ma anche un ingombro sterico maggiore che impedisce alla clorofilla di avvicinarsi più di una certa distanza. Questa limitazione non si riscontra per le altre due clorofille poiché, nessun gruppo funzionale interagisce con la CLA 603 e per quanto riguarda la CLA 604 l’epossido è dal lato opposto del piano dell’anello.
I grafici che seguono, riportano, in azzurro, la distribuzione delle fluttuazioni della distanza del centro di massa delle clorofille da quello della Violaxantina durante la dinamica molecolare ed in viola il valore dello stesso parametro nella struttura cristallografica. (Fig. 27-29)[5]
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Fig.27: Distribuzione delle distanze CLA602-VIO in MD (in azzurro) contro il valore cristallografico (in
viola).
Fig.28: Distribuzione delle distanze CLA603-VIO in MD (in azzurro) contro il valore cristallografico (in
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Fig.29:Distribuzione delle distanze CLA604-VIO in MD (in azzurro) contro il valore cristallografico (in
viola).
Confrontando i grafici possiamo trovare conferma di quanto sopra esposto ovvero nella figura 27 che si riferisce a CLA 602 vediamo che la distanza tra le due molecole varia molto poco e questo è indice dell’interazione tra magnesio ed ossigeno epossidico che crea un vincolo. A riprova di ciò possiamo confrontare la figura 27 con la 29 che riporta il medesimo grafico per la a604 che ha l’epossido in trans ed infatti sia la distanza media tra cromoforo e carotenoide che la fluttuazione sono maggiori. Il terzo grafico riporta i valori della clorofilla a603 che, come detto, non ha gruppi funzionali strettamente correlati ed infatti ha sia la distanza media più piccola che la fluttuazione massima a causa della sua maggiore libertà di movimento.
Come già fatto per il cluster delle tre clorofille, prendiamo ora in esame il parametro orientazionale “k” (si veda eq. (3.1)) che rende conto dell’orientazione relativa dei cromofori rispetto a Violaxantina.
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In Fig.s (30-32) abbiamo riportato le distribuzioni dei valori di questo parametro tra le tre clorofille del cluster e Violaxantina durante la dinamica contro il valore dello stesso nella struttura cristallografica, al pari di quanto fatto per le distanze intercromoforo.
Fig.30: Distribuzione delle Kappa CLA602-VIO in MD (in azzurro) contro il valore cristallografico.
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Fig.32:Distribuzione delle Kappa CLA602-VIO in MD (in azzurro) contro il valore cristallografico.
Anche l’analisi delle orientazioni relative dei cromofori rispetto al carotenoide conferma quanto detto per le tre clorofille senza di esso ossia che le due CLA 602 e 603, verosimilmente a causa delle interazioni con gli anelli terminali di Violaxantina, sono vincolate anche dal punto di vista rotazionale ed infatti le rispettive distribuzioni di k in MD, oscillano intorno al valore cristallografico. Questo non accade per la terza clorofilla (a603) la quale ancora una volta a causa della propria libertà di movimento, assume durante la dinamica molecolare, valori più piccoli di quello cristallografico che, come si può facilmente vedere in figura 31, è quasi del tutto spostato verso destra.
Se i comportamenti delle specie in gioco sono dettati in massima parte dalle interazioni tra cromoforo e carotenoide, ripetendo la stessa analisi sostituendo nel cluster Zeaxantina a Violaxantina, che è la situazione in vivo a seguito del ciclo delle xantofille, dovremmo notare variazioni sia nei valori delle distanze che in quelli del
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parametro orientazionale “k”.
Per chiarezza espositiva, di questa ultima situazione non abbiamo riportato i grafici come in precedenza ma abbiamo inserito i valori dei parametri in tabelle in modo da avere un confronto più diretto tra i due carotenoidi.
Coppia Valore Cristallografico (Å) Media distribuzione MD (Å) Deviazione standard (Å) Vio-602 11.4 11.5 0.22 Vio-603 6.7 7.3 0.26 Vio-604 16.5 16.3 0.24 Zea-602 N.D. 11.5 0.22 Zea-603 N.D. 7.2 0.22 Zea-604 N.D. 6.6 0.27
Tab 3.: valore cristallografico, media della distribuzione dei valori estratti dalla dinamica e la deviazione standard della distanza inter-pigmento (in Angstrom). Evidenziati in azzurro i valori corrispondenti al cluster con Violaxantina ed in rosso a quello con Zeaxantina.
Coppia Valore
Cristallografico distribuzione Media MD Deviazione standard Vio-602 1.266 1.341 0.052 Vio-603 0.691 0.847 0.082 Vio-604 -1.617 -1.637 0.054 Zea-602 N.D. 1.290 0.057 Zea-603 N.D. 0.612 0.109 Zea-604 N.D. -1.690 0.042
Tab 4 .: Valore cristallografico, media della distribuzione dei valori estratti dalla dinamica e deviazione standard per il parametro orientazionale “k”. Evidenziati in azzurro i valori corrispondenti al cluster con Violaxantina ed in rosso a quello con Zeaxantina.
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parametri “distanza” e “k” siano fondamentalmente influenzati dalla struttura del carotenoide. Scendendo nel particolare, possiamo notare che, per quanto riguarda la distanza, essa diminuisce per CLA 602 e CLA 603 coerentemente con l’assunzione che passando da Violaxantina a Zeaxantina diminuiscono le interazioni cromoforo- carotenoide dovute all’epossido se questo è in cis. Per lo stesso motivo ma in senso opposto, CLA 604 che aveva l’epossido in trans, risulterà adesso più lontana aumentando le forze repulsive. Il confronto dei valori del parametro orientazionale supporta ulteriormente questa tesi, infatti per a602 ed a603, “k” diminuisce indicando che più la clorofilla è vicina al carotenoide e meno è libera di ruotare. Per a604 succede esattamente l’opposto come per le distanze.
Il modello descrittivo fin qui adottato che lega la grandezza delle interazioni tra pigmenti con le loro distanze ed orientazioni relative funziona bene quando i trasferimenti di energia coinvolgono eccitazioni a stati di singoletto caratterizzati da dipoli di transizione significativi. Questo modello però non può essere utilizzato per descrivere i trasferimenti di tripletto coinvolti nei processi NPQ. I motivi per cui questo modello non è utilizzabile in questi casi sono due, ovvero il fatto che nelle transizioni di tripletto i dipoli di transizione sono nulli e la dipendenza di questi accoppiamenti dalla sovrapposizione degli orbitali di donatore ed accettore. Per avere, ancora una volta un’idea geometrica di questo processo energetico possiamo rappresentare le specie coinvolte attraverso il loro volume definito dall’intersezione di sfere centrate nei singoli atomi come illustrato in figura 33. Nel nostro modello geometrico tale volume rappresenterà la distribuzione volumica degli elettroni
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coinvolti nel trasferimento.
Fig.33 In azzurro la rappresentazione della Violaxantina con le sfere come descritte in sezione 1.2 mentre in giallo la stessa rappresentazione della clorofilla. Le posizioni degli atomi nelle molecole sono visibili in trasparenza.
In figura 34 riportiamo le distribuzioni dei valori di sovrapposizione dei volumi della clorofilla 602 con Vio e Zea estratti dalle corrispondenti simulazioni MD. Dall’analisi di questi cercheremo di capire se il ciclo delle Xantofille oltre a modificare direttamente la struttura del carotenoide, aumentando il numero di legami coniugati
[32], consente anche una maggiore sovrapposizione delle densità elettroniche di
clorofilla e Zeaxantina rispetto a quella con Violaxantina favorendo i trasferimenti di tripletto.
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Fig. 34: In giallo La distribuzione dei valori del volume di sovrapposizione estratti dalla dinamica con Violaxantina ed in azzurro gli stessi valori estratti dall’MD con Zeaxantina.
Dal grafico riportato in Fig. 34, possiamo notare che la distribuzione della sovrapposizione relativa a Zeaxantina è spostata verso destra rispetto a quella di Violaxantina indicando un maggior valore di sovrapposizione delle sfere atomiche (cioè delle densità elettroniche nel nostro modello semplificato) ovvero che la clorofilla 602 è più libera di avvicinarsi al carotenoide. Questo risultato è in accordo con quando dedotto dall’analisi delle distanze dei centri di massa: l’apertura degli epossidi sugli anelli terminali ad opera delle De-epossidasi, riduce gli effetti di ingombro sterico favorendo l’avvicinamento tra i due pigmenti e quindi rendendo più probabili i trasferimenti di tripletto.
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Conclusioni.
Il fotosistema II è un supercomplesso transmembrana che ha la funzione di “raccogliere” l’energia solare (funzione di light-harvesting) e di utilizzarla per attuare lo splitting dell’acqua da cui si attiva la cascata di reazioni che prendono complessivamente il nome di Fotosintesi Clorofilliana. Scendendo nel particolare, il fotosistema II può essere diviso in complessi “antenna” (maggiori e minori) e complessi di “core” (tra cui il centro di reazione). Tra i complessi antenna minori che si localizzano nelle adiacenze del core sono stati identificati fondamentalmente tre complessi ovvero CP24, CP26 e CP29; quest’ultimo in particolare sembra avere oltre alla funzione Light Harvesting anche un importante ruolo nel meccanismo di fotoprotezione ed in particolare quello di “quencher” per l’energia in eccesso in condizioni di alta luce.
Lo studio oggetto di questa tesi di Laurea ha cercato di caratterizzare il meccanismo d’azione attraverso cui il complesso CP29, attua la sua doppia funzione sia di “raccoglitore” di energia che di “fotoprotettore”.
La struttura di CP29 è stata risolta solo di recente (2011) da Pan e collaboratori utilizzando la tecnica della cristallografia a raggi X. Tale struttura comporta però due problemi principali quando usata per simulare le funzioni del complesso:
Manca dei primi 87 aminoacidi dell’N-terminale;
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Per quanto riguarda il primo punto, il gap è stato colmato dal gruppo di Van Amerongen nel Marzo scorso [8] attraverso l’utilizzo di tecniche EPR.
Per quanto riguarda invece la riproduzione della situazione “in vivo”, in questa tesi si è fatto uso di tecniche di simulazione computazionale basate su dinamiche molecolari. Il protocollo seguito è quello di “aggiungere” intorno alla struttura cristallografica del complesso pigmento-proteina un bilayer lipidico (che rappresenta la membrana del tilacoide) circondato da acque di solvatazione, poi “riscaldare” il tutto per raggiungere le normali condizioni “in vivo” e quindi generare una traiettoria da cui estrarre le configurazioni proteina-ambiente da usare nell’analisi statistica del sistema.
L’analisi è stata divisa in due parti: nella prima l’attenzione è stata rivolta al processo light-harvesting che in questo sistema è svolto principalmente dal cluster costituito da 13 clorofille che assorbono la luce solare a la “convogliano” verso i complessi di core attraverso una serie di trasferimenti di energia interpigmento. Nella seconda fase invece è stato analizzato il possibile meccanismo di fotoprotezione in cui il ruolo chiave è giocato dai carotenoidi. Sono infatti questi ultimi che possono accettare l’energia in eccesso dalle clorofille e dissiparla sotto forma di calore.
La nostra analisi dei due meccanismi è stata svolta sulla base dei dati strutturali derivati dalla dinamica molecolare ed ha sfruttato rappresentazioni modellistiche estremamente semplificate per descrivere le possibile interazioni che si realizzano tra clorofille da un lato, e tra clorofille e carotenoidi dall’altro. Inoltre, per quanto riguarda l’analisi dei meccanismi di fotoprotezione, è stato condotto un confronto tra
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due complessi CP29, quello wild-type a normali condizioni di luce e quello ottenuto sostituendo uno dei carotenoidi presenti nella struttura wild-type (Violaxantina) con quello presente in condizioni di alta luce (Zeaxantina). Tale confronto ha permesso di mettere in evidenza possibili differenze strutturali indotte dal cambiamento Violaxantina-Zeaxantina e di collegarle con il diverso ruolo che i due carotenoidi sono supposti avere nella funzione fotoprotettiva della CP29.
Per mettere a diretto confronto le due funzioni, ci siamo focalizzati su un particolare “dominio” formato dalle clorofille a602 a603 ed a604 e dal carotenoide a loro vicino (Violaxantina e/o Zeaxantina).
Per quanto riguarda lo studio della funzione light-harvesting abbiamo confrontato calcoli quantomeccanici con un modello semplificato (modello di Förster) che ci consente di stimare l’accoppiamento elettronico tra i cromofori, semplicemente sfruttandone la dipendenza da distanze tra i centri di massa di accettore e donatore e dalle orientazioni relative dei dipoli di transizione. Analizzando i valori delle distanze ottenuti dalla dinamica e confrontandoli con i dati cristallografici abbiamo potuto osservare che in generale le distanze medie sono a valori maggiori rispetto al dato cristallografico. Analizzando poi le varie coppie di clorofilla del cluster considerato, vediamo che le fluttuazioni delle distanze sono molto diverse. La distribuzione più larga è quella tra a603 e a604, coerentemente con il fatto che questi due cromofori sono relativamente più liberi di muoversi della clorofilla a602 che si trova in stretta relazione con l’anello terminale del carotenoide che ne impedisce grandi spostamenti. Analogamente, introducendo un parametro
62 orientazionale, è evidente che la struttura cristallografica non rappresenta correttamente l’orientazione relativa media dei pigmenti.
Passando invece allo studio della funzione di fotoprotezione, l’analisi diventa più complessa: in questo caso gli accoppiamenti da considerare riguardano le clorofille con il carotenoide e le eccitazioni elettroniche coinvolte possono essere sia di singoletto che di tripletto.
Per il singoletto, abbiamo eseguito esattamente la stessa analisi effettuata sulle clorofille ovvero abbiamo estratto le distanze tra i centri di massa e le orientazioni relative Chl-Car. Questa volta però abbiamo confrontato due dinamiche, una con Violaxantina ed una con Zeaxantina in modo da riprodurre la situazione prima e dopo il ciclo delle Xantofille. I risultati ottenuti sembrano supportare l’ipotesi proposta da Polivka e Frank [32] che la de-epossidazione di Violaxantina favorisca il trasferimento energetico a favore del carotenoide. Ripetendo infatti la stessa analisi sostituendo nel cluster Zeaxantina a Violaxantina, che è la situazione in vivo a seguito del ciclo delle Xantofille, ci aspettiamo di notare variazioni sia nei valori delle distanze interpigmento che in quelli del parametro orientazionale “k”. L’analisi di questi dati conferma che i parametri “distanza” e “orientazione” sono influenzati dalla struttura del carotenoide: infatti la distanza diminuisce per CLA 602 e CLA 603 coerentemente con l’assunzione che passando da Violaxantina a Zeaxantina diminuiscono le interazioni cromoforo-carotenoide. Per lo stesso motivo ma in senso opposto, CLA 604 risulta più lontana. Anche l’analisi del parametro orientazionale per CLA 602 e CLA 603 diminuisce indicando che più la clorofilla è vicina al
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carotenoide e meno è libera di ruotare.
Il modello descrittivo fin qui adottato funziona bene quando i trasferimenti di energia coinvolgono eccitazioni a stati di singoletto caratterizzati da dipoli di transizione significativi. Non può però essere utilizzato per descrivere i trasferimenti di tripletto coinvolti nei processi NPQ poiché i dipoli di transizione sono nulli. In questo caso gli