Diagnostica di laboratorio

La diagnosi definitiva di polmonite da R. equi è possibile farla con:

1. coltura batterica,

2. indagine immunoistochimica su reperti anatomo-patologici usando anticorpi specifici per gli antigeni 15-17 kDa di R. equi,

3. Immunocitochimica,

4. Polymerase Chain Reaction (PCR) da lavaggio trans-tracheale o BAL,

5. test sierologici:

• immunodiffusione in gel di agar (AGID),

• ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay),

1. Batteriologia

Tutti i metodi considerati per il prelievo offrono vantaggi e svantaggi e le secrezioni ottenute da cavalli sani permettono l’isolamento di batteri patogeni, transitori e commensali. In uno studio solo il 50% dei soggetti con esame colturale positivo aveva un quadro citologico indicante un processo infiammatorio profondo (Whitwell e Greet, 1984). L’aspirato trans-tracheale, anche se ritenuta la metodica più adatta per l’esame batteriologico, può essere contaminato da batteri commensali della pelle, quali lo Staphylococcus epidermidis, Bacillus sp., o Enterobacter sp. (Sweeney et al., 1985); anche dal BAL di cavalli sani possono essere ottenute colonie batteriche con numero limitato di CFU (Fogarty e Buckley, 1991).

La presenza di squame e batteri adesi indica sempre contaminazione, pertanto, in tal caso, il risultato dell’esame batteriologico dovrebbe essere ignorato (Viel et al., 1999). Altro metodo di prelievo è quello tramite brush protetto, il campione ottenuto può fornire risultati specifici, ma è meno sensibile degli altri metodi di prelievo (Hoffman et al., 1993).

Comunque sia ogni risultato positivo deve essere interpretato alla luce dell’esame clinico, radiologico, ecografico e dell’esame citologico. In particolare l’esame batteriologico dovrebbe essere eseguito soltanto nei soggetti clinicamente malati con sintomi quali febbre, abbattimento, tachipnea, rumori respiratori alterati all’auscultazione, presenza di scolo nasale, esame radiografico e/o ecografico anormali. Inoltre la positività della coltura batterica dovrebbe essere ritenuta significativa se il batterio isolato è un patogeno dell’apparato respiratorio, se si è verificata una crescita batterica consistente e l’esame citologico il quadro di un’infiammazione suppurativa.

La quantificazione batterica ha senso solo nei prelievi eseguiti senza infusione di soluzione fisiologica. Nel caso dei veri patogeni il batterio frequentemente cresce in coltura pura con oltre 106 CFU/ml, mentre le colture miste con meno di 104 CFU/ml non sono considerate rappresentative (Dixon, 1997).

2. Immunoistochimica (Madarame et al., 1996; Takai et al., 1994; Mariotti et al., 2000; Cuteri et al., 2000).

Immunoistochimicamente, R. equi isolato dalle lesioni polmonari mostra l’espressione di antigeni 15-17-kd specialmente nelle cellule fagocitiche. Il rilevamento di specifici anticorpi monoclonali per questi antigeni può essere d’aiuto per la diagnosi di polmonite indotta da R. equi. In uno studio è stato dimostrato che il metodo immunoistochimico risulta avere la stessa sensibilità della coltura batterica e che quindi questa tecnica può essere utilizzata per il rilevamento rapido di R. equi su strisci di materiale

3. Immunocitochimica (Sonmez et al., 2011)

L’immunocitochimica per la rapida identificazione di R. equi è stata

valutata in un recente studio su strisci di aspirato tracheale di puledri di età compresa tra 1 e 5 mesi. In questo studio sono stati inclusi 56 soggetti che presentavano segni clinici riconducibili a infezione da R. equi, e 54 soggetti controllo. Quindi sono stati messi a confronto il test sierologico ELISA e l’immunocitochimica ed è stato visto che non esistono sostanziali

4. PCR (Farber JM, 1996 ; Sellon DC et al., 2001; Arriga JM et al. 2002) Esistono diverse metodiche di PCR messe a punto per questo scopo, ma la

più attendibile è quella che viene effettuata con due coppie di primers, una che amplifica la regione di RNA ribosomiale16S, gene specifico per R.

equi, ed un’altra che amplifica una regione del plasmide 85-90 kb, tipica

del ceppo virulento di R. equi. Il vantaggio, rispetto all’isolamento, è dato dalla rapidità con cui viene effettuata l’identificazione e la certezza che si tratti del ceppo plasmidico di R. equi.

E’ possibile ricorrere all’uso di primers per il solo plasmide, riducendo i costi della metodica, ma in tal modo aumenta la possibilità di avere risultati falsi positivi a causa della presenza della stessa sequenza plasmidica in altre specie batteriche; inoltre il DNA plasmidico è meno stabile del DNA cromosomico e la perdita di stabilità potrebbe dare risultati falsi negativi.

La PCR è maggiormente sensibile rispetto all’isolamento e non risente dell’effetto degli antibiotici, qualora siano stati somministrati, ed evidenzia anche i batteri residenti nei macrofagi, che invece non possono essere ritrovati col semplice esame batteriologico di routine. La PCR ha particolare valore quando la concentrazione dei batteri è bassa e l’isolamento risulta difficile. Tuttavia, a causa dell'alta specificità della metodica, c’è il pericolo di risultati falsi positivi a causa della contaminazione dei campioni da parte di R. equi presenti nell’ambiente e un ulteriore limite della tecnica sono i costi più elevati rispetto ad un esame batteriologico.

5. Tests sierologici (Martens et al. 2002; Gaskin et al. 1990; Farina e

Scatozza, 1998; Navas et al., 2001; Linder e Bernheimer, 1997; Shalka B., 1987; Shalka e Svastova, 1985; Giguère e Prescott, 1997; Ellenberger et al., 1984; Taouji et al., 2002; Prescott et al., 1996; Cuteri et al., 2003; Attili et al., 2006)

Il test AGID rivela la presenza di anticorpi precipitanti e l’antigene usato è rappresentato da antigeni solubili, costituiti dagli enzimi extracellulari, e cioè colesterolo-ossidasi e fosfolipasi, e alcuni antigeni somatici, incluse le proteine Vaps. La maggior parte dei soggetti adulti sono negativi per gli anticorpi precipitanti ed inoltre non risultano falsi positivi per la presenza di anticorpi di origine materna. La comparsa di questi anticorpi svelati dall'AGID viene segnalata a partire da 26 giorni nei puledri e la loro scomparsa viene riportata dopo 2-6 settimane dall’inizio della terapia antibiotica.

Il test SHI valuta principalmente la presenza di anticorpi nei confronti dei due esoenzimi prodotti da R. equi, i quali, interagendo con la D-fosfolipasi di Corynebacterium pseudotuberculosis oppure con la β-tossina di

Staphylococcus aureus o l’emolisina di Listeria monocytogenes, danno

emolisi completa degli eritrociti di pecora, bovino e coniglio. La presenza di questi anticorpi risulta nell’inibizione di questa emolisi sinergica. Il metodo non sembra essere in grado di svelare stadi precoci di infezione; ha invece valore per dimostrare l’ampia diffusione delle infezioni subcliniche nei puledri. E’ maggiormente sensibile rispetto all’AGID, ma richiede maggior lavoro per essere eseguita.

I test ELISA sono di diversi tipi e variano a seconda degli antigeni utilizzati. I primi test ELISA, eseguiti con antigeni poco specifici, hanno

consentito di evidenziare che gli anticorpi nei confronti di R. equi siano molto diffusi nella popolazione equina e che non ci sia alcuna correlazione tra titoli anticorpali e malattia clinica. Antigeni più specifici sono stati ottenuti usando per l’estrazione dei detergenti come il Tween 20 o il Triton X-114 e in genere in questi antigeni prevale il VapA, che può essere estratto a diversi livelli di purezza. Un test ELISA, che utilizza, come antigene, materiale cellulare completo, con predominanza di VapA, ha mostrato sieroconversione in puledri clinicamente sani tra le 8 e le 10 settimane di età e sieroconversione in puledri infettati sperimentalmente col ceppo virulento dopo 2 settimane, cosa non verificatasi col ceppo avirulento. Recentemente è stato visto che c’è differenza tra un test ELISA eseguito con antigene di R. equi completo e un test ELISA eseguito con un determinato peptide di VapA: il primo è meno sensibile e la spiegazione potrebbe essere che, dal momento che R. equi è ubiquitario nell’ambiente e la maggior parte degli isolati sono avirulenti, i risultati falsi positivi siano dovuti al ritrovamento di anticorpi specifici per altre proteine piuttosto che per VapA. La purezza dell’antigene di questo test ELISA e i suoi migliori risultati forse sono dovuti al fatto che vi sono alcune di queste proteine associate alla virulenza più indicative di altre in corso di malattia, come, per esempio, si ritiene sia il caso di VapA, ma ancora poco è conosciuto dell’importanza dei singoli antigeni Vaps e delle loro correlazioni antigeniche. Ancora non sono disponibili test ELISA per i singoli Vaps a causa della loro recente scoperta e ancora non se ne conosce il valore dal punto di vista della virulenza. È stato proposto anche un test ELISA da eseguirsi su aspirato tracheale per svelare la presenza di anticorpi mucosali, la cui presenza si suppone inizi, e sia protettiva, al momento dell’infezione attiva. La grande varietà dei test ELISA è dovuta al fatto che fino ad ora

nessuno di essi ha dato risultati pienamente soddisfacenti per la diagnosi di

R. equi.

Tutte le prove sierologiche per R. equi hanno generalmente una bassa sensibilità e specificità, tanto da far ritenere che tali prove abbiano valore solo per svelare un’esposizione all’agente eziologico a livello di allevamento e non a livello individuale. Dare un significato diagnostico ai test sierologici provocherebbe o una sovrastima della malattia o una perdita di evidenziazione dei soggetti infetti ai primi stadi d’infezione. Vi è una differenza di sensibilità e specificità tra i singoli test sierologici, che tuttavia rende utili le singole prove a seconda del contesto epidemiologico e clinico in cui ci si trova: una maggiore sensibilità è richiesta quando è importante non perdere una diagnosi, mentre una maggiore specificità quando è necessario confermare una diagnosi.

Nessuna di queste prove è in grado di svelare l’infezione nelle prime fasi di insorgenza, la qual cosa è invece un obiettivo importante, in quanto consente di intraprendere una terapia antibiotica prima della comparsa dei sintomi clinici, ossia quando la malattia è ormai ad uno stadio avanzato. La semplice sieroconversione non può essere un elemento per fare diagnosi. Ricorrere al prelievo di un doppio campione a distanza di 2-3 settimane per svelare un aumento del titolo anticorpale ha poco valore in una malattia come questa in cui i sintomi clinici compaiono anche a notevole distanza di tempo dall’inizio dell’infezione e in cui il picco anticorpale può non presentarsi a causa del consumo degli anticorpi. In genere la sieroconversione ha più un valore retrospettivo per i tempi che richiede per essere eseguita.

2.1.2.4. Miscellanea (Sellon e Long, 2007)

Diversi altri batteri possono essere responsabili di patologie polmonari. Tra questi possiamo includere: Actinobacillus spp, Bordetella bronchiseptica,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pasteurella spp, Pseudomonas

spp, Salmonella spp e Staphylococcus spp.

Actinobacillus spp

E’ responsabile di gravi processi settici che colpiscono in particolar modo i puledri neonati. Gram-negativo, sprovvisto di capsula e ciglia, è relativamente termolabile e sensibile ai comuni disinfettanti. È ritenuto commensale dell’intestino e del nasofaringe del cavallo. L’infezione avviene attraverso la penetrazione del batterio per via digerente o attraverso il cordone ombelicale. Nei puledri provoca fenomeni settici a rapida evoluzione e con esito spesso letale. Gli animali presentano febbre elevata, anoressia, depressione, diarrea e turbe respiratorie. Nelle forme a decorso protratto si riscontrano anche nefrite e artrite.

Escherichia coli

Microrganismo di forma allungata, Gram-negativo, anaerobio facoltativo. È responsabile di enteriti o setticemia nel puledro e di metriti post-partum nella giumenta. L’infezione si stabilisce per via orale, nasale od ombelicale. La forma setticemica compare entro 3-4 giorni dalla nascita, ha andamento iperacuto ed esito rapidamente letale. I soggetti colpiti presentano febbre elevata di breve durata, incapacità di mantenersi in piedi, dispnea, polso debole, tensione addominale e segni di colica.

Salmonella

Nel genere Salmonella sono compresi microrganismi di forma bastoncellare, Gram-negativo, responsabile di gastroenteriti, setticemie, polmoniti e aborto. Il puledro si può infettare in utero oppure per via digerente, nasale e ombelicale. L’azione patogena di esprime con la liberazione da parte dei batteri di endotossine che vengono assorbite per via enterica e provocano una sintomatologia generale caratteristica degli stati endotossiemici. Vengono colpiti in prevalenza puledri di 2-3 settimane nei quali si riscontrano febbre, anoressia, diarrea persistente, poliatriti e ascessi sottocutanei e polmonari. L’esito è spesso letale.

Pasteurella

Il genere Pateurella comprende microrganismi bastoncellari o coccoidi, Gram-negativi, responsabili di setticemia o affezioni respiratorie secondarie a infezioni virali (riniti, broncopolmoniti). Nel puledro l’infezione comporta la presenza di tosse produttiva, febbre, anoressia e depressione del sensorio.

Pseudomonas spp

Il genere Pseudomonas comprende microrganismi bastoncellari, Gram- negativi, frequentemente coinvolti in situazioni patologiche sostenute in via primaria da altri patogeni e si estrinseca in flogosi a carattere purulento, spesso ad esito letale. Il batterio può penetrare a livello delle vie respiratorie, dell’apparato digerente e del genitale. È causa di febbre elevata, depressione, anoressia e andatura incerta.