Materiali e metod

Lo scopo del presente lavoro è quello di valutare l'utilità della citologia, della coltura batteriologica e della PCR eseguiti sul liquido broncoalveolare (BALF) nei puledri con ascessi periferici polmonari rivelati attraverso ecografia toracica.

1.1. Animali

In questo studio sono stati inclusi 18 puledri trottatori, 10 maschi e 8 femmine, di età compresa tra 1 e 4,5 mesi, con ascessi periferici del polmone diagnosticati con l'ecografia toracica (Falco, Esaote, Firenze; sonda convex da 5 MHz).

I puledri sono nati nel periodo gennaio-luglio delle stagioni di monta 2009- 2010 presso allevamenti siti nella regione Toscana.

Criteri di inclusione:

1) gravidanza di 335±15 gg;

2) parto eutocico;

3) fattrici trattate per parassitosi gastro-intestinali e vaccinate per influenza equina, tetano e EHV 1 e 4 in accordo con le linee guida dell'American Association Equine Practitioners Infectious Disease Committee (http://www.aaep.org/vaccination_guidelines.htm);

4) Apgar Score 5 minutes dopo la nascita ≥7 (Vaala, 1994; Palmer, 2007);

5) IgG a 24h ≥800mg/dl (SNAP Foal, IDEXX, USA);

6) riflesso si alzare la testa immediato dopo la nascita, riflesso di suzione entro 10 minuti, decubito sternale entro 10 minuti, stazione quadrupedale entro 60 minuti, prima poppata entro 120 minuti (Stoneham, 2006).

Tutti i puledri sono nati in boxes 4x4 m con lettiera in paglia e ivi sono stati alloggiati con la madre fino a 15 giorni di età, quindi sono stati messi in paddocks 20x30 m insieme ad altre coppie di fattrice-redo.

Sintomatologia clinica

Segni clinici comuni a tutti sono stati: a. tosse persistente,

b. tachipnea,

c. asprezza dei suoni polmonari.

Alcuni puledri hanno mostrato febbre, scolo nasale, depressione, e/o anoressia.

1.2. Materiali

Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato effettuato in tutti i soggetti in stazione quadrupedale e non sedati, ma soltanto contenuti manualmente o, per i puledri più grandi, con torcinaso.

Il BAL è stato eseguito alla cieca utilizzando un catetere Bivona (Cook, USA) sterile lungo 300 cm e cuffiabile. Il catetere è stato fatto passare attraverso il meato ventrale della narice destra o sinistra. Il passaggio in trachea è stato controllato mediante palpazione della trachea.

Al fine di evitare il riflesso tussigeno è stata instillata lidocaina diluita con soluzione fisiologica sterile 1:1 attraverso il catetere con conseguente desensibilizzazione della mucosa respiratoria.

Il catetere viene fatto procedere lungo il tratto respiratorio fino a che il suo diametro non risulta uguale al bronco di III o IV generazione in cui è alloggiato. Quindi il Bivona è stato cuffiato con circa 10 cc di aria ed è stata istillata soluzione fisiologica preriscaldata a 37 °C. Una volta instillata, la soluzione fisiologica è stata immediatamente recuperata ed il campione è stato raccolto in provette con EDTA per la citologia e in provette sterili senza anticoagulante per la batteriologia e le indagini biomolecolari; sono poi stati conservati a 4 ° C e trattati entro 2 ore.

1.3. Metodi

Citologia

I campioni raccolti in EDTA sono stati utilizzati per la conta cellulare (media di 5 letture) su contaglobuli (HecoVet, Seac, Firenze) quindi e citocentrifugati (4 vetrini per soggetto) (CYTOFUGE2, USA).

I preparati così ottenuti sono stati fissati all’aria e colorati con Diff Quick (DADA, Milano). Per ogni campione sono state contate 400 cellule e ottenute le percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili, eosinofili e mastociti. La lettura è stata sempre eseguita da tre operatori ed è stata calcolata la media delle percentuali ottenute.

La diagnosi di polmonite è stata emessa nei soggetti con un numero di cellule totali/µl superiore a 300 e una maggiore percentuale di neutrofili con segni di tossicità (Hodgson e Hodgson, 2003).

Analisi statistica

La media (X) e la deviazione standard (DS) sono state calcolate sia sul numero totale di cellule/µl, sia sulle percentuali di macrofagi, linfociti, neutrofili, eosinofili.

Batteriologia

I campioni di BALF sono stati esaminati su terreno NANAT posto in incubazione a 30°C per 48-72 ore, su Agar sangue con e senza supplemento selettivo per Streptococcus, su Agar sale-mannitolo e MacConkey.

Le colonie riconducibili a R. equi sono state trapiantate su Muller-Hinton Agar (Oxoid, Milano), processate per l’identificazione biochimica mediante APICoryne (Biomérieux, Milano) ed inoltre utilizzate per la tipizzazione molecolare.

Esame Bio-Molecolare

Le indagini bio-molecolari sono state finalizzate in primo luogo alla ricerca nel campione di partenza di una sequenza specifica di R. equi. I campioni risultati positivi a questa prima indagine sono stati sottoposti ad ulteriori PCR per identificare l’eventuale presenza dei fattori di patogenicità di R.

equi (Laus et al., 2007).

Estrazione del DNA

Per l’estrazione del DNA dai campioni di aspirato tracheale, dopo opportuna agitazione, 100µl del campione sono stati trasferiti in una provetta contenente 4 ml di Trypticase Soy Broth (Oxoid, Milano) ed incubati in termostato a 37°C per 8-20 ore, a seconda dell’ora di ricevimento del campione.

Per lisare la parete batterica, 1,5 ml di brodo di arricchimento sono stati trasferiti in provette Eppendorf e centrifugati a 21255 x g per 10 min. Il pellet ottenuto è stato risospeso in 25µl di digestion buffer (Tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, pH 8.0) contenente 5 U/ml di lisozima (Sigma, Milano, Italy) e incubato per 90 min. a 37°C in bagno termostatato oscillante. Successivamente sono stati aggiunti 0.75 ml di proteinasi K 20 mg/ml (Eurobio, Courtaboeuf Cedex B, France) e la soluzione è stata mantenuta in incubazione a 56°C per 90 min. Per inattivare la proteinasi K, i campioni sono stati incubati a 100°C per 10 min. Dopo centrifugazione a 10844 x g per 5 min. il surnatante è stato trasferito in una nuova provetta Eppendorf ed utilizzato per la PCR.

in 50 µl di digestion buffer e sottoposte ai trattamenti sopra descritti per lisare la parete cellulare ed estrarre il DNA.

PCR

Il DNA estratto sia dai campioni di aspirato tracheale, incubati in brodo di arricchimento, sia dalle colonie, è stato utilizzato per le indagini di PCR. In primo luogo i campioni sono stati sottoposti a PCR impiegando la coppia di primer COX-F/COX-R per la sequenza dell’enzima colesterolo-esterasi specifica di R. equi (154) (tab. 2). Nel caso di risultato positivo, lo stesso campione di DNA è stato utilizzato in prove di PCR impiegando i primer IP1-F/IP2-R e vapB-F/ vapB-R per l’identificazione rispettivamente dei plasmidi di patogenicità VapA e VapB di R. equi (tab. 2).

Per ogni reazione, il mix di PCR era costituito da mastermix 1x (Taq PCR mastermix, Qiagen, Hilden, Germany), 10 pmol di ogni primer (Operon Biotechnologies, Cologne, Germany) e 3 ml del DNA estratto. Il protocollo di amplificazione consisteva in: 5 min. a 95°C, 35 x [30 sec. a 95°C, 30 sec. a 59°C per COX-F/COX-R o a 55°C per IP1-F/IP2-R e vapB-F/ vapB- R, 40 sec. a 72°C], 7 min. a 72°C. Per ogni PCR venivano impiegati un controllo positivo, rappresentato da ceppi di R. equi contenenti rispettivamente i plasmidi vapA e vapB (ceppi forniti dal prof. S. Takai, Kitasato University, Japan), ed un controllo negativo consistente nella sostituzione del DNA del campione con acqua.

Gli amplificati sono stati visualizzati mediante elettroforesi di 10µl di prodotto in gel di Agarosio al 2%. Come marker di peso molecolare è stato utilizzato un ladder 100bp (Fermentas GMBH, St. Leon-Rot, Germany).

Tabella 2 - Specifiche dei primer utilizzati nelle prove di PCR

target/primer sequenza annealing amplificato bibliografia

Colesterolo-esterasi

COX-F

COX-R

5’-GTC AAC AAC ATC GAC CAG GCG-3’

5’-CGA GCC GTC CAC GAC GTA CAG-3’ 59°C 959 bp Ladron et al., 2003 vapA IP1-F IP2-R

5’-GAC TCT TCA CAA GAC GGT-3’

5’-TAG GCG TTG TGC CAG CTA-3’

55°C 568 bp Takai et al., 1998 vapB vapB-F vapB-R 5’- AACGTAGTCGCGGTGAGAA -3’ 5’- ACCGAGACTTGAGCGACTA-3’ 55°C 826 bp Takai et al., 2004

In base alla positività a R. equi o ad altri batteri, il gruppo totale dei puledri è stato suddiviso in 2 gruppi:

- gruppo 1: positivi a R. equi; - gruppo 2: positivi ad altri batteri.

2. Risultati

Batteriologia e PCR

Alla coltura batteriologica 7/18 (39%) puledri risultati positivi a R. equi (gruppo 1), mentre 11/18 (61%) sono risultati positivi ad altri agenti patogeni (gruppo 2).

Nel gruppo 1, 4 erano femmine (57%) e 3 maschi (43%), l'età era compresa tra 1,5 e 5 mesi, con una mediana di 2 mesi.

Nel gruppo 2, 4 erano femmine (36%) e 7 maschi (64%), l'età era compresa tra 1 e 4,5 mesi, con una mediana di 2,5 mesi. Degli 11 puledri appartenenti al gruppo 2, 5/11 (45%) presentavano 2 o più batteri differenti contemporaneamente. In particolare 4/5 (80%) erano infettati da 2 tipi di batterio: 1/4 (25%) Staphylococcus spp e Proteus spp; 1/4 (25%)

Corynebacterium spp. Pseudomonas spp.; 1/4 (25%) Staphylococcus spp e

Serratia marcescens; 1/4 (25%) Streptococcus spp. ed Escherichia coli. Un solo soggetto su 5 (20%) era infettato da 3 tipi di batterio: Streptococcus spp., Escherichia coli e Staphylococcus spp. 6/11 puledri (56%) erano infettati da un unico tipo di batterio. In particolare, da 3/6 (50%) puledri è stato isolato uno Staphylococcus spp., e in 3/6 (50%) uno Streptococcus spp.

Citologia

Per quanto riguarda il gruppo 1, la X±DS della conta totale cellulare (cell/µl) della conta differenziale di macrofagi (%), linfociti (%), neutrofili (%) ed eosinofili (%), sono risultate: 1457,1±946,6 cell/µl; 47,8±16,9%; 6,8±3,2%; 45±17,8%; 0,7±0,7%.

In puledri con polmonite batterica causata da altri batteri (gruppo 2), invece, la X±DS della conta totale cellulare (cell/µl) della conta differenziale di macrofagi (%), linfociti (%), neutrofili (%) ed eosinofili (%), sono risultate: 477,2±173,7; 64,4±10,5%; 14,9±6,9%; 19,8±10,6% e 1,09±1,6%.