L’immunoistochimica è stata probabilmente la tecnica che più di tutte ha rivoluzionato negli ultimi 50 anni la diagnostica in ambito anatomopatologico, fornendo al patologo un valido strumento per formulare diagnosi esatte ed affidabili. Tra i suoi vantaggi vanno citati la notevole sensibilità e specificità, la possibilità di applicare la tecnica su materiale processato secondo la routine e l’accurata correlazione con i classici parametri morfologici. Inoltre l’immunoistochimica è compatibile con la maggior parte dei fissativi attualmente in uso, pertanto rappresenta la tecnica più largamente impiegata e il “gold
standard” in diagnostica.
L’immunoistochimica, oltre all’istologia, può essere applicata alla citologia ed in questo caso è più opportuno parlare di immunocitochimica.
Il principale ambito in cui l’immunocitochimica riveste un ruolo di primaria importanza è nella diagnosi differenziale nei versamenti sierosi in quanto consente di discriminare il citotipo delle cellule in un versamento (cellule mesoteliali da epiteliali). Consente inoltre di caratterizzare neoplasie non epiteliali in linfomi, melanomi e sarcomi.
Inoltre questa tecnica può essere di ausilio al clinico poiché ci orienta per quanto riguarda la primitività della neoplasia in casi di tumori epiteliali, e ciò risulta essere particolarmente rilevante nei casi in cui il versamento rappresenta la prima manifestazione clinica.
Per quanto riguarda la distinzione dei casi di mesotelio reattivo versus mesotelio neoplastico, il nostro Istituto non presenta una casistica sufficientemente elevata di mesoteliomi, in quanto i campioni citologici di tali neoplasie sono generalmente inviati ai centri di riferimento specializzati in regione.
Molti studi hanno dimostrato che l’identificazione immunocitochimica dell’origine di una neoplasia può essere possibile grazie all’aiuto offerto da opportuni pannelli di anticorpi. Infatti, l’accuratezza diagnostica è migliorata grazie alla combinazione dell’uso della microscopia ottica, che rileva le caratteristiche morfologiche delle cellule dei versamenti e all’utilizzo dei pannelli anticorpali che includono anticorpi capaci di riconoscere marcatori organo-specifici.
Le applicazioni dell’immunocitochimica comprendono la diagnosi differenziale in neoplasie poco differenziate e in lesioni metastatiche in citologia agoaspirativa nonché l’identificazione di fattori prognostici e predittivi in citologia agoaspirativa mammaria [18].
A differenza dell’immunoistochimica, l’immunocitochimica presenta alcune limitazioni, tra le quali maggior importanza assume il processo di fissazione, indispensabile per evitare i processi di degenerazione cellulare che comportano alterazioni morfologiche ed antigeniche e possono compromettere l’interpretazione del campione. Infatti nonostante l’immunocitochimica sia una tecnica ormai largamente impiegata in diversi Istituti, non è nota, contrariamente all’immunoistochimica, la validità ed affidabilità di alcuni fissativi e dei protocolli utilizzati nonché in letteratura non ci sono sostanzialmente studi a riguardo. Per tale motivo abbiamo intrapreso uno studio volto alla validazione di questa tecnica secondo il fissativo ed il protocollo messo a punto presso il nostro Istituto.
La necessità di validare questa metodica deriva dal fatto che sta acquisendo sempre maggiore importanza in ambito diagnostico, soprattutto nella citologia dei versamenti cavitari.
Il fissativo è cruciale per una buona riuscita della reazione: in immunoistochimica il fissativo ritenuto più idoneo, nonché più utilizzato a livello internazionale, è la formalina, mentre per quanto concerne l’immunocitochimica ad oggi non è conosciuto alcun fissativo che possa essere considerato “migliore” degli altri e per tale motivo spesso ogni laboratorio utilizza quello che ritiene più adeguato, senza una reale e documentata standardizzazione sulle modalità di fissazione dei campioni su cui eseguire l’immunocolorazione.
Nel nostro Istituto, per la fissazione dei liquidi di versamento, viene utilizzata la miscela fissativa CytoRich i cui principali componenti sono una combinazione di alcoli e formaldeide. Tale fissativo è comunemente utilizzato in molti laboratori e spesso ne viene riportato l’impiego in diverse pubblicazioni come ad esempio in studi condotti da Hansen et al [50], da Davis-Devine et al [51], e da Weidmann et al[52], ma nessuno studio ha mai validato questo fissativo in immunocitochimica. La scelta di CytoRich è riconducibile al fatto che garantisce buona conservazione delle cellule, mantiene l’integrità di quest’ultime e permette di conservarle adeguatamente per ulteriori studi ancillari. Uno degli scopi di questo studio è stato quindi di verificare le potenzialità di questo fissativo al fine di poterne valutare l’affidabilità soprattutto in tecniche come l’immunocitochimica, validando per la prima volta il protocollo operativo per questo tipo di immunocolorazione.
La validazione di un nuovo protocollo comporta che questo venga confrontato con una metodica di riferimento, riconosciuta come tale da opportuni organismi nazionali ed internazionali. Nello studio in questione il “gold standard” è rappresentato dall’immunoistochimica eseguita sui corrispondenti campioni tissutali fissati in formalina.
La prima fase dello studio è stata indirizzata alla validazione del protocollo impiegato in immunocitochimica: è stata fatta perciò la validazione della metodica sui mesoteli e successivamente su tumori di origine epiteliale utilizzando un opportuno pannello di anticorpi in grado di discriminare le cellule epiteliali da quelle mesoteliali.
Dall'analisi statistica è emerso un elevato grado di concordanza tra immunoistochimica ed immunocitochimica per la maggior parte degli anticorpi impiegati in questo studio, ed in particolare, il pannello di anticorpi utilizzato nel nostro Istituto per discriminare le cellule mesoteliali da quelle epiteliali in un versamento, risulta essere estremamente affidabile. In conclusione, per quanto concerne la prima parte di questa ricerca, possiamo affermare che vista la totale assenza di differenza significativa delle immunocolorazioni su campione istologico e citologico, l’immunocitochimica può essere considerata una tecnica valida, affidabile nonché equiparabile all’immunoistochimica; tale affermazione è legittima solo per quanto concerne il protocollo impiegato nel nostro Istituto e descritto in questo studio, con particolare riferimento alle modalità di fissazione dei campioni e alle diverse fasi della processazione. Inoltre si è potuta verificare l’adeguatezza del fissativo impiegato per i liquidi di versamento ed in base ai risultati ottenuti si può affermare che il fissativo utilizzato nel nostro Istituto, CytoRich Red Collection Fluid (Thermo Scientific Shandon), oltre a garantire buona conservazione delle cellule mantenendole al contempo integre, come confermato anche da Hansen et al [50] è un fissativo adeguato per le reazioni di immunocitochimica, per tale motivo si consiglia il suo impiego nella routine.
La seconda parte dello studio è stata finalizzata alla valutazione delle performance diagnostiche in termini di sensibilità e specificità dei pannelli anticorpali impiegati per la discriminazione delle cellule mesoteliali da quelle epiteliali, sia su prelievo citologico che sul corrispettivo prelievo istologico.
Da una prima analisi dei dati emerge che gli anticorpi MOC-31, D2-40, e Calretinina presentano elevata sensibilità e specificità, rispettivamente pari al 99.08% per il MOC-31, e 100% per D2-40 e Calretinina, in accordo con quanto osservato da Hyun et al [53], in uno studio volto ad evidenziare gli anticorpi più adatti a discriminare i mesoteliomi dagli adenocarcinomi nella citologia dei versamenti pleurici.
In accordo con studi effettuati da Ikeda et al [54] il D2-40, la Calretinina sono anticorpi che presentano un'eccellente sensibilità nel riconoscimento delle cellule mesoteliali, il MOC-31 ha una buona sensibilità nel riconoscimento degli epiteli mentre la sensibilità del CEA, che è sempre un marcatore di epiteli, è tendenzialmente bassa, confermata dai risultati del nostro studio, nei quali è risultata esser pari a 84.21%, ma con una eccellente specificità
In disaccordo con lo studio di Murugan et al [55] che sostengono il CEA presenti scarsa specificità ed eccellente sensibilità, dalla nostra ricerca emerge invece elevata specificità e piuttosto bassa sensibilità dell’anticorpo. Confrontando invece la Calretinina con il medesimo studio emergono valori di sensibilità e specificità simili.
L’utilizzo di un pannello di anticorpi in grado di discriminare cellule epiteliali da mesoteliali
in un versamento è fondamentale per poter comprendere la causa e l’origine del versamento stesso, ed è opportuno utilizzare sempre più anticorpi in grado di riconoscere sia epitelio che mesotelio al fine di avere sempre una doppia conferma in quanto non esiste anticorpo che da solo abbia sensibilità e specificità sufficiente, come spiegato da Hyun et al [53]. Il comportamento degli anticorpi deve essere noto a priori ed è opportuno utilizzare sempre anticorpi che colorano e non colorano sicuramente i diversi citotipi che si è interessati a differenziare. Il pannello di anticorpi utilizzato nel nostro Istituto, seppure diverso da quello di Murugan et al [55], è stato messo a punto in base ai medesimi principi e lo studio intrapreso ha evidenziato la sua indubbia utilità e validità.
In seguito si son presi in considerazione unicamente i casi di carcinomi per identificare i pannelli anticorpali con miglior performance citologica in termini di sensibilità e specificità, che risultano più utili alla diagnosi clinica nell’indicare l’origine della neoplasia che ha generato il versamento.
I pannelli da noi scelti e utilizzati per l’identificazione degli adenocarcinomi polmonari, per i carcinomi del tratto gastroenterico, per i carcinomi del tratto genitale femminile, per i carcinomi della mammella hanno tutti dimostrato ottimi valori di sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e negativo.
Riassumendo, siamo partiti dall’utilizzo di un pannello che ci ha permesso di differenziare le cellule epiteliali dalle mesoteliali e siamo stati in grado di definire l’origine più probabile delle neoplasie epiteliali mediante l’ausilio di ulteriori anticorpi organo-specifici, tipizzando le varie neoplasie, basandoci unicamente su criteri citologici/morfologici e immunoistochimici.
La citologia può quindi essere considerata, in base alle tecniche di fissazione e ai protocolli impiegati nel nostro Istituto, un valido strumento per fare diagnosi.
I risultati raggiunti con questo studio rappresentano indubbiamente un importante passo in avanti nella comprensione dell’importanza della citologia in ambito diagnostico e sono le fondamenta per ulteriori approfondimenti volti a confermare l’importanza dell’immunocitochimica nella diagnosi dei versamenti cavitari.
ICONOGRAFIA
Fig. 1 Mesotelioma pleurico, versamento pleurico, espressione di D2-40 in citologia
Fig. 2 Mesotelioma pleurico, versamento pleurico, espressione della Calretinina in
Fig. 3 Adenocarcinoma sieroso, versamento pleurico, espressione di MOC-31 in
citologia (Immunoperossidasi-ematossilina, 630X).
Fig. 4 Adenocarcinoma duttale, versamento pleurico, espressione di CEA in
Fig. 6 Adenocarcinoma sieroso, versamento peritoneale, espressione di CK7 in
citologia (Immunoperossidasi-ematossilina, 630X).
Fig. 5 Adenocarcinoma sieroso, versamento peritoneale, espressione di WT-1 in
Fig. 7 Adenocarcinoma mucinoso, versamento peritoneale, espressione di CK20 in
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