Uno dei principali problemi connessi con il trattamento dei reflui dell’industria tessile è rappresentato dal colore, derivante dai residui dei bagni di tintura. I metodi maggiormente utilizzati per il risanamento dei reflui dell’industria tessile sono di origine chimico/ fisica. Recentemente, però, la ricerca si sta dirigendo verso trattamenti di tipo biologico come il biorisanamento, che prevede l’utilizzo di microrganismi in grado di eliminare il colorante dalle acque usate nei processi di tintura. I vantaggi dell’utilizzo di questa tecnologia sono molteplici e consistono nel basso costo di applicazione, in un minore impatto ambientale e risultano favorevolmente accettati da parte dell’opinione pubblica (Banat et al. 1996).
Una nuova classe di coloranti è rappresentata dai coloranti azoici glicosilati (GADs), coloranti potenzialmente utilizzabili nei processi di colorazione tessile (Bartalucci et al., 2007; Bianchini et al., 2008). La possibilità di degradazione del colorante GAD da parte di un fungo filamentoso, F. oxysporum 3618, è il risultato di una serie di attività di ricerca descritte in Porri et al. (2011). Questo lavoro ha posto le basi per la presente attività di ricerca volta ad investigare i meccanismi coinvolti nella degradazione del colorante GAD da parte dell’isolato fungino F. oxysporum 3618, con particolare riferimento al possibile coinvolgimento delle Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) in generale e del radicale idrossilico in particolare. Già in Porri et al. (2011) si è arrivati ad escludere un coinvolgimento di enzimi extra-cellulari nel processo degradativo, lasciando aperta la possibilità che il meccanismo d’azione che permette all’isolato 3618 di abbattere il GAD deve essere di altra natura. Nell’elaborato finale di Fiorini Lisa (2010) era stata allestita una prova preliminare in presenza di inibitori di perossidasi, citocromo P450 e antiossidanti, dalla quale si sono ottenute le indicazioni circa un probabile coinvolgimento dei ROS nella degradazione del GAD. Già in Veignie et al. (2003) è stato dimostrato il probabile coinvolgimento di ROS prodotti
da un isolato di Fusarium solani durante la biodegradazione del benzo[a]pirene, ipotizzando il possibile coinvolgimento di questa via anche nella degradazione dei coloranti.
I risultati della prova da noi allestita in presenza degli inibitori, sia del citocromo P-450 che delle perossidasi, hanno fornito indicazioni circa il probabile ruolo che l’acqua ossigenata potrebbe avere nella degradazione del GAD. Infatti, nelle tesi in cui i complessi enzimatici risultavano inibiti, e quindi non più in grado di ridurre la concentrazione di perossido di idrogeno accumulata nel substrato di crescita, il fungo ha degradato il colorante più efficientemente rispetto ai rispettivi controlli in cui questi sistemi non erano inibiti.
Sulla base dei risultati ottenuti abbiamo ipotizzato che aumentando la concentrazione di perossido di idrogeno nella coltura fungina, venga incrementata la produzione di radicali idrossilici, tramite una reazione Fenton, e che questi siano coinvolti nella degradazione del colorante glicoazoico. Il coinvolgimento del radicale idrossilico nella degradazione del GAD da parte dell’isolato 3618 sembra inoltre essere confermato dai risultati ottenuti con l’uso di idrossitoluene butilato, il quale oltre ad inibire il citocromo P-450 è anche un potente antiossidante, e in presenza del quale, infatti, la degradazione subisce un arresto o una brusca diminuzione, correlata con un’abbattimento nella crescita del fungo.
Il coinvolgimento della reazione Fenton in processi di decolorazione è nota da tempo. Il processo Fenton impiega H2O2 e Fe(II) in ambiente acido consentendo di raggiungere rese di decolorazione
superiori al 90% (Sevimil et al., 2002). Tuttavia, l’impiego di un trattamento che utilizzi solo acqua ossigenata non sempre si è dimostrato efficace (Lubello et al. 2003): i risultati dipendono fortemente dal tipo di refluo trattato e dai tempi di trattamento ( Davis et al. 1982). Anche l’azione di degradazione da parte di F. solani del composto benzo[a]pirene sembrerebbe attribuibile ad una reazione Fenton (Veignie et al. (2003).
Per supportare la nostra ipotesi circa il coinvolgimento del radicale idrossilico nella degradazione del GAD abbiamo cercato perciò di mettere a punto un protocollo per la sua rivelazione, cosa per altro non semplice con una così breve emivita, nel sistema F. oxysporum/GAD.
Tra i sistemi riportati in letteratura, quello dell’impiego del PEG sembrava di particolare interesse. Il PEG è stato utilizzato da Hammel e collaboratori per lo studio del coinvolgimento del radicale idrossilico nella degradazione del legno da parte di alcuni basidiomiceti (Hammel et al., 2002). I risultati da noi ottenuti non sono stati sufficientemente chiari per poter condurre una misurazione dei ROS attraverso il sistema PEG.
Anche l’impiego del Nitro Blu Tetrazolo (NBT) e la DiaminoBenzidina (DAB), comunemente usati per la detenzione microscopica rispettivamente dell’O2- e del H2O2 nei sistemi in cui si ipotizza una
produzione di questi radicali (Shinogi et al. 2003), non è stato soddisfacente quando applicato al nostro sistema. Al contrario, il metodo del deossiribosio utilizzato per la misurazione del radicale idrossilico, sebbene non di semplice esecuzione, ma molto sensibile e preciso (Johansson et al., 1983; Girotti et al,1984) ha permesso di chiarire il coinvolgimento di questa specie reattiva dell’ossigeno nella degradazione del GAD. Tuttavia,il principale problema di tale protocollo inizialmente ha riguardato l’individuazione dell’intervallo di tempo in cui effettuare il test, dal momento che esso misura la concentrazione di radicale nel momento specifico in cui esso è eseguito. Quindi si è pensato che l’esecuzione del test dovesse coincidere con l’intervallo di tempo in cui si verifica la maggior degradazione del colorante. Dai risultati della prova preliminare eseguita a 96h dall’inoculo e dall’aggiunta del GAD a diversi intervalli (24h) dall’inoculo si è giunti alla conclusione di eseguire il test nell’intervallo di tempo 28-60h. Questa scelta deriva sopratutto dai risultati della prova di aggiunta del GAD a diversi tempi, dai quali si è potuto osservare che la degradazione avviene solo se il colorante è addizionato nelle prime 24h di coltura. Se esso viene aggiunto alle 24 o alle 48 ore, non si ha degradazione.
I risultati del test del deossiribosio non sono stati di facile interpretazione, sopratutto per i campioni cresciuti in presenza degli inibitori, anche e sopratutto per l’alta variabilità intrinseca del sistema biologico oggetto di studio. Dalle prove condotte in presenza di GAD, eseguendo il test del deossiribosio tra le 28h e le 60h, , sia del nuovo che del vecchio batch, si può notare un incremento del radicale idrossilico nell’intervallo 36-40h, seguito da periodi di degradazione del GAD più spinta. Questo fenomeno sembrerebbe supportare la l’ipotesi del coinvolgimento del radicale nel fenomeno di abbattimento, mediante i meccanismi che portano alla sua produzione con la reazione di Fenton.
Per quanto riguarda i risultati ottenuti per il campione cresciuto in presenza dell’inibitore A, i dati sembrerebbero indicare apparentemente l’assenza di una correlazione tra concentrazione di radicale e la degradazione del GAD. Il problema relativo a questa tesi, è, a nostro avviso, il fatto che la degradazione del GAD sia concentrata nelle prime 24-28 ore di incubazione. Purtroppo non sono disponibili dati relativi al radicale che si riferiscano a questo itervallo di tempo.. Infatti, il protocollo del deossiribosio è stato messo a punto nello specifico sulla tesi relativa al fungo cresciuto in sola presenza di GAD, in cui la velocità di degradazione risulta inferiore, e quindi in intervalli temporali differenti, rispetto al fungo cresciuto in presenza dell’inibitore A.
E’ noto che la presenza dei ROS è fondamentale per la crescita e la differenziazione dei funghi (Heller et al. 2011), come risposta allo stress ossidativo. In normali condizioni di crescita, i livelli di ROS sono bassi e la generazione e i sistemi per la neutralizzazione sono bilanciati. La differenziazione è indotta da transienti incrementi locali nei livelli di ROS, i quali inducono anche la sovra-regolazione dei sistemi di neutralizzazione delle specie reattive dell’ossigeno. Questa teoria è supportata da solide evidenze sperimentali, come la presenza di quantità elevate di ROS durante la conidiogenesi o durante la maturazione del corpo fruttifero e dall’osservazione per cui l’addizione di un antiossidante inibisca i processi di differenziazione. Esistono diversi esempi di mutanti, o per i
anomalie nei processi di differenziazione. Uno studio condotto da Sideri e collaboratori (2000) sulla formazione degli sclerozi di Sclerotium rolfsii mostra che esiste una correlazione tra concentrazione di acqua ossigenata presente e il tasso di differenziazione degli sclerozi. Sulla base di quanto riportato in letteratura potremmo spiegare la correlazione tra aumentata velocità di crescita del fungo e più veloce degradazione del GAD in presenza dell’inibitore A e correlalrla con la presenza del radicale ossidrilico. Poichè i ROS sembrano intervenire anche sul processo di germinazione dei conidi, potremmo ipotizzare una correlazione dose di acqua ossigenata/tasso di germinazione, con conseguente maggior velocità di crescita e quindi di degradazione del GAD. Il fungo, in queste condizioni, dopo 36h termina gli zuccheri presenti mostrando una presenza di radicale minore. Il valore crescente registrato alle 40 ore potrebbe essere imputabile ad un accumulo dovuto al fatto che il fungo non ha più a disposizione né zuccheri né GAD per il sostentamento del suo metabolismo. Questo fenomeno spiegherebbe inoltre anche le alte concentrazioni del radicale idrossilico riscontrate nella tesi relativa al fungo cresciuto in presenza di inibitore D su cui è stato effettuato il test del deossiribosio nelle 28-40h. Dalle varie prove di crescita di questa tesi si osserva che l’andamento della degradazione subisce un arresto o comunque un calo notevole. Inizialmente ciò è stato correlato col fatto che l’idrossitoluen- butilato (BHT), in quanto antiossidante, neutralizzasse l’azione del radicale, portando ad una diminuzione o addirittura ad un’assenza della degradazione. Sin dalle prime prove di allevamento, però, si poteva notare una crescita piuttosto rallentata della massa fungina, confermata tra l’altro dall’andamento dell’assimilazione del glucosio, ritardata rispetto al controllo di quasi 30 ore.
L’idrossitoluen-butilato (BHT) è utilizzato come conservante alimentare e ne è stata valutata l’influenza sulla germinazione e la crescita di Aspergillus da Passone e collaboratori (2005). Dai loro studi risulta che il BHT (1-10mM), addizionato al mezzo, influenza sia la crescita che la germinazione fungina. Hanno osservato sul 100% degli isolati testati un aumento del periodo di
dei conidi è compresa nell’intervallo tra le 20-27h e 27-35h, in base alle concentrazioni di BHT. Inoltre questo inibitore ha effetti antimicrobici su differenti generi batterici e fungini. Alcuni studi (Nesci et al. 2003; Thompson, 1991,1992) suggeriscono che il BHT, e gli antiossidanti fenolici in generale, possano controllare la germinazione dei conidi e la crescita di alcuni funghi micotossigeni come Aspergillus spp. e Fusarium spp. su mais. Queste evidenze potrebbero spiegare la ritardata crescita nel nostro isolato 3618, e quindi la mancata o la ridotta degradazione che si rileva in presenza dell’inibitore D.
Nel caso di Aspergillus, gli autori indicano come il 100% della germinazione conidica l’intervallo 20-35h (Passone et al.2005). Questa osservazione unita al fatto che per la differenziazione siano necessarie altre concentrazioni di ROS, potrebbe spiegare anche l’alta concentrazione di radicale idrossilico rilevata nella tesi LMG+D nell’intervallo di tempo delle 28-40h.
Se il radicale idrossilico influisca sulla degradazione solo indirettamente, incrementando o rallentando la crescita fungina, o se funga anche come primo agente di attacco del GAD rimane per il momento da verificare. Dalle evidenze fino ad ora ottenute si può solo affermare che un coinvolgimento del radicale sembra ipotizzabile, anche se resta da verificarne le modalità.