Valutazione dei ROS mediante Nitro Blu Tetrazolo (NBT) e DiaminoBenzidina (DAB)

Il Nitro Blu Tetrazolo (NBT) e la DiaminoBenzidina (DAB) vengono comunemente usate per la detenzione microscopica rispettivamente dell’ O2- e del H2O2, dal momento che sono in grado di

reagire con questi specifici ROS dando una reazione colorimetrica visualizzabile al microscopio. Queste sostanze vengono adoperate per studiare in piastra quelle interazioni tra organismi e piante,in cui si ipotizza una produzione di questi radicali (Shinogi et al. 2003).

E’ stata allestita, quindi, una prova in cui l’isolato 3618 è stato fatto crescere su substrato LMG agarizzato. Le piastre, inoculate al centro con un dischetto di 8mm di diametro di PDA contenente il fungo in attivo accrescimento, sono state lasciate ad incubare a 24°C, con fotoperiodo luce/buio di 12h. Dopo quattro giorni di incubazione le piastre sono state trattate protocollo come di seguito descritto e in accordo con Shinogi e collaboratori.

- NBT: a ciascuna piastra sono stati aggiunti 5 mL di una soluzione di NBT allo 0.05% in buffer

sodio fosfato 0.05M a pH 7.5, e lasciate ad incubare per 1h a 24°C. Dopo incubazione le piastre sono state trattate con etanolo per fermare la reazione del NBT e mantenute in etanolo a temperatura ambiente overnight.

- DAB: a ciascuna piastra sono stati aggiunti 5 mL di una soluzione di DAB 1mg mL-1_{. I campioni}

sono stati incubati per 8h a temperatura ambiente al buio e successivamente fissate con una soluzione di etanolo e acido acetico in rapporto 96:4 (v/v) e lasciate reagire overnight.

Le piastre trattate con NBT e DAB sono state osservate allo stereomicroscopio.

3.8.3 Metodo di misurazione del radicale idrossilico mediante degradazione del Deossiribosio

Il metodo del deossiribosio per la misurazione del radicale idrossilico non è di semplice esecuzione, ma è molto sensibile e preciso e fin dalla sua introduzione è stato largamente utilizzato (Johansson et al., 1983; Girotti et al,1984). È noto da tempo che lo zucchero pentoso, il 2-deossiribosio (Fig. 6), può essere ossidato dal periodato rilasciando una sostanza che, ad alte temperature, reagisce con l’acido tiobarbiturico (TBA) producendo un cromogeno di colorazione rosa (Waravdekar et al., 1957,1959). Una reazione simile sul deossiribosio libero, o legato al DNA, è ottenuta se sottoposto a radiazioni ionizzanti ad alta energia. Anche l’incubazione di diversi zuccheri (saccarosio, lattosio, fruttosio), oltre al deossiribosio, con Sali di Fe2+ _{in condizioni aerobiche porta alla formazione di}

spettralmente identico ad un addotto di TBA con un’aldeide a 3 atomi di carbonio, la malonaldeide (Fig. 7), chiamata anche malondialdeide (MDA).

Fig. 6 Molecola del deossiribosio

Fig. 7 Formazione dell’addotto per reazione della MDA con l’acido TBA

Non è tuttavia chiaro se la MDA venga rilasciata direttamente dal deossiribosio o se l’anello spaccato dello zucchero produca una sostanza che, dopo trattamento ad alte temperature con TBA, forma la MDA. L’ultima ipotesi sembra la più plausibile quando la degradazione del deossiribosio è promossa da Sali di Fe2+ _{in condizioni aerobiche. Quando il DNA o il deossiribosio libero viene}

irradiato in soluzione acquosa, o quando è degradato da ioni Fe2+ _{in presenza di O}

2, la specie

prodotta che attacca lo zucchero è il radicale idrossilico (·OH). È stata proposta la seguente serie di reazioni (Fig. 8) che portano alla formazione del cromogeno rosa:

Fig. 8 Reazioni che portano alla formazione del cromogeno rosa.

Secondo quanto riportato in letteratura, il mix di reazione nella quale si ipotizza la produzione del radicale idrossilico è incubata a 25°C o 37°C in presenza di deossiribosio, generalmente in concentrazione 2-3mM (concentrazione finale). Nella maggior parte misture dei mix di reazione, la degradazione del deossiribosio sembra procedere linearmente per circa 60 minuti, ma ciò dovrebbe essere testato per ogni sistema preso in esame. Lo sviluppo della colorazione rosa si ottiene addizionando alla miscela di reazione (con Volume finale compreso tra 0.9-1.2 mL) 1 mL di soluzione di acido tiobarbiturico all’1% (p/v) in NaOH 50mM, seguita da 1 mL di soluzione acquosa di acido tricloroacetico (TCA) al 2.8% (p/v). Dopo aver mixato bene i reagenti, i tubi contenenti la miscela vengono riscaldati a 100°C a bagno caldo per 10-20 min e raffreddati. L’addotto rosa di TBA può essere quindi misurato con lo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 532nm. Se la reazione risultasse torbida, il cromogeno può essere estratto in butan-1-olo e

determinare l’assorbanza sull’estratto organico risultante.

• Curva di taratura e verifica del deossiribosio test

La curva di taratura e la verifica del funzionamento del deossiribosio test sono stati ottenuti con H2O2 (30% v/v) e FeSO4 (10mg/L).

• Messa a punto del saggio del deossiribosio nel sistema F. oxysporum/GAD

Dal momento in cui si è deciso di quantificare il radicale idrossilico mediante saggio del deossiribosio si è presentato il problema di decidere a che timing, dal momento dell’inoculo, effettuare il test. Visti i risultati ottenuti sia dalla curva di degradazione del colorante, sia dall’assimilazione degli zuccheri, si è deciso di allestire una prova preliminare in cui il saggio del deossiribosio è stato effettuato dopo 96h dall’inoculo. Inoltre è stato necessario stabilire il periodo di incubazione del deossiribosio aggiunto nel mix di reazione, parametro che, secondo protocollo, va stabilito per ogni sistema esaminato.

Trattandosi di una prova preliminare, sono stati analizzati i campioni relativi al fungo in presenza di GAD (LMG) e il rispettivo controllo. La prova è stata condotta nelle beute da 250 mL, come già descritto. Trascorse 96h dal momento dell’inoculo è stato addizionato il deossiribosio (2mM) direttamente nella beuta di coltura e sono stati fatti, quindi, prelievi a diversi tempi dall’aggiunta del deossiribosio: subito dopo l’aggiunta (T0), dopo 5min (T5), dopo 15min (T15), dopo 30min (T30),

dopo 1h (T1h) e infine dopo 24h (T24). I prelievi sono stati addizionati di acidi TBA e TCA in

rapporto 1:1 e trattati secondo il protocollo descritto precedentemente. Dopo bollitura sono stati centrifugati a 13000rpm, 4°C per 15min per eliminare la massa fungina.

• Valutazione dell’effetto dell’addizione del GAD a diversi timing al mezzo di coltura

La scelta del momento in cui effettuare il test del deossiribosio è un punto cruciale per la messa a punto del protocollo di rivelazione del radicale idrossilico, considerando la breve emivita in vitro della molecola. Il test andrebbe effettuato nel range temporale in cui si sospetta la produzione massima di radicale, e quindi nel lasso di tempo in cui la degradazione del GAD risulta essere più spinta. In base a ciò, è stata allestita una prova in cui l’aggiunta del GAD non è stata fatta per tutte le tesi al tempo zero, ma ad intervalli di 24h dal momento dell’inoculo fungino, fino alle 96h. Lo

scopo della prova era di verificare se c’è un momento nella crescita fungina in grado di influenzare maggiormente la degradazione del colorante GAD, effettuare adatto per ottimizzare il test del deossiribosio. Sono state utilizzate 3 repliche per ogni tesi, a cui il GAD è stato addizionato a diversi timing(T0, T24, T96), rispettando tutti gli altri parametri nell’allestimento della prova. Dal

momento di aggiunta del GAD al substrato LM contenete il fungo, sono stati fatti prelievi ogni 24h per le relative misure del colorante e degli zuccheri. Il tempo zero per la degradazione del colorante, per ogni tesi, non coincide con il momento dell’inoculo bensì con il momento di aggiunta del GAD (24, 48, 72 e 96h dall’inoculo), corrispondente quindi a diversi stadi di crescita fungina e risultando diverso per ogni tesi.

3.9 Quantificazione del radicale idrossilico mediante saggio del deossiribosio