Prima di proseguire con la discussione è bene ricordare che al momento dell’ottenimento dei risultati soprariportati, la letteratura a disposizione riguardante l’argomento “ormoni vegetali e alghe unicellulari” era (ed è) molto esigua e frammentata. La causa di tale frammentazione è da attribuire al grande interesse che questi microrganismi ricoprono per le industrie (specialmente per quelle operanti nella ricerca di BioDiesel). E’ lecito pensare che vi sia una notevole mole di dati trattanti l’argomento “ormoni vegetali e alghe unicellulari”, ma la maggior parte di tali dati è coperta da segreto a causa dell’elevato valore economico che tali ricerche hanno per le industrie. I lavori riportati che citano la presenza di auxine in alghe unicellulari autotrofe sono scarsi e non distinguono tra le varie isoforme che possono essere presenti in un organismo (Mazur et al., 2001).
Nelle piante, la conquista dell’ambiente terrestre è associata all’espansione del patrimonio genetico e delle vie di segnalazione (Lang et al., 2008). Questo include segnali mediati da fitormoni come le auxine, molecole che sono la chiave regolatoria della crescita e dello sviluppo delle piante (Paponov et al., 2009). Sebbene il pathway auxinico sia ormai relativamente ben conosciuto, elementi di questo pathway sono presenti anche in piante evolutivamente più primitive come le briofite (Rensing et al. 2008). L’evoluzione del pathway auxinico tuttavia, non è ancora chiara, infatti il pathway auxinico è andato incontro a una sostanziale diversificazione e specializzazione, nel corso della sua evoluzione dalle briofite alle piante vascolari, ma non è chiaro a quale punto dell’evoluzione siano emersi gli aspetti caratteristici della biologia auxinica. Si è ipotizzato che gli elementi del pathway auxinico siano comparsi con i primi organismi multicellulari nelle piante (Rensing et al. 2008), ma non si esclude che particolari aspetti della biologia auxinica abbiano un’origine anteriore a tali organismi pluricellulari (Lau S. et al., 2009; Ross and Reid 2010). Diversi articoli hanno suggerito la presenza di auxine in alghe verdi, rosse e brune (Lau S. et al. 2009; Le Bail et al. 2010; Ross and Reid 2010; Sztein et al. 2010) alcuni dati riportati in questi lavori hanno lasciato intendere che le auxine possano giocare un ruolo nello stabilizzare la polarità di questi organismi, regolandone i rizoidi e soprattutto, controllandone la crescita. Tutto questo grazie a un possibile pathway alternativo (ipotizzato in tutti gli articoli sopracitati, ma ancora non identificato) capace di trasmettere il segnale auxinico.
Nella biodiversità terrestre, le alghe hanno apportato un contributo significativo nel corso dell’evoluzione. Si distinguono in varie specie e sono comprensive di organismi uni- e pluri-cellulari. Le alghe verdi Viridiplantae si sono evolute in due grandi lignaggi, le Chlorophyta e le Streptophyta (Lewis and McCourt, 2004). Gli Streptophyta comprendono alcune linee di alghe verdi d’acqua dolce e le piante terrestri, mentre le Chlorophyta includono le restanti alghe verdi (McCourt et al., 2004). Questo appartenere delle alghe verdi, sia al ramo delle Chlorophyta che a quello delle Streptophyta, è estremamente interessante dal punto di vista evolutivo e ha portato a dei risultati estremamente significativi per il ramo di ricerca riguardante i biocarburanti (Beer et al., 2009; Wijffel and Barbosa 2010). Tuttavia, solo pochi genomi di alghe verdi sono stati caratterizzati fino ad ora e i genomi completamente sequenziati appartengono a specie unicellulari (De Smet et al., 2010). In nessun genoma, ad ora sequenziato, si sono ritrovati elementi appartenenti al pathway auxinico, caratteristici delle piante terrestri (De Smet et al., 2010). Nonostante ciò, vi sono diversi articoli riguardanti la crescita e lo sviluppo indotto dalle auxine in alghe pluricellulari, riguardanti sia lo sviluppo dell’embrione (Basu et al 2002), sia l’inibizione della germinazione e dello sviluppo (Kai et al.,2006) e il favorire la crescita del callo in culture di Gracilaria tenuistipitata (Yokoya et al. 2004). Tali articoli, dimostrano come le auxine possano effettivamente agire come regolatori della crescita nella alghe pluricellulari, come nelle piante. Vi sono però pochi articoli che mostrano gli effetti delle auxine su alghe unicellulari: alcuni hanno dimostrato come la somministrazione di IAA riduca il ciclo di divisione cellulare in
Chlorella pyrenoidosa (Vance 1987) e stimoli la crescita in culture di Scenedesmus obliquus (Prasad 1982). Recentemente si è ipotizzato come alte concentrazioni di
auxine siano collegate a una maggiore velocità di crescita e divisione cellulare in alcune alghe unicellulari (Stirk W.A. et al.,2013). I risultati dell’analisi in vitro, hanno spinto l’ipotesi della ricerca verso un’indagine di tipo molecolare e questa ha poi portato all’analisi in silico, che ha indagato i possibili geni coinvolti nel pathway auxinico. In articoli relativamente recenti (Lau S. et al., 2009), si è indagato sulla possible presenza, in silico, di elementi che potessero rispondere alla presenza di auxine come gli “Auxin Response Factor” (ARF) ottenendo dei risultati che smentirono la presenza di tali elementi all’interno di organismi appartenenti alla Classe delle Chlorophyceae. Tali risultati furono poi approfonditi e in parte confermati in anni più recenti (De Smet I. et al., 2011), dove si approfondirono, sempre in silico, le vie di sintesi, trasporto e metaboliche delle auxine. Tuttavia, essendo giunti, solo recentemente, a distinguere chiaramente la presenza di auxine
da altre molecole endogene che potrebbero avere lo stesso effetto dell’acido 3- indolo-acetico, la conferma della presenza di molecole con caratteristiche fito- stimolante, all’interno di organismi considerati i precursori delle alghe e delle piante terrestri (Zhong B. et al., 2013; Becker B. et al., 2009) apre a nuovi interrogativi, sia sul ruolo che tali elementi possano avere per tali organismi, sia sul come possano essere sfruttati per tali caratteristiche a scopi industriali. Un’interessante spunto di riflessione, che deriva dall’osservazione di questi risultati, riguarda la probabile localizzazione intracellulare di questo molecole e dove esse sono state ritrovate, cioè all’interno di una soluzione ricavata dalla frammentazione meccanica della biomassa cellulare di Dunaliella, quindi, presumibilmente, all’interno di questi microrganismi. Di conseguenza si è portati a chiederci che ruolo possano avere e che importanza abbiano queste molecole per questi microrganismi, visto che non se ne è trovata traccia nel mezzo di crescita (da qui la deduzione sulla loro localizzazione intracellulare). Grazie all’analisi in vitro si era ipotizzata la presenza di molecole “auxina-like” all’interno di D.salina e D.tertiolecta, tuttavia, l’induzione genica non particolarmente potente nelle prove di Real-Time PCR: sia con l’estratto trattato secondo la partizione in etere, sia con l’estratto filtrato; ha suggerito la possibile presenza di altre molecole all’interno dell’estratto, molecole sempre con caratteristiche “fitoattive” nei confronti degli organismi vegetali, ma diverse da quelle da noi indagate nelle varie Real-Time PCR. Tale teoria si è stata rafforzata dall’analisi in silico che non ha evidenziato la presenza dei pathway conosciuti della sintesi delle auxine, in D.salina e D.tertiolecta e confermata dall’analisi di HPLC. Quest’ultima ha smentito la presenza di molecole “auxina-like” all’interno degli estratti filtrati di entrambi gli organismi e confermato la presenza di acido abscissico (ABA), molecola che confermerebbe il fenotipo osservato dall’analisi in vitro. Dal confronto con i risultati di questa tesi e i dati presenti in letteratura emerge un quadro estremamente variegato sul tema “protisti autotrofi e fitormoni” infatti, le condizioni di coltura in cui questi organismi sono mantenuti, possono influenzare notevolmente la produzione di metaboliti secondari di questi microrganismi: la presenza di ABA all’interno di Dunaliella salina è stata ipotizzata precedentemente da A. Keith Cowan e Peter D. Rose nel 1991, in cui ipotizzarono che in risposta a stress alofili, D.salina operasse un accumulo di β-carotene e che questo pathway metabolico portasse anche all’attivazione di pathway metabolici legati alla produzione di ABA. Inoltre è importante notare che solo recente è emerso che oltre alle auxine, in organismi appartenenti alla classe delle Chlorophyceae, sono contenute anche molecole di citochinine (Stirk et al., 2013). Non si assume quindi
che le analisi in silico operate fino ad ora, su D.salina e D.tertiolecta, ma anche su altri organismi simili a loro, siano da considerare “definitive” per la predizione di molecole “ormone-like” al loro interno. Ad oggi, in letteratura, non emerge da analisi in silico che alghe unicellulari posseggano geni appartenenti al pathway di sintesi auxinico (Lau S. et al., 2009; Stirk A.W. et al., 2013). Tuttavia, i dati riportati in questa tesi dimostrano quello che Lau S. et al. 2009 ipotizzavano nel conclusioni del loro lavoro, cioè che possano esistere, all’interno di alghe unicellulari, molecole in grado d’indurre un’espressione genica in organismi autotrofi superiori e di mimare un fenotipo riconducibile a quello degli attuali ormoni vegetali. Prendendo però in considerazione il lavoro effettuato da Wood N.L. et al. (1979) in cui si osservano fenomeni di divisione cellulare in alghe unicellulari a seguito di somministrazione di acido indolacetico (auxine), ci si chiede quali tipi di pathway genetici e meccanismi molecolari essi vadano a stimolare, vista l’assenza nel corredo genetico di elementi auxino-simili. Come è documentato dalla letteratura, questi microrganismi possono essere considerati i “genitori” evolutivi di quelle che oggi sono le Embryophyte (Becker B. et al,. 2009), per cui è lecito pensare che questi “antenati” potessero avere dei sistemi di segnalazione ormonale, diversi da quelli utilizzati oggi dalle piante terrestri, ma con le stesse finalità. Inoltre, si ipotizza che inizialmente alcuni elementi del pathway di trasporto delle auxine (PIN proteins) si siano originati a livello della membra del Reticolo Endoplasmatico (RE) in alcune alghe appartenenti al phylum delle Streptophyte e che fossero deputati alla captazione delle auxine all’interno del RE. Dunque, solo successivamente, a causa di una mutazione favorevole, si sarebbero localizzati anche a livello della membrana cellulare, evolvendosi probabilmente da proteine simili alle “PIN-likes Proteins” (Viaene T. et al., 2013). Il “passo” evolutivo successivo, fu probabilmente quello di essere in grado di “rispondere” a diverse concentrazioni di auxine nell’ambiente. Masse cellulari sferiche (come il parenchima delle embriofite) sarebbero state in grado quindi di esportare auxine tra le cellule e quindi di far sviluppare un sistema di risposta a queste molecole. Successivamente, la differenziazione da PIN-Like Proteins a PIN proteins propriamente dette, sarebbe arrivata con l’evoluzione cosi come la specificazione sui differenti organuli cellulari (Viaene T. et al., 2013). Quindi, si può ipotizzare che molecole auxine-like, forse i “genitori” delle attuali auxine, inizialmente sfruttassero meccanismi di trasporto molecolare simili a quelli delle attuali auxine e che fossero di significativa importanza per la cellula, tanto da essere localizzati vicino a un organello come il RE.
Il ritrovare all’interno di Dunaliella, alghe unicellulari più simili in fisiologia e a livello filogenetico ai primi organismi autotrofi, molecole “ormone-like”, potrebbe far ipotizzare che negli organismi ancestrali autotrofi, esistessero già molecole con un pathway di trasporto molto simile a quello degli attuali ormoni e che ricoprissero un ruolo importante nella regolazione della vita cellulare. E’ probabile che con l’avvento dei primi organismi autotrofi si siano sviluppati dei sistemi, assieme a questi microrganismi, deputati al riconoscimento di tali molecole come “segnali” indicantile caratteristiche dell’ambiente in cui l’organismo si trovava. Interpretazione che sembra essere rimasta nel codice genetico di organismi più evoluti e altri meno evoluti (Wood N.L. et al., 1979).