Questi risultati dimostrano che la familiarizzazione visiva con un oggetto, utile al suo successivo riconoscimento, è accompagnata da una diminuzione dell’efficacia delle connessioni orizzontali nella corteccia peririnale dovuta ad una depressione a lungo termine delle sinapsi. Sebbene esistano molte evidenze che la familiarizzazione visiva comporti un’attivazione della corteccia peririnale e che le sue connessioni possano andare incontro ad LTD ed LTP, questa è la prima dimostrazione diretta di un cambiamento funzionale delle connessioni corticali associato alla memorizzazione visiva di un oggetto. I miei risultati sono in linea con quelli che hanno dimostrato un’occlusione della plasticità sinaptica mediante apprendimento nella corteccia M1, nell’ippocampo, nella corteccia piriforme, nell’amigdala e nel cervelletto. Se è vero che è stata dimostrata un’occlusione dell’LTD (IV → II/III) in V1 a seguito di 24 ore di deprivazione monoculare durante il periodo critico (Heynen et al 2003) e in corteccia somatosensoriale dopo la rimozione di tutte le vibrisse meno una (Allen et al 2003) , questa è la prima volta che si descrive un processo d’apprendimento senza deprivazione sensoriale accompagnato da una diminuzione dell’efficacia sinaptica e ad LTD in un animale adulto e su connessioni orizzontali (fig. 34 e 37). D’altra parte, i miei risultati possono essere usati a sostegno dell’ipotesi che la caratteristica riduzione di risposta dei neuroni peririnali alla presentazione di stimoli già noti sia provocata da LTD (Bogacz e Brown 2003; Massey e Bashir 2007).
Si tenga presente che questi risultati si riferiscono alle connessioni orizzontali interne alla peririnale. La depressione delle sinapsi formate dalle collaterali degli assoni corticali potrebbe essere presente in altre aree corticali. Per esempio, in corteccia visiva e in barrel cortex, la riorganizzazione dei campi recettivi in seguito a lesioni o altre perturbazioni sembra essere mediata da connessioni orizzontali (Giannikopuols ed Eysel 2006; Maravall et al 2004; Darian Smith e Gilbert 1994 ).
I miei dati non possono distinguere tra i cambiamenti che risultano da una singola esposizione al nuovo oggetto e quelli che avvengono con le successive presentazioni e dunque non possono descrivere le modificazioni plastiche dovute all’acquisizione di una memoria e quelle dovute al suo consolidamento. Non è quindi possibile escludere che durante l’acquisizione occorrano meccanismi di LTP come ipotizzato in Barker et al 2006. Serviranno nuovi esperimenti senza
overtraining e con diversi intervalli temporali per stabilire cosa succede ai
potenziali di campo per poter trarre delle conclusioni definitive sul ruolo dei cambiamenti osservati nella memoria di riconoscimento.
La registrazione di potenziali di campo non è in grado di rivelare fenomeni di LTP molto specifici e circoscritti. I neuroni peririnali coinvolti nel riconoscimento visivo sono almeno di tre tipi: novelty neurons, familiarity neurons e recency
neurons. E’ possibile prevedere un intervento diversificato di LTD ed LTP sui tre
tipi di neuroni tanto più se si considera che grazie al fenomeno della redistribuzione delle efficacie sinaptiche descritto da Markram e Tsodyks (1996) l’LTP può accompagnarsi ad un innalzamento della risposta al primo impulso, ma ad una riduzione della risposta agli impulsi successivi della scarica presinaptica fisiologica. Questo cambiamento dinamico a breve termine avviene nel corso di 150 ms, un tempo che ben si accorda con quelli registrati mediante ERP durante il riconoscimento visivo di uno stimolo complesso (Thorpe et al 1996). La redistribuzione delle efficacie sinaptiche è sinapsi-specifica quindi è possibile
ipotizzare che in una rete neurale con collaterali eccitatorie ricorrenti come quella della corteccia cerebrale, il feedback positivo tenda ad amplificare gli inputs transienti, ma siccome non tutti saranno amplificati equalmente, solo quelli che coincidono con i patterns memorizzati saranno filtrati e le loro associazioni saranno passate alle stazioni successive. L’ipotesi della presenza di un meccanismo dinamico a breve termine indotto da LTP può essere messa alla prova sia in vivo sia in vitro. Utilizzando il patch-clamp in vivo mirato si potrebbero isolare i vari tipi di neuroni peririnali e registrare i potenziali eccitatori postsinaptici in seguito alla prima e alla seconda presentazione dello stimolo visivo. In vitro, si potrebbero isolare i tre tipi di neuroni del riconoscimento in base alle velocità di sviluppo della plasticità, e studiare le risposte di campo a treni di una decina d’impulsi con una frequenza maggiore di 20 Hz prima e dopo l’apprendimento.
La redistribuzione delle efficacie sinaptiche dovrebbe essere un meccanismo d’origine presinaptica in quanto è molto probabilmente dovuta ad una deplezione più rapida delle vescicole sinaptiche. Sulla base degli esperimenti finora condotti non posso stabilire se i cambiamenti funzionali osservati sono imputabili a meccanismi presinaptici o postsinaptici. La parziale occlusione del LTD NMDA- dipendente mi spinge ad ipotizzare che il fenomeno sia d’origine postsinaptica come descritto in ippocampo da Sacchetti et al (2001; 2002) per il contextual fear
conditioning. La mia ipotesi sarebbe verificata se le curve di paired pulses
facilitation registrate nel gruppo di controllo e in quello overtrained risultassero
uguali.
Il marcato effetto dell’apprendimento sulla depressione delle connessioni orizzontali della corteccia peririnale sembra difficile da concettualizzare nel contesto del dettagliato pattern d’informazioni acquisite con la visione di un oggetto.
Figura 37 Effetti complementari della memoria di riconoscimento visivo sulla plasticità sinaptica peririnale. Dati rinormalizzati rispetto alla baseline iniziale. (a) Cerchio rosso pieno: media degli LTD finali di 8 topi (cerchi rossi vuoti) che hanno appreso. Cerchio blu pieno: media degli LTD finali di 7 topi (cerchi blu vuoti) che non hanno appreso; P<0,05. (b) Cerchio rosso pieno: media dei LTP finali di 6 topi (cerchi rossi vuoti) che hanno appreso. Cerchio blu pieno: media degli LTP finali di 5 topi (cerchi blu vuoti) che non hanno appreso; P<0,05.
C’è però da considerare che presentazioni successive di uno stimolo possono indurre nuovi cambiamenti sinaptici più fini come avviene in corteccia motoria man mano che l’addestramento si prolunga (Karni et al 1995). Sarebbe scorretto pensare sulla base dei miei risultati che la capacità informativa della corteccia peririnale sia limitata. I topi utilizzati in questo lavoro sono relativamente naive rispetto agli stimoli insoliti e complessi con i quali sono stati familiarizzati. E’ stato dimostrato che l’apprendimento spaziale non è modificato finché più del 90% delle connessioni ippocampali non siano state saturate ( Moser et al 1998 ). Desimone ha mostrato come l’area di rappresentazione della familiarità di un dato stimolo nella corteccia temporale antero-inferiore si riduce sempre di più man mano che si aggiungono nuove presentazioni dell’oggetto (Li et al 1993). Se la stessa cosa fosse vera per la corteccia peririnale, minime depressioni a lungo termine residue sarebbero ancora in grado di assicurare nuovi apprendimenti. E’ anche possibile ipotizzare che l’esteso LTD da me osservato non riguardi
direttamente i neuroni che rispondono allo stimolo visivo familiare, ma i neuroni intorno per diminuire le interferenze nella rappresentazione. La ripetuta esposizione ad uno stimolo visivo potrebbe condurre ad un rifinimento della sua rappresentazione corticale che comporterebbe una fuoriuscita di molti neuroni dal
pool responsivo, ma una codifica più selettiva, robusta, “contrastata” e dunque
efficiente (fig. 38). In questo senso il fenomeno di familiarizzazione sarebbe molto simile ad un processo di priming (Schacter e Buckner 1998). Se ciò fosse vero si avrebbe finalmente un modello animale in cui studiare le basi molecolari del priming.
(a)
(b)
Figura 38 Modello schematico della codifica d’oggetti in peririnale mediante LTD ed LTP. (a) Quando un oggetto è presentato ripetutamente, le cellule che codificano elementi non essenziali per il suo riconoscimento diminuiscono la loro risposta (desaturazione del colore blu) e le loro connessioni con le cellule indispensabili per il riconoscimento si deprimono (assottigliamento delle linee). Poco cellule (blu) risultano più connesse (linee spesse) migliorando la sincronizzazione.(b) Rappresentazione dello stimolo “a cappello messicano” che si otterrebbe cambiando la regola d’inibizione laterale con quella di depressione delle connessioni nella funzione di vicinanza della rete di Kohonen usata nel modello di Bussey e Saksida (si confronti con la fig. 3 di Cowell et al. 2006)
Desimone (in Erikson et al 2000) ha dimostrato che nella corteccia peririnale delle scimmie si formano con l’esperienza clusters funzionali di neuroni che rappresentano categorie d’oggetti; nello stesso lavoro è stato dimostrato che il fenomeno descritto non è dovuto ad un rafforzamento degli inputs condivisi ai neuroni peririnali. Secondo il modello che vi sto proponendo, la clusterizzazione potrebbe spiegarsi mediante una depressione delle connessioni fra i gruppi neuronali.
Per controllare la mia ipotesi si potrebbero condurre due tipi d’esperimento: misurare mediante tetrodi cronici nell’animale sveglio il grado di decorrelazione fra l’attività di neuroni dislocati in punti diversi alla prima presentazione di uno stimolo visivo e dopo; misurare l’ampiezza dei potenziali di campo in una fettina
1° familiarizzazione
2° familiarizzazione
di peririnale da due elettrodi di registrazione messi in linea con l’elettrodo di stimolazione ed osservare se l’induzione di LTP nel punto più vicino all’elettrodo di stimolazione si accompagni ad una diminuzione d’ampiezza dei potenziali di campo evocati nel punto più distante.
Winters e Bussey hanno recentemente dimostrato che l’infusione di scopolamina in peririnale dopo l’acquisizione della memoria di un oggetto migliora la successiva prestazione di riconoscimento di quell’oggetto nel ratto (Winters et al 2006). E’ stato ipotizzato che il blocco colinergico impedisca l’interferenza con la traccia acquisita da parte di nuovi stimoli incontrati dopo l’acquisizione. Sarebbe interessante utilizzare il protocollo dei miei esperimenti per descrivere i cambiamenti della forza delle connessioni orizzontali in animali trattati con l’antagonista colinergico e negli animali non trattati; inoltre; sarebbe utile sviluppare un modello in vitro dell’interferenza fra tracce mnemoniche nella corteccia peririnale. A questo scopo si potrebbero ad esempio misurare le risposte registrate da un elettrodo piantato sotto il solco rinale (A) in seguito alla stimolazione alternata con un elettrodo sul versante temporale (X) ed uno sul versante entorinale (Y); un LTD indotto sulle connessioni X-A con PPLFS da X non dovrebbe deprimere la via Y-A (Bogacz e Brown 2002), dopo 30 minuti da quest’induzione produciamo una PPLFS da Y: sarebbe sorprendente trovare un blocco del consolidamento del LTD sulla via X-A e ancor di più se questo blocco fosse prevenuto dall’infusione di scopolamina durante la seconda PPLFS.
L’indebolimento delle connessioni orizzontali peririnali è provocato molto probabilmente da fenomeni simili al LTD, ma è possibile pensare anche a cause diverse come una riduzione generalizzata dell’eccitabilità, una diminuzione delle sinapsi attive o l’effetto dello stress. La riduzione dell’eccitabilità delle fibre nervose è stata descritta nelle prime fasi del condizionamento classico nell’ippocampo (Moyer et al 1996) e in M1 (Donoghue 1995). I miei dati sono in contraddizione con questa fenomeno visto che le intensità di stimolazione assolute non sono modificate dalla familiarizzazione visiva (fig 39, Mann-Withney Rank Sum test, P = 0,877 ).
Figura 39 Le intensità assolute di stimolazione nei due gruppi sperimentali sono simili. Il diagramma rappresenta le intensità di stimolazione utilizzate per la baseline (50% della risposta massima) negli animali che hanno visto oggetti (cerchi vuoti rossi) e in quelli che non ne hanno visti (cerchi vuoti pieni). I cerchi pieni indicano le rispettive medie; P>0,05.
Inoltre, una minore eccitabilità dovrebbe ridurre la capacità delle sinapsi di andare incontro a LTP, ma i miei dati indicano un aumento dell’inducibilità del LTP negli animali che hanno appreso (fig.40). Anche una diminuzione delle sinapsi attive come quella osservata in corteccia visiva e somatosensoriale (Darian-Smith e Gilbert 1994) mi sembra implausibile, giacché nella maggiorparte dei casi modificazioni strutturali estese si osservano ben oltre le due ore dall’apprendimento (Maletic-Savatic et al 1999; Engert e Bonhoeffer 1999; ma si veda anche Sorra e Harris 1998). E’ poco probabile che lo stress abbia alterato l’eccitabilità della corteccia perché gli animali sono stati a lungo abituati al contatto con l’uomo, i controlli hanno subito lo stesso tipo di manipolazione prima del sacrificio ed infine lo stress comporta solitamente un aumento del LTD e una riduzione del LTP inducibili ( Xu et al 1997) e dunque non i cambiamenti osservati nel mio studio.
Lasciatemi aggiungere che la descrizione in vitro di una riduzione del gain sinaptico indotta dall’apprendimento esclude possibili effetti dell’attività muscolare e delle emozioni sull’eccitabilità neuronale come quelli descritti in
vivo nell’ippocampo ( Moser 1995).
Il protocollo messo a punto nel mio lavoro potrà essere utilizzato anche per indagare i meccanismi molecolari intracellulari coinvolti nella memoria di riconoscimento. Un punto di partenza potrebbero essere i topi RasGRF1 KO. Questi mutanti non sono in grado di andare incontro a LTD da carbacolo e a LTP e hanno una memoria di riconoscimento a breve termine e dunque NMDA- indipendente, ma non riescono a consolidare le loro memorie. Una ritenzione del ricordo di un oggetto a 48 ore può essere ottenuta in questi animali solo mediante l’overtraining o l’arricchimento ambientale, un trattamento che aumenta l’espressione d’IGF-1 con conseguenze positive sull’azione delle neurotrofine in corteccia visiva (Ciucci et al 2007). L’induzione di LTD e LTP in corteccia peririnale provoca un rilascio locale di BDNF (Aicardi et al 2004). Tutto ciò lascia intravedere l’intervento di vie alternative a quella di RasGRF1 come quella della c-AMP/PKA e di mTor. Sarebbe interessante studiare mediante occlusione cosa succede nella corteccia peririnale dei RasGRF1 KO in seguito ad
overtraining e ad arricchimento ambientale. Naturalmente in questo caso non
dovremo studiare l’LTD che è già inficiato dalla delezione, ma bisognerà vedere se l’overtraining e l’arricchimento favoriscano l’inducibilità dell’LTP. Siccome i RasGRF1 KO sono sensibili alla riattivazione della traccia mnemonica (ovvero, la traccia acquisita mediante overtraining è cancellata dalla riesposizione allo stesso oggetto), le tecniche sviluppate dal mio lavoro saranno utili per indagare il ruolo di IEG che esprimono proteine zinc-finger (per es. quelli della famiglia Egr) attivati da vie alternative a quella delle MAPK. Un altro IEG da studiare è
Arc/Arg3.1, visto che i knock out per questo gene hanno buone performance
nell’ORT a breve termine, ma non a lungo termine (Plath et al 2006) e si sa che Arc/Arg3.1 svolge un ruolo importante nell’induzione del LTD attività-dipendente (Shepherd et al 2006).
Per finire, vorrei evidenziare che il mio lavoro di tesi non solo stabilisce la prima relazione diretta tra gli studi sulla plasticità sinaptica nella corteccia peririnale in vitro e quelli sul ruolo della perinale nella memoria di riconoscimento in vivo, ma descrive per la prima volta due nuovi protocolli che potranno essere molto utili per lo studio della memoria di riconoscimento visivo nel roditore. Il primo è l’induzione elettrica di LTD di popolazione nella corteccia peririnale e il secondo è l’uso dello Y-maze e dell’overtraining per la familiarizzazione visiva dei topi. Fino ad oggi, tutte le indagini condotte per studiare la plasticità sinaptica nella corteccia peririnale utilizzavano il carbacolo o il patch-clamp per indurre l’LTD. L’uso del carbacolo espone le ricerche a serie critiche sulla plausibilità fisiologica del LTD nell’acquisizione e consolidamento delle tracce mnemoniche lasciate dall’apprendimento visivo nella corteccia peririnale. Il carbacolo è un agonista colinergico che al posto del metile ha un gruppo amminico che stabilizza il carbonile proteggendo la molecola dalla digestione da parte dell’acetilcolinesterasi; è dunque difficile mimare gli effetti in
vivo dell’acetilcolina nella memorizzazione peririnale; l’induzione del LTD
mediante PPLFS consente una plasticità attività – dipendente in cui è necessaria l’attivazione dei canali NMDA, mentre con il carbacolo non c’è bisogno dell’attività elettrica. In questa maniera ho ottenuto per la prima volta un LTD peririnale in vitro che fornisce basi cellulari alle evidenze comportamentali ottenute da altri laboratori circa il ruolo necessario svolto dai canali NMDA nel consolidamento delle memorie di riconoscimento nella corteccia peririnale in
l’attivazione sia di canali NMDA sia di recettori glutammatergici metabotropi ed è fortemente influenzato dall’attività colinergica (Massey e Bashir 2007). Sarà dunque utile caratterizzare meglio sotto il profilo farmacologico l’LTD indotto mediante PPLFS. Nella corteccia peririnale adulta l’LTD dipende soprattutto dai recettori metabotropi (Cho et al 2000) forse per superare il tipico freno inibitorio della corteccia matura. Occorrerà vedere se l’LTD NMDA-dipendente occlude quello di origine colinergica.
Questa è anche la prima volta che si studia la memoria di riconoscimento visivo, con oggetti bidimensionali e con apprendimento distribuito nei topi. L’apprendimento distribuito per il visual object recognition test (vORT) spontaneo è stato inizialmente usato in associazione con l’open field arena (Bozon et al. 2003). Questo apparato introduce bias di memoria spaziale nell’analisi dei dati che possono essere eliminati solo con l’intervento farmacologico e la doppia dissociazione. Da questo punto di vista, l’uso dell’Y-maze consente sicuramente uno studio più semplice e pulito del processo d’apprendimento e per questo motivo è stato adottato da Winters e Bussey nella conduzione del vORT spontaneo sui ratti. I loro esperimenti usano tuttavia oggetti tridimensionali perciò non è più possibile distinguere gli effetti della stimolazione visiva da quelli della stimolazione tattile sul processo d’apprendimento; nel mio studio gli oggetti tridimensionali sono stati sostituiti da opportuni stimoli bidimensionali indistinguibili in base alle sole sensazioni tattili in modo da consentire l’isolamento di processi puramente visivi.
Si noti che il protocollo d’induzione dell’LTD da me usato comporta una robusta stimolazione sinaptica e per tanto può rappresentare un analogo ellettrofisiologico degli apprendimenti massivi e distribuiti come l’overtraining. Questa caratteristica comune rende i due protocolli molto utili per lo studio di proteine come il fattore d’elongazione EF1α, il cui mRNA è importante per l’induzione dell’LTD, ma è traslocato nei dendriti solo dopo intense stimolazioni (Huang et al 2005).
Infine, i protocolli d’overtraining, LTD attività-dipendente e occlusione messi a punto in questo lavoro di tesi potranno essere molto utili nello studio della malattia d’Alzheimer attraverso esperimenti su animali transgenici come i topi AD11. Questi topi sviluppano una neurodegenerazione età - dipendente che comprende tutti i tratti patognomici della malattia d’Alzheimer umana. Gli AD11 esprimono un anticorpo ricombinante contro l’NGF che provoca deficit del sistema colinergico e della via di processammento della proteina amiloide. Questi deficit sono all’origine della scarsa memoria di riconoscimento che i transgenici mostrano a 12 mesi d’età, ma possono essere recuperati mediante arricchimento ambientale (Berardi et al 2007), nonostante il permanere dei grovigli neurofibrillari (probabilmente perchè l’arricchimento aumenta anche l’efficienza dei meccanismi di difesa dallo stress ossidativo, Lores-Arnaiz 2006). Sarà interessante studiare l’LTD attività-dipendente nella corteccia peririnale di AD11 allevati in condizioni standard e in AD11 arricchiti.
Questa tesi descrive per la prima volta i cambiamenti sinaptici che avvengono nelle connessioni orizzontali della corteccia peririnale, quando un animale impara a riconoscere con la vista un oggetto. Il riconoscimento visivo è caratterizzato da una riduzione della risposta delle cellule peririnali allo stimolo noto. I miei dati indicano che questa riduzione è dovuta ad una depressione sinaptica a lungo termine e attività-dipendente diffusa orizzontalmente nello strato II/III della corteccia peririnale. Questi risultati non solo sono utili per approfondire la descrizione dei fenomeni d’apprendimento e plasticità sinaptica, ma fanno anche luce sulla strada che indaga le basi neurobiologiche dei disturbi della memoria.
BIBLIOGRAFIA
Aicardi G et al. Induction of long-term potentiation and depression is reflected by corresponding changes in secretion of endogenous brain-derived neurotrophic factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Nov 2;101(44)
Allen CB et al. Long-term depression induced by sensory deprivation during cortical map plasticity in vivo.
Nat Neurosci. 2003; 6
Ashby MC et al. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J Neurosci. 2004 Jun 2;24(22)
Atkins CM et al. The MAPK cascade is required for mammalian associative learning. Nat Neurosci. 1998 Nov;1(7)
Bachevalier J Vargha-Khadem F The primate hippocampus: ontogeny, early insult and memory. Curr Opin
Neurobiol. 2005 Apr;15(2)
Barbeau E. et al. Evaluation of visual recognition memory in MCI patients Neurology 2004; 62
Barker GR et al. Recognition memory for objects, place, and temporal order: a disconnection analysis of the role of the medial prefrontal cortex and perirhinal cortex. J Neurosci. 2007 Mar 14;27(11)
Bauer EP et al. Fear conditioning and LTP in the lateral amygdala are sensitive to the same stimulus contingencies. Nat Neurosci. 2001 Jul;4(7)
Bear MF Abraham WC Long-term depression in hippocampus. Annu Rev Neurosci. 1996;19
Benson DF Greenberg JP Visual form agnosia. A specific defect in visual discrimination. Arch Neurol. 1969 Jan;20(1)
Berardi N et al. Environmental enrichment delays the onset of memory deficits and reduces neuropathological hallmarks in a mouse model of Alzheimer-like neurodegenaration. J Alzheimer Dis. 2007; 11
Berardi N Pizzorusso T Psicobiologia dello sviluppo. Ed. Laterza, 2006
Bilkey DK Long-term potentiation in the in vitro perirhinal cortex displays associative properties. Brain Res. 1996 Sep 16;733(2)
Bliss TV Collingridge GL A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature.