2.2.1 Animali
Ho lavorato con topi wild type C57BL/6 ( Charles River ) d'entrambi i sessi e d’età compresa fra P60 e P70. Gli animali erano stabulati in gabbie da 6 in una stanza con un ciclo luce/buio di 12 ore ( inizio luce 4 A.M. ). Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Tutti gli animali sono stati abituati al contatto con lo sperimentatore per ridurre eventuali effetti di distorsione sui test comportamentali, su LTP e su LTD dovuti allo stress. Tutti gli esperimenti sono stati condotti dalle 9 A.M. nella fase notturna del ciclo.
2.2.2 Comportamento
Il box in cui si svolge il lavoro comportamentale è illuminato da una luce tenue e diffusa. I rumori di sottofondo sono coperti da un rumore bianco continuo diffuso da due altoparlanti ( 90 dB ) e generati dal computer di lavoro mediante un programma scritto in ambiente Audacity. Il topo viene prima abituato all'Y-
maze in assenza d’oggetti visivi, per 20 minuti al giorno per due giorni. Il topo è
messo nello start box e la porta a ghigliottina viene aperta per consentire all’animale l’esplorazione dell’apparato.
Figura 27 Y-maze visual Object Recognition Test. La porta a ghigliottina è abbassata. Nei due bracci in alto s’intravedono i pannelli in plexiglas contenenti gli stimoli bidimensionali. Il topo ne sta esplorando uno.
La porta a ghigliottina viene abbassata quando il topo lascia lo start box per impedirne il rientro e solo allora è fatto partire il cronometro. La fase di familiarizzazione inizia il giorno successivo (fig. 27). Al topo sono allora
somministrati 4 blocchi d’esplorazione, ciascuno composto di due periodi di 5 minuti d'esplorazione intervallati da 5 minuti di pausa durante la quale l’animale è riposto nella gabbia comune. Fra un blocco e l’altro il topo trascorre 90 minuti nella gabbia comune. Alla fine d’ogni sessione d’esplorazione l’apparato e i pannelli porta - oggetti sono lavati con un tovagliolo di carta imbevuto di soluzione alcolica. All’inizio d’ogni fase di familiarizzazione due oggetti visivi diversi A1 e B1 (8 cm × 8 cm) sono collocati in fondo ai due bracci corti dell’apparato. Il topo viene posto nello start box con la porta a ghigliottina abbassata. A questo punto la porta a ghigliottina viene alzata finché il topo non è entrato completamente nell’arena. Viene fatto partire il cronometro e la videoregistrazione della prova. Prima d’ogni sessione A1 e B1 sono scambiati di posto. Due ore dopo l’ottava e ultima sessione di familiarizzazione il topo è sottoposto al test di riconoscimento che consiste in un periodo d’esplorazione di 5 minuti con due oggetti visivi: A2 ( o B2, a caso ) che è una copia dell’oggetto con cui è stata condotta la familiarizzazione e C che è l’oggetto nuovo (fig. 28).
Figura 28 Illustrazione schematica del protocollo di overtraining e vORT. Le 8 sessioni sono accoppiate a formare 4 periodi di familiarizzazione massiva intervallati da 90 minuti di pausa. Ogni sessione dura 5 minuti e tra una sessione e l’altra di un periodo c’è una pausa di 5 minuti. Durante le pause, i topi sono rimessi nella gabbia comune. Dopo 2 ore dall’ultima sessione di familiarizzazione viene effettuato il test di riconoscimento. Al momento del test uno dei due stimoli è sostituito con uno stimolo nuovo (C).
L’analisi dei tempi d’esplorazione è condotta off-line. I criteri che definiscono l’esplorazione sono strettamente basati sull’esplorazione attiva che si ha quando il topo ha entrambe le zampe anteriori a meno di 15 centimetri dall’oggetto e la testa è orientata verso di esso oppure lo tocca con il naso. Sono stati misurati i tempi d’esplorazione dei due oggetti nel primo minuto della prima e ottava sessione di familiarizzazione e nel primo minuto della sessione di riconoscimento. Nel primo minuto d’esplorazione la discriminazione fra due oggetti è solitamente più marcata ( Dix e Aggleton 1999; Winters et al 2004 ). Si calcola un indice di discriminazione che consiste nella proporzione del tempo totale d’esplorazione spesa nell’esplorare l’oggetto nuovo ( vale a dire, la differenza fra i tempi d’esplorazione dell’oggetto nuovo e vecchio diviso la somma dei due tempi ) nel primo minuto d’esplorazione. Questa misura tiene conto delle differenze individuali nel tempo totale d’esplorazione.
8 sessioni di
familiarizzazione
( 5’ X 2 ogni 90’ )
2 ore
A1
B1
B2
C
Test ( 5 min )
2.2.3 Elettrofisiologia
Un altro gruppo di topi non è stato sottoposto al test di riconoscimento dopo l’ultima sessione di familiarizzazione. Gli animali sono stati invece decapitati per condurre gli esperimenti d’elettrofisiologia. Gli animali sono stati anestetizzati con isofluorano e ghigliottinati in accordo con i protocolli del Ministero della Salute. Il cervello è stato rapidamente prelevato e immerso in soluzione di taglio simile al liquor contenente 220,6 mM saccarosio, 3,10 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2
mM MgCl2, 1 mM K2HPO4, 10 mM Hepes, 4 mM NaHCO3, 5 mM destrosio, 0,01
mM glicina, 1 mM ascorbato, 0,5 mM myo-inositolo e 2mM piruvato; pH 7,35. La soluzione era continuamente ossigenata e mantenuta a 4°C. I due emisferi sono stati separati con un bisturi mediante un taglio sagittale lungo il corpo calloso e le porzioni rostrali e caudali d’ogni emisfero sono state rimosse mediante un taglio inclinato di 45° rispetto all’asse rostrocaudale. Ciascuna metà è stata incollata con cianoacrilato alla piastra di taglio del vibratomo ( Leica, Nussloch, Germany ), con la faccia interemisferica adagiata contro un supporto cubico d’agar all’1,5%. Sono state tagliate fettine di 400 µm comprendenti il solco peririnale, l’entorinale e la corteccia temporale (fig. 29). Esse sono state lasciate a riposare in una camerina contenente soluzione di registrazione a temperatura ambiente ( 20 - 25° C ) per almeno un’ora. La soluzione di registrazione ( ACSF ) contiene 132,8 mM NaCl, 3,10 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM K2HPO4, 10 mM Hepes, 4
mM NaHCO3, 5 mM destrosio, 0,01 mM glicina, 1 mM ascorbato, 0,5 mM myo-
inositolo e 2mM piruvato, pH 7,35. All’uopo, una singola fetta viene immersa nella camera di registrazione ( 35° C; flusso 2 ml/min ).
Un elettrodo di stimolazione concentrico bipolare ( Frederick Haer Co., Bowdoinham, ME ) è appoggiato sullo strato II/III, da 200 a 300 µm sotto la superficie piale al centro del solco rinale. I potenziali di campo sono registrati con una pipetta di vetro ( 1 - 3 MOhm ) riempita con ACSF e piazzata nello strato II/III del versante temporale del solco rinale a 500 µm dall’elettrodo di stimolazione. La stimolazione è ottenuta con impulsi costanti di corrente della durata di 0,2 ms ad una frequenza di 0,033 Hz. Ho usato l’ampiezza dei potenziali di campo evocati nelle vie orizzontali dello strato II/III come misura della risposta sinaptica eccitatoria di popolazione perché in corteccia essa riflette un pozzo di corrente monosinaptica ( Kirkwood et al 1996 ). Dopo almeno 30 minuti di stimolazione con un’intensità che produceva circa il 50% di risposta massimale, ho registrato una curva I/O con stimolazioni da 50 μA a 200 μA con incrementi di 50 μA.
Figura 29 Una fettina di corteccia peririnale. (a) Vista laterale del cervello del topo che indica le aree 35 e 36 della corteccia peririnale (PRH) su entrambi i lati del solco rinale (RS). Le linee diagonali rappresentano l’angolo di taglio delle fettine. (b) Posizionamento dell’elettrodo di stimolazione (S) e di quello di registrazione (R) nello strato II/III lungo le connessioni orizzontali. I due elettrodi sono ad una distanza di 500 micrometri.
Dopo 20 minuti di registrazione con risposta stabile ad impulsi che provocavano il 50-70% della risposta massimale ( baseline A ), sono stati somministrati un theta burst per l’LTP o una paired pulsed low frequency
stimulation ( PP-LFS ) per l’LTD secondo il tipo d’esperimento. Un theta burst
consiste in una stimolazione con 4 treni, uno ogni 15 secondi, di 10 scariche da 4 impulsi a 100 Hz con un intervallo di 200 ms tra ogni scarica. La PP-LFS consiste in 900 coppie d’impulsi intervallati da 200 ms a 2 Hz e ad intensità doppia rispetto a quella di registrazione. Dopo la prima induzione si torna alla stimolazione di base per 30 minuti ( baseline B ), poi una nuova induzione, altri 30 minuti di registrazione standard ( baseline C ), una terza induzione e 45 minuti finali di registrazione standard ( baseline D ). In alcuni casi d’esperimento di LTD, l’ultima registrazione è stata seguita da un theta burst ed una nuova registrazione standard per valutare la vitalità delle sinapsi depresse (fig. 30). Per cominciare a studiare il meccanismo molecolare d’induzione dell’LTD con la PP- LFS 7 fette d’altri 3 topi sono state trattate con (±)-3-(2-carboxypiperazin-4-
yl)propyl-1-phosphonato ( CPP ) 20 µM, un potente bloccante dei recettori
NMDA, dieci minuti dopo l’inizio della registrazione della baseline fino a 10 minuti dopo la PP-LFS. I risultati sono stati confrontati con quelli di 7 fette di controllo prese da altri 2 topi. Alla fine d’ogni registrazione, è stato somministrato acido chinurenico 1mM, un potente bloccante glutammatergico, per valutare la componente non post sinaptica dell’onda registrata. Sono state eliminate a posteriori tutte le registrazioni che mostravano un cambiamento d’ampiezza dell’artefatto elettrico o del volley presinaptico e una componente post sinaptica minore del 70% dell’onda registrata.
Figura 30 Esempio di esperimento di LTD. (a) Dopo 20 minuti di baseline stabile sono somministrati 3 PPLFS indicati dalle frecce arancioni. Dopo 45 minuti dall’ultima PPLFS è somministrato un theta burst (freccia verde) che ripotenzia le connessioni evidentemente ancora sane. Dopo 20 minuti dal theta burst la fettina viene perfusa con acido chinurenico per bloccare la risposta post-sinaptica. (b) Forme d’onda dei fEPSP con l’artefatto di stimolazione prese negli ultimi 5 minuti di registrazione indicati dalle rispettive lettere maiuscole nel grafico in (a). L’onda A è presa dalla baseline di partenza. La freccia indica la componente dovuta al volley presinaptico. Il picco negativo dei potenziali diminuisce progressivamente i B, C e D a causa dell’LTD e aumenta di nuovo dopo il theta burst (E). L’acido chinurenico abolisce quasi completamente la risposta post-sinaptica lasciando inalterata la componente presinaptica (F). Ciascuna delle onde A-F è la media di 10 sweeps consecutivi (5 minuti, uno sweep ogni 30 secondi).