2.3.1 L’overtraining determina una buona memoria di riconoscimento a 2 ore
Ho sottoposto 16 topi al protocollo di familiarizzazione distribuita (
overtraining ) con due diversi oggetti nell’Y-maze (fig. 31). I due oggetti sono
stati scambiati di posto prima d’ogni sessione rispetto alla precedente. Nella prima sessione di familiarizzazione i topi esploravano l’oggetto posto nel braccio destro per 14,01 secondi e quello posto nel braccio sinistro per 14,84 secondi. Nell’ottava e ultima sessione di familiarizzazione i topi esploravano l’oggetto posto nel braccio destro per 2,94 secondi e quello posto nel braccio sinistro per 3,14 secondi. Visto che la posizione dei due oggetti rispetto ai due bracci dell’Y-
maze era controbilanciata si può inferire che i topi esploravano alla stessa maniera
i due oggetti senza distorsioni dovute alla posizione ( ANOVA a due vie per misure ripetute, posizione numero di sessione, P = 0,059 ).
Figura 31 Y-maze vORT: overtraining. I tempi d’esplorazione medi di 16 topi wild-type nei due bracci dell’apparato sono espressi in secondi e sono indicati i SEM. Le barre rosse si riferiscono al braccio destro e quelle verdi al braccio sinistro. I due oggetti nell’ottava e ultima sessione sono stati scambiati di posto. Non c’è una preferenza né per uno dei due bracci né per uno dei due oggetti.
Dopo 2 ore dall’ultima familiarizzazione ho rimesso gli animali nell’Y-maze sostituendo uno dei due vecchi oggetti con un nuovo oggetto. I topi esploravano maggiormente l’oggetto nuovo ( t test per dati appaiati, P 0,001 ) con un tempo totale d’esplorazione di 16,81 secondi. L’indice di discriminazione era di 0,31 0,06 SEM (fig. 32).
Si noti come i tempi d’esplorazione nell’ultima sessione d’esplorazione sono inferiori rispetto a quelli della prima sessione, tuttavia gli animali mostrano un parziale recupero della curiosità quando è aggiunto il nuovo oggetto.
Figura 32 Y-maze vORT: scelta. I tempi d’esplorazione si riferiscono al primo minuto di permanenza nell’apparato di 16 topi wild-type dopo overtraining. La barra blu indica il tempo d’esplorazione media dell’oggetto nuovo con il SEM. La barra gialla indica quello dell’oggetto vecchio incontrato durante l’overtraining.
2.3.2 La paired pulses low frequency stimulation induce un LTD NMDA-dipendente
Ho valutato la capacità di indurre un LTD delle connessioni orizzontali nello strato II/III della corteccia peririnale mediante paired pulsed low frequency
stimulation ( PPLFS ) e dopo ne ho studiato la dipendenza dai recettori NMDA
(fig. 33).
La PPLFS delle connessioni orizzontali nello strato II/III della corteccia peririnale è in grado di provocare un LTD del 28,16% 0,53 SEM a 45 minuti dall’induzione. La depressione della via sinaptica è inibita dal CPP, un antagonista dei recettori NMDA, visto che in questo caso l’LTD e del 6,28% 0,92 SEM ( ANOVA a due vie per misure ripetute, ampiezza del potenziale di campo × tempo, P 0,001; nessun’interazione, P = 0,093 ).
Figura 33 LTD NMDA-dipendente indotto da PPLFS. 15 minuti di paired pulse stimulation a 2 Hz (freccia verde) inducono un LTD delle connessioni orizzontali dello strato II/III della peririnale (quadrati blu, N=7). La somministrazione di CPP 20 µM (barra rossa) attenua notevolmente gli effetti della PPLFS (cerchi rossi, N=7) (b) fEPSP degli ultimi 5 minuti di baseline (traccia nera) e degli ultimi 5 minuti di registrazione dopo PPLFS. (c) Come in (b), ma le onde si riferiscono ad una fettina trattata con CPP.
2.3.3 L’apprendimento visivo induce un indebolimento della forza delle connessioni peririnali orizzontali
Ho sottoposto un gruppo di 12 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 11 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ). Dopo 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining ho registrato ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina. L’analisi delle due curve input / output mediante ANOVA a due vie per misure ripetute ( intensità di stimolazione trattamento ) mostra un’interazione significativa fra i due fattori ( P = 0,02 ). E’ evidente che la familiarizzazione visiva provoca una diminuzione dell’output sinaptico lungo le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale (fig. 34).
Figura 34 La familiarizzazione visiva diminuisce l’efficacia delle connessioni peririnali. Curve I/O tratte da 12 topi non familiarizzati (blu) e 11 topi familiarizzati con overtraining (rosso).
2.3.4 La memoria di riconoscimento visivo è sostenuta da cambiamenti complementari di LTD ed LTP peririnali
Ho tentato di capire se questa diminuzione di guadagno è dovuta ad un meccanismo simile a LTD sottoponendo un gruppo di 7 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 8 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ) e registrato ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina a 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining e dopo tre induzioni di LTD mediante PPLFS (fig. 35). Il gruppo di controllo presentava una LTD del 47,07% 0,37 SEM, mentre il gruppo d’animali trattati mostrava un LTD del 30,47% 0,45 SEM. Se ne deduce che gli animali che hanno familiarizzato con gli oggetti mostrano un’occlusione parziale dell’LTD ( ANOVA a due vie per misure ripetute, tempo trattamento, P = 0,043; non c’è interazione tra i due fattori, P = 0,401 ). Successivi test post hoc di Student-Newman-Keuls dimostrano che l’LTD dopo la seconda induzione non è saturato né nel gruppo di controllo ( P = 0,003 ), né nel gruppo d’animali trattati ( P = 0,039 ). L’esame della figura mostra in ogni modo una tendenza maggiore alla saturazione dell’LTD negli animali trattati. Ho verificato se le sinapsi apparentemente depresse conservassero la capacità di andare incontro ad LTP somministrando un theta burst. Entrambi i gruppi mostravano un ripotenziamento delle sinapsi in precedenza depresse ( dati rinormalizzati, controlli: 11,73% 0,73 SEM, trattati: 16,58% 0,72 SEM ).
Figura 35 Parziale occlusione dell’LTD peririnale dovuta alla familiarizzazione visiva. (a) Tre PPLFS (frecce arancioni) inducono meno LTD
negli animali che hanno visto degli oggetti durante l’overtraining nell’Y-maze (cerchi rossi, N=8) rispetto ai topi che non hanno subito alcuna familiarizzazione nell’Y-maze (quadrati blu, N=7); P<0,05. Somministrando un theta burst (freccia verde) le sinapsi vengono ripotenziate a testimonianza della loro buon’efficienza dopo i tre PPLFS. (b) fEPSP durante la baseline (onda nera) e dopo 45 minuti dalla terza PPLFS (onda arancione) nella peririnale ex vivo di un topo che non ha incontrato oggetti visivi. (c) fEPSP durante la baseline (onda nera) e dopo 45 minuti dalla terza PPLFS (onda arancione) nella peririnale ex vivo di un topo che ha incontrato oggetti visivi durante l’overtraining.
Se l’LTD ipotizzato durante la familiarizzazione visiva muove l’efficacia sinaptica verso valori più bassi entro un range di modificazione sinaptica inalterato, è possibile prevedere una maggiore capacità di andare incontro ad LTP nella corteccia peririnale degli animali che hanno effettivamente incontrato degli oggetti visivi durante l’overtraining rispetto a quelli che non ne hanno visti. Ho allora sottoposto un gruppo di 5 topi ad overtraining senza oggetti visivi ( controlli ) ed un gruppo di 6 topi ad overtraining con oggetti visivi ( trattati ) e registrando ex vivo i potenziali di campo attraverso le connessioni orizzontali dello strato II/III della corteccia peririnale in fettina a 2 ore dall’ultima sessione d’overtraining e dopo tre induzioni di LTP mediante theta burst (fig. 36). La precedente previsione era giusta visto che il gruppo di controllo presentava un LTP del 5,20% 6,37 SEM, mentre il gruppo d’animali trattati mostrava un LTP del 33,57% 6,98 SEM ( ANOVA a due vie per misure ripetute, tempo trattamento, P = 0,015; non c’è interazione tra i due fattori, P = 0,425 ).
Figura 36 Variazioni dell’LTP complementari a quelle dell’LTD. (a) Tre theta bursts (frecce verdi) inducono più LTP negli animali che hanno visto degli oggetti durante l’overtraining nell’Y-maze (cerchi rossi, N=6) rispetto ai topi che non hanno subito alcuna familiarizzazione nell’Y-maze (quadrati blu, N=5); P<0,05. (b) fEPSP durante la baseline (onda nera) e dopo 45 minuti dal terzo theta burst (onda arancione) nella peririnale ex vivo di un topo che non ha incontrato oggetti visivi. (c) fEPSP durante la baseline (onda nera) e dopo 45 minuti dal terzo theta burst (onda arancione) nella peririnale ex vivo di un topo che ha incontrato oggetti visivi durante l’overtraining.