Gli acidi nucleici di origine placentare rilasciati nella circolazione materna durante la gestazione si studiano già da qualche anno per il loro potenziale ruolo nella diagnosi prenatale non invasiva e nel monitoraggio delle complicazioni correlate alla gravidanza. I miRNA placenta specifici derivano dal trofoblasto e sono rilasciati nella circolazione materna durante la gravidanza tramite esosomi. E’ dunque fondamentale vedere quali miRNA placenta specifici sono rilevabili nella circolazione materna, in quale trimestre, e qual è la loro valenza come biomarker diagnostico.
In questo progetto di tesi è stato studiato il profilo di espressione dei miR-141, miR- 200c, miR-518b, riportati in letteratura come associati alla gravidanza, usando come controllo endogeno il miR-16 [61], che ha presentato livelli d’espressione stabili e paragonabili sia nel gruppo dei casi che dei controlli. In particolare l’analisi è stata condotta su 30 donne gravide al primo trimestre di gravidanza, che si sono sottoposte a villocentesi, e su 30 donne non gravide dello stesso intervallo d’età. Il numero limitato della casistica dipende dai criteri di inclusione ed esclusione stringenti applicati in questo studio e quindi dalla difficoltà nel reclutare pazienti e controlli che rispondessero perfettamente ai requisiti richiesti. In questo modo è stato possibile ridurre al minimo le interferenze sui livelli di espressione dei miRNA da parte di fattori secondari, in accordo con i dati di letteratura.
I 3 miRNA analizzati sono stati selezionati dalla letteratura e sono il miR-141, il miR- 200c ed il miR518b.
Sebbene i miRNA miR-200c, miR-141 fossero già stati riportati come associati alla gravidanza, ci interessava capire se la loro associazione fosse specifica per il primo trimestre. Infatti alcuni autori li hanno riscontrati nel primo trimestre, altri nel primo e nel terzo, altri per tutta la durata della gravidanza. Inoltre, essendo parte del pattern d’espressione delle cellule staminali embrionali, livelli d’espressione alterati di questi miRNA potrebbero riscontrarsi in caso di aborti spontanei o essere in qualche modo correlati a valori alterati del test combinato e a risultati patologici dell’esame citogenetico.
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Il miR-518b, invece, è stato riportato in tutti i lavori analizzati come associato alla gravidanza indipendentemente dal trimestre [34,36,40,41,43,57,61,62,63,64,65], in più è stato riportato il coinvolgimento di questo miRNA nella preeclampsia [41,55,57]. Pertanto abbiamo ritenuto importante validare la presenza del miR-518b nel plasma di donne gravide, a prescindere dalla condizione di primipare, solo durante il primo trimestre di gravidanza. Se è vero che livelli elevati di miR-518b si riscontrano già nel primo trimestre e che possono indicare un rischio aumentato per la donna, la sua analisi d’espressione potrebbe garantire un miglior monitoraggio della gravidanza stessa già dalle primissime fasi.
Nel nostro studio l’unico miRNA risultato associato alla gravidanza in maniera statisticamente significativa già nel primo trimestre è il miR-518b, che fa fa parte del cluster C19MC che comprende 54 miRNA predetti, 43 validati, di cui i più noti sono:
miR-517a, miR517b, miR-516b, miR-525-5p, miR-512-3p, and miR-515-3p. Si tratta di un cluster altamente espresso nel trofoblasto umano primario, essenziale per il mantenimento della normale fisiologia della placenta [49]. Il miR-518b sembra esser implicato nella regolazione dell’invasività, proliferazione ed apoptosi delle cellule del trofoblasto, e per questo potrebbe essere anche coinvolto nella patogenesi della preeclampsia. Inoltre il miR-518b è tra i miRNA sovraespressi nel tessuto placentare di pazienti con mole idatiforme completa rispetto a quello otteuto da aborti spontanei al primo trimestre di gravidanza, con espressione preferenziale nei villi primari [51]. Diversi studi hanno dimostrato un’espressione ridotta di miR-518b (perlopiù in campioni placentari) associata alla presenza di ritardo di crescita
intrauterina [59,65,67].
Nello studio di Kotlabova del 2011 [56] questo miRNA è risultato un marker ottimale a fini diagnostici e prognostici, relativamente ai disturbi legati alla gravidanza sopra menzionati. Ciò ha suggerito un suo potenziale utilizzo come biomarker precoce di preeclampsia da analizzare prima della comparsa dei sintomi clinici caratteristici della stessa.
Morales-Prieto [68] in un lavoro pubblicato nel 2013, mette in evidenza come il
C19MC, rispetto ad altri cluster di miRNA associati alla gravidanza, sia poco espresso
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perché esiste una correlazione diretta con la crescita e lo sviluppo della placenta. Nel 2014 Ura [69] ha dimostrato come miR-518b sia sovraespresso nel plasma di donne con preeclampsia severa rispetto a donne con gravidanze prive di anomalie. Nel 2014 Hromadnikova e collaboratori [66] hanno dimostrato una sovraespressione di 4 miRNA, fra cui miR-518b, rilevata nel primo trimestre di gravidanza di donne destinate a sviluppare poi ipertensione gestazionale (che rappresenta una delle caratteristiche principali della preeclampsia). Lo stesso gruppo, ha proposto la possibilità di utilizzare in modo combinato miR-520h e miR-518b come biomarker utili per predire i casi di ipertensione gestazionale. Negli studi analizzati all’inizio del progetto di tesi dai quali è stato selezionato questo miRNA non era ben definito in che modo fosse associato alla gravidanza nei vari trimestri. L’aver selezionato dei casi che non andassero oltre la 13° settimana di gestazione, ci ha permesso di validare la sua presenza già nelle prime settimane, le stesse alle quali si riferisce la diagnosi prenatale invasiva e non [70,71,73,74,75,77]. Contrariamente al miR-518b, i miR-200c e miR-141, non hanno mostrato differenze d’espressione statisticamente significative tra il gruppo dei casi e quello dei controlli. Entrambi i miRNA erano stati riportati come associati alla gravidanza in più lavori presenti in letteratura, con risultati discordanti in merito al trend d’espressione durante le varie fasi della gestazione. La loro mancanza di associazioni statisticamente significative con la gravidanza in questo studio potrebbe essere principalmente dovuta o all’utilizzo di una casistica limitata o ad un’ espressione differenziale effettivamente rilevabile solo in stadi della gravidanza avanzati, ovvero dopo il 1° trimestre.
In questo progetto di tesi è stata inoltre valutata l’eventuale esistenza di un’associazione statisticamente significativa tra i livelli d’espressione dei miRNA analizzati e il numero di gravidanze. Per nessuno dei miRNA analizzati è stata riscontrata una differenza d’espressione statisticamente significativa, nè nel gruppo dei casi tra primipare e non, nè nel gruppo dei controlli tra donne mai state incinte e donne non incinte al momento del prelievo. L’esclusione dell’esistenza di interferenze di gravidanze presenti con i livelli d’espressione di miRNA è un risultato importante e fondamentale sia per la valutazione degli stessi come biomarker di problemi legati alla gravidanza, sia nell’ottica di una diagnosi prenatale non invasiva. Infatti tutti gli studi iniziali di diagnosi prenatale non
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invasiva basati sull’utilizzo di cellule fetali isolate da plasma materno, sono poi stati abbandonati, oltre che per la difficoltà delle metodiche, anche e soprattutto per l’impossibilità di distinguere cellule appartenenti ad eventuali gravidanze passate. Infine abbiamo valutato nel gruppo dei casi se era presente un’associazione tra i livelli d’espressione dei miRNA analizzati (miR-518b, miR-200c, miR-141) e l’esito del Test Biochimico effettuato dalle gestanti. Anche in questo caso non è stata rilevata alcuna differenza statisticamente significativa nei livelli d’espressione dei 3 miRNA. Si tratta ovviamente di un risultato del tutto preliminare e speculativo, è necessario aumentare la casistica ed eventualmente stratificare ulteriormente i casi, sulla base del tipo di anomalia ecografica, della risposta specifica del test combinato (rischio aumentato per trisomia 13, 18 o 21) e delle fasce d’età.
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