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UNIVERSITÀ DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Magistrale in Biologia applicata alla
Biomedicina
Tesi di Laurea Magistrale
“Valutazione del profilo d’espressione di miR-141,
miR-200c, miR-518b in donne al primo trimestre di
gravidanza”
Candidato Relatore
Michele Positino Prof. Stefano Landi
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Alla mia famiglia e tutti i miei cari,
senza il cui sostegno
non sarei mai
potuto arrivare
fin qui.
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INDICE
Riassunto……….. 5
1. INTRODUZIONE
………. 71.1 I microRNA ……… 7
1.1.1 Definizione e meccanismo d’azione……….. 7
1.1.2 miRNA e gravidanza………. 10
1.1.3 miRNA selezionati in questo studio……….. 17
2. SCOPO DEL LAVORO……….……….…..
193. MATERIALI E METODI
………. 203.1 Criteri di selezione dei miRNA analizzati in questo studio………. 20
3.2 Criteri di arruolamento delle partecipanti allo studio…….………. 21
3.3 Raccolta e processamento del campione………. 24
3.4 Estrazione dell’RNA……… 25
3.5 Analisi dell’espressione dei miRNA mediante Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR)……… 27
3.6 Analisi dei risultati ……….. 35
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4. RISULTATI
……… 384.1 Valutazione statistica dell’associazione alla gravidanza nel primo trimestre dei tre miRNA analizzati………. 40
4.2 Valutazione statistica tra i livelli di espressione dei miRNA analizzati nel plasma delle sole donne gravide in relazione allo stato di primipara o multipara……….. 46
4.3 Valutazione statistica tra i livelli d’espressione dei miRNA analizzati nel plasma di donne non gravide al momento dello studio, in relazione all’aver avuto eventuali precedenti gravidanze………..………. 49
4.4 Valutazione statistica tra i livelli d’espressione dei miRNA analizzati e l’esito del Test Biochimico nelle sole donne gravide……… 52
5.
DISCUSSIONE
……….. 56
6.
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE
…………..
607. APPENDICE
……….
617.1 La diagnosi prenatale………. 61
7.1.1 Diagnosi prenatale invasiva………. 61
7.1.2 Diagnosi prenatale non invasiva……….. 64
7.1.3 Test di screening non invasivi di nuova generazione……… 65
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RIASSUNTO
La diagnosi prenatale si basa principalmente su tecniche invasive (villocentesi e amniocentesi) dotate di elevatissima accuratezza diagnostica, che tuttavia presentano un importante seppur basso (0,5-1%) rischio di aborto; richiedono tempi di risposta che vanno dai 3 ai 10 giorni e nell’1% dei casi non sono risolutive per fallimenti delle colture cellulari. La scoperta nel 1997 che il 3-5% di DNA circolante libero nel plasma materno è di origine fetale ha aperto nuove strade nella ricerca di un metodo non invasivo di diagnosi prenatale e sono già disponibili test di screening per le più comuni aneuploidie cromosomiche, tra cui la trisomia del cromosoma 21. Inoltre, recentemente diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato la presenza nel plasma materno di microRNA (miRNA) associati in maniera specifica alla gravidanza e non rilevabili nel plasma di donne non gravide. I miRNA associati alla gravidanza persistono nella circolazione materna per tutta la durata della gestazione e e non sono più rilevabili subito dopo il parto. Questo progetto di tesi è volto alla messa a punto di un metodo di estrazione e quantificazione di miRNA da plasma materno e quindi all’analisi del profilo di espressione di tre miRNA (miR-141, miR-200c, miR-518b), implicati in meccanismi fisiologici o patologici della madre e/o del feto. In particolare il nostro obiettivo è verificare l’effettiva associazione di questi miRNA alla gravidanza nel primo trimestre, dal momento che i dati di letteratura sui loro livelli di espressione nei diversi trimestri sono discordanti. Questo lavoro, approvato dal Comitato Etico Area Vasta Nord Ovest (CEAVNO) dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana, è stato svolto presso l’U.O. Laboratorio di Genetica Medica in collaborazione con l’U.O. di Ostetricia e Ginecologia. L’analisi d’espressione dei tre miRNA su plasma materno è stata eseguita mediante “Quantitative Real Time PCR” con sonde “Taqman”, su donne gravide al primo trimestre e su donne non gravide come popolazione di controllo. L’analisi statistica è stata effettuata mediante il software “SPSS” (Statistical Package For The
Social Science) utilizzando il test U di
Mann-Whitney. Il miR-141 ed il miR-200c non hanno dato risultati statisticamente significativi. Invece il miR-518b è risultato associato alla gravidanza nel primo trimestre in maniera statisticamente significativa (p value <0.05). Inoltre i livelli di espressione dei 3 miRNA sono stati messi in relazione con la condizione o meno di
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primipare delle donne gravide ed è stata esclusa, nella nostra casistica, l’esistenza di interferenze sul profilo di espressione di tali miRNA relativa a gravidanze precedenti. Sebbene si tratti di uno studio d’associazione preliminare, che necessita di essere validato su un maggior numero di casi, i risultati ottenuti suggeriscono di approfondire le analisi del miR518b e di valutarne il possibile ruolo di biomarcatore precoce della gravidanza, dal momento che è coinvolto in fenomeni importanti quali la preeclampsia ed il ritardo di crescita intrauterino.
In futuro ci proponiamo di estendere l’analisi d’espressione anche ad altri miRNA gravidanza specifici, infatti lo screening dei livelli dei miRNA di origine placentare nel plasma materno potrebbe aiutare a distinguere le gravidanze che procederanno normalmente da quelle che andranno incontro ad anomalie già durante il primo trimestre di gestazione, e in tal senso potrebbe implementare gli attuali metodi di diagnosi prenatale non invasiva.
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1. INTRODUZIONE
1.1 I MICRORNA
1.1.1 Definizione e ruolo nei processi biologici
I microRNA (miRNA) costituiscono una famiglia di piccoli RNA endogeni non codificanti a singolo filamento (Single Stranded, SS), di lunghezza compresa tra i 21 e i 25 nucleotidi, il cui ruolo fondamentale è quello di regolare negativamente l’espressione
genica a livello
post-trascrizionale (Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS). Numerosi studi hanno dimostrato come tali molecole siano in grado di impedire la traduzione proteica di RNA messaggeri (mRNA) di geni target, inducendone in alcuni casi anche la degradazione [1-3].
Nell’uomo i miRNA ad oggi identificati sono circa 1800 e regolano dal 30% al 60% di tutti i geni codificanti per proteine [4-9] . I geni che codificano per i miRNA rappresentano circa l‘1-5% del genoma [10], costituiscono delle unità trascrizionali autonome, sono distribuiti su tutti i cromosomi, eccetto il cromosoma Y, e nel 50% dei casi sono organizzati in cluster. I geni miRNA di uno stesso cluster, spesso correlati anche funzionalmente, vengono trascritti simultaneamente in un trascritto primario policistronico [3]. Numerosi dati sperimentali dimostrano che i miRNA agiscono in diversi processi biologici: proliferazione cellulare, apoptosi, differenziamento, controllo dello sviluppo embrionale, risposta a particolari condizioni di stress ambientale, differenziamento neuronale e adipocitico, secrezione dell’insulina, tumorigenesi e progressione metastatica, controllo di alcune fasi della gravidanza, differenziamento delle cellule B, mantenimento e differenziazione delle cellule staminali neuronali, controllo della funzione immunitaria, sviluppo, differenziamento e regolazione delle funzioni del sistema nervoso, cardiovascolare e immunitario, metabolismo dei grassi e difese antivirali [10-23].
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È stato inoltre dimostrato che i miRNA presentano profili di espressione tessuto-specifici e diversificati in rapporto ai diversi stadi di sviluppo, per cui ogni tessuto è caratterizzato da un peculiare profilo d’espressione di miRNA [24].
Sintetizzati come pre-miRNA, queste molecole vanno incontro ad un processo di maturazione che in ultimo porta alla formazione di un complesso proteico “RISC” (RNA-induced Silencing Complex, RISC) all’interno del quale si trova il miRNA maturo. Nel complesso proteico del RISC, il miRNA maturo è in grado di appaiarsi a sequenze complementari presenti nella regione 3’UTR di mRNA e di regolarne
l’espressione genica a livello
post-trascrizionale.
Il meccanismo d'azione dei miRNA si basa sulla complementarietà tra una sequenza specifica del miRNA, detta sequenza “Seed”, che comprende i primi 6-8 nucleotidi all’estremità 5’del miRNA, e il sito di legame sul 3‘UTR dell’mRNA bersaglio, che può contenere siti multipli di legame per il miRNA.
Il grado di complementareità miRNA/mRNA determina il tipo di meccanismo d’azione: 1. mRNA “cleavage”: complementareità perfetta miRNA target;
2. “Translational repression”: complementarietà imperfetta miRNA-Target.
Se la complementarietà è perfetta, il miRNA determina la degradazione dell’mRNA nei cosiddetti p-bodies (processing Bodies), in cui si accumulano mRNA non tradotti, proteine Argonauta, miRNA maturi e repressori trascrizionali [25,26]. Quando invece la complementareità miRNA-target è imperfetta, si ha l’inibizione della traduzione dell’mRNA target, senza degradazione di quest’ultimo. La repressione può avvenire allo stadio di inizio, nella fase di allungamento della catena proteica, durante la terminazione della traduzione, o mediante proteolisi del peptide nascente [27,28]. I miRNA possono bloccare la traduzione anche impedendo l'associazione iniziale del ribosoma con l'mRNA. Il meccanismo di repressione traduzionale, che non implica la degradazione del messaggero, è quello più frequente nell'uomo e negli animali.
In ogni caso il risultato finale sarà la mancata traduzione del trascritto e quindi
9 Figura 1. Biogenesi e
meccanismo d’azione dei miRNA
10 1.1.2 miRNA e gravidanza
Nell’ultimo decennio diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato la presenza di miRNA di origine placentare nel plasma materno, che persistono per tutta la durata della gravidanza ed i cui livelli decadono significativamente subito dopo il parto. La maggiore fonte di miRNA liberi circolanti di origine placentare nel sangue materno (cff-miRNA) origina dai villi coriali del trofoblasto, in grado di rilasciare esosomi contenenti miRNA nella circolazione materna [30-35].
I miRNA associati alla gravidanza, perché appunto si riscontrano a livelli significativamente più bassi o sono del tutto assenti in donne non gravide rispetto alle gestanti [34], potrebbero in futuro essere utilizzati come biomarcatori per monitorare l’andamento della gravidanza e per valutare la presenza di anomalie fetali, implementando dunque gli attuali metodi di diagnosi prenatale invasiva e non invasiva che sono stati riassunti, per completezza di informazione, nell’appendice della tesi [36-41].
Tuttavia gli studi ad oggi condotti sono relativamente pochi, per cui sarebbe necessario indagare i meccanismi di regolazione nei quali questi miRNA associati alla gravidanza
sono coinvolti.
Uno dei primi lavori in cui specifici miRNA sono stati identificati come “associati alla gravidanza” è quello di Chim e collaboratori [32] che hanno individuato 4 miRNA placentari rilevabili nel plasma materno solo durante la gravidanza: miR-141, miR-149, miR-299-5p, and miR-135b. Tra questi il miR-141 è il primo per il quale è stato dimostrato un aumento d’espressione direttamente proporzionale al progredire della gravidanza, ciò potrebbe essere correlato ad un aumento di dimensioni della placenta. Nel 2009 Luo e collaboratori [35] hanno dimostrato nel plasma materno la presenza di specifici miRNA rilasciati dai trofoblasti placentari tramite esosomi; alcuni di questi miRNA, tra cui il miR-517 a e il miR-518b (che appartengono allo stesso cluster) sono stati individuati come associati alla gravidanza. Gli stessi autori hanno condotto anche studi di proteomica su linee cellulari di trofoblasti umani “BeWo”, dimostrando che il miR-517a è regolato, facendone anche parte, dalla via di trasduzione del segnale che coinvolge il fattore di necrosi tumorale (TNF). Tale fattore, attraverso due recettori
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(TNFR1 e TNFR2), è in grado di provocare una varietà di effetti biologici sui trofoblasti placentari quali apoptosi, inibizione della sincizializzazione e produzione ormonale; in
ogni caso rimane da delucidare come
miR-517a sia coinvolto in questa cascata di segnale.
Segue poi il lavoro del gruppo di Miura del 2010 [34] che ha identificato 24 miRNA, la maggior parte dei quali costituiscono due clusters, uno sul cromosoma 19 e uno sul 14, in regioni critiche per lo sviluppo placentare ed embrionale. Tra i miRNA riportati come associati alla gravidanza, rispetto al lavoro precedentemente pubblicato, è stato riconfermato il miR-141, anche se in questo studio le differenze tra i suoi profili d’espressione nel primo e terzo trimestre non sono statisticamente significative. Nello studio viene nuovamente ribadito come sia miR-141 che molti dei miRNA appartenenti
al cluster 19q13.42 (miR-518b,
miR-515-3p, miR-517a, miR-517c, miR-526b) siano da ritenersi associati alla gravidanza poiché i loro livelli d’espressione post parto si riducono a quasi un terzo rispetto a quelli espressi durante la gestazione. Inoltre è stato indagato il miR-154*, i cui livelli d’espressione non cambiano significativamente tra il primo ed il terzo trimestre e che fa parte del set specifico di miRNA espressi nelle cellule staminali embrionali insieme a miR-200c, miR-368, miR-371, miR-372, miR-373*, miR-373, in base a quanto riportato già nel 2004 da Suh [42].
Nel 2011 Hailing Li e collaboratori [43] hanno valutato l’espressione di 147 miRNA in donne al primo, secondo e terzo trimestre di gravidanza e in donne non gravide. Gli autori hanno individuato miRNA espressi costantemente per tutta la gravidanza e miRNA espressi preferenzialmente in un trimestre piuttosto che in un altro. In particolar modo sono stati individuati 3 cluster principali in cui figurano miRNA associati alla gravidanza: il cluster miR-200c/141, a cui appartengono miR-200c e miR-141, il cluster 200b, di cui fan parte 200a, 200b e 429, ed infine il cluster miR-222, in cui figurano miR-221 e miR-222. E’ stato indagato il profilo d’espressione dei tre cluster durante i vari trimestri ed è emerso che mentre miR-200c e miR-200b (intesi come cluster), presentano un’elevata espressione nel primo e nel terzo trimestre ma son
del tutto assenti (miR-200c) o quasi
( miR-200b) durante il secondo trimestre di gravidanza, miR-222 è sovraespresso durante il secondo trimestre, ma del tutto assente sia durante
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il primo che durante il terzo trimestre.
Il miR-141, appartenente proprio al cluster miR-200c, è stato riportato già in altri lavori come miRNA associato alla gravidanza, tuttavia il livello d’espressione del miRNA nel plasma, post parto, riportato da Li, è ridotto di due terzi rispetto a quello presente nel primo trimestre di gestazione. Uno studio precedente di Chim e collaboratori, [32] sebbene avesse in primis saggiato il profilo d’espressione di miR-200c durante il primo trimestre di gestazione su tessuto placentare, e dopo il travaglio nel plasma, aveva invece messo in luce un calo drastico dei livelli d’espressione che arrivavano a 1/18° rispetto a quelli iniziali rilevati [32]. Questo potrebbe dipendere o dal diverso campione di partenza (Chim utilizza la placenta in fase di rilevazione iniziale, ma il plasma dopo il travaglio, mentre Li utilizza sempre e solo il plasma materno), o dalla diversa età gestazionale delle partecipanti allo studio, o dalla condizione di primipare (Li) o multipare (Chim). Il cluster miR-200c, in particolar modo il miR-200c, che mappa in 12p1.3.31, è espresso nelle cellule staminali embrionali e sembra essere coinvolto nella carcinogenesi del tumore al seno. Questo miRNA fa parte del gruppo di miRNA espressi specificamente nelle cellule staminali embrionali (hES), reprime i geno SOX2 e
KFLU4 coinvolti in fondamentali processi regolatori delle stesse [42,44,45].
Nel 2007 il gruppo guidato da Pineles [46] saggiando l’espressione di 157 miRNA su tessuto placentare ha dimostrato come miR-182 e miR-210 fossero sovraespressi in modo differenziale in tessuti placentari di donne affette da preeclampsia rispetto a donne con gravidanze prive di anomalie e/o complicazioni. La preeclampsia, un disturbo della gravidanza che mostra un’incidenza del 5-7% e si manifesta solitamente dopo la 20° settimana di gestazione, è caratterizzato principalmente da edema, ipertensione e proteinuria nella gestante; tra le sue conseguenze più gravi ci sono il distacco di placenta ed il parto prematuro. Ad avvalorare l’esistenza di una correlazione tra miRNA e preeclampsia, si aggiungono i risultati degli studi condotti da Hu [57] che hanno evidenziato un'elevata espressione di miR-222 nel plasma di donne affette da forme severe di tale disturbo. Nel 2009 Zhu e collaboratori [47], confrontando i profili d'espressione di miRNA su tessuti placentari di donne affette da preeclampsia e donne con gravidanze nella norma, hanno rilevato nelle prime un'espressione elevata di miR-517, miR-518b, miR-518c. Nel 2012, Miami A. Ali e collaboratori [48] hanno evidenziato una sovraespressione del
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miR-210 in tessuti placentari di donne affette da preeclampsia, suggerendo per altro una proporzionalità diretta tra livello di espressione del miRNA in analisi e gravità del disturbo. Dong Bao [49] ha dimostrato come la famiglia dei miR-17 sia sovraespressa in placente di donne affette da preeclampsia rispetto a placente di donne con gravidanze nella norma. In merito sempre a tale disturbo, il gruppo di Hailing [50] ha dimostrato un sovraespressione dei miR-141 e miR-29 in forme di preeclampsia non severe (“Mield Preeclampsia”) rispetto ai controlli (rappresentati da donne con gravidanze “normali”), suggerendone un possibile loro utilizzo come biomarkers.
Nel 2012, Quan e collaboratori [51] hanno rilevato una sovraespressione dei miR-518b, miR-517a, miR-517b, miR-519 nel plasma di pazienti che mostravano mole idatiforme completa (CHM, complete hydatiform moles). In particolar modo, i 517b e miR-518b sono coinvolti preferenzialmente nella regolazione delle funzioni delle cellule del trofoblasto. Il gruppo di ricerca di Kotlabova e quello di Miura [34,56], hanno inoltre evidenziato elevati livelli d'espressione nella circolazione materna di alcuni miRNA appartententi al cluster C19MC (515-3p, 516-5p, 517a, 517c, miR-518b, miR-520a*, miR-520h, miR-525, miR-526a, and miR-526b). Sebbene le funzioni biologiche a livello placentare di tale cluster non siano ancora del tutto chiarite, sembra che giochi un ruolo chiave nel mantenimento delle normali condizioni fisiologiche della placenta.
Nel 2015 Renthal [52-53], in uno studio condotto su modelli murini, ha dimostrato il coinvolgimento della famiglia miRNA-200 nella regolazione negativa dei repressori trascrizionali DNA-binding Zeb1 e Zeb2 (Zinc finger E-box binding homeobox 1 e 2), che sopprimono la contrattilità miometrica regolando negativamente l'epressione di OXTR e GJA1. OXTR è un recettore dell’oxitocina e gioca un ruolo importante nell’utero durante il parto [54]; GJA5 è un menbro della famiglia delle connessine, ha una funzione cruciale nella contrazione sincronizzata del cuore durante lo sviluppo embrionale [55].
Li e collaboratori [50], tramite studi computazionali, hanno valutato i possibili geni target dei miRNA associati alla gravidanza, selezionando i geni il cui 3’ UTR veniva riconosciuto come target da almeno 2 miRNA. E’emerso che la maggior parte di questi
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geni sono parte di pathways responsabili di patologie genetiche, immunologiche e a pathways di trasduzione del segnale cellulare.
Nel 2011 il gruppo di Kotlabova e Hromandikova [41,56] ha pubblicato due lavori sui miRNA placenta-specifici rintracciabili nel plasma materno solo durante la gravidanza e assenti nel plasma di donne non incinte. I criteri di selezione dei miRNA prefissati dagli autori erano:
1. tasso di identificazione (Detection rate) del miRNA del 100% in tessuti placentari analizzati a termine gravidanza;
2. tasso di identificazione del miRNA di almeno 67% nel plasma materno durante la gestazione;
3. assenza del miRNA nel plasma di donne non gravide.
L’unico miRNA che ha soddisfatto i 3 requisiti è stato il miR-518b, già descritto come miRNA associato alla gravidanza nei lavori di Luo [35] e Miura [34], e sovraespresso in caso di preeclampsia grave [47].
Hromadnikova e collaboratori [41] hanno analizzato i profili d’espressione dei miRNA mir-516-5p, miR-517*, miR-518b, miR-520a*, miR-520h, miR-525 e miR-526a, su tessuti placentari e plasma di donne con gravidanze normali e donne con insufficienza placentare, preeclampsia e IUGR (Ritardo di crescita intrauterino). Contrariamente all’atteso non sono state rilevate differenze d’espressione statisticamente significative tra i due gruppi, se l’esame era condotto al momento della comparsa dei sintomi clinici. Si riscontravano invece differenze statisticamente significative tra donne con gravidanze normali e donne che hanno poi sviluppato disordini correlati alla gravidanza se l’esame veniva condotto precocemente, tra la 12° e 16° settimana.
Lo screening dei livelli dei miRNA di origine placentare nel plasma materno, potrebbe dunque aiutare il clinico a distinguere le gravidanze che procederanno normalmente da
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Principali cluster dai quali derivano miRNA noti in letteratura per esser espressi durante la gravidanza in modo esclusivo o a livelli significativamente più elevati rispetto a quelli presenti in donne non gravide (Tab.1).
C19MC C14MC miR-371-3 miR-17-92 let-7 miR-34 miR-29 miR-15/16 miR-181 miR-200c/141 miR-512-1 miR-523 miR-518e miR-127-3p miR-371 miR-17 let-7b miR-34a miR-29a miR-195 miR-181a-1 miR-200c miR-512-2 miR-518f miR-518a-1 134 miR-372 miR-18a let-7d miR-34b miR-29b miR-15a miR-181a-2 miR-141 miR-1323 miR-520b miR-518d 136 miR-373 miR-19a let-7e miR-34c miR-29c miR-15b miR-181b-1 miR-498 miR-518b miR-516-1 miR-299-5p miR-20a let-7g miR-16-1 miR-181-b2 miR-520e miR-526a-1 miR-518a-2 miR-337-5p miR-19b-1 let-7c miR-16-2 miR-181c miR-512-1 miR-520c miR-517c miR-369-5p miR-92a-1 let-7f miR-181d miR-515-1 miR-518c miR-520h miR-370 let-7i miR-519-e miR-524 miR-521-1 miR-376a miR-520-f miR-517a miR-522 miR-379 miR-515-2 miR-519d miR-519a-1 miR-382 miR-519c miR-521-2 miR-527 miR-409-3p miR-1283-1 miR-520d miR-516-1 miR-410 miR-520a miR-517b miR-1283-2 miR-411 miR-526b miR-520g miR-516-2 miR-431 miR-519b miR-516b-2 miR-519a-2 miR-487b
16 C19MC C14MC miR-371-3 miR-17-92 let-7 miR-34 miR-29 miR-15/16 miR-181 miR-200c/141 miR-525 miR-526a-2 miR-539 miR-541 miR-543 miR-654-5p miR-758 miR-889
Tab. 1 – Principali cluster dai quali derivano miRNA noti in letteratura per esser espressi durante la gravidanza in modo esclusivo o a livelli significativamente più elevati rispetto a quelli presenti in donne non gravide.
17 1.1.3 miRNA selezionati in questo studio
I miRNA che rispondevano ai criteri di selezione sono i seguenti:
1) miR200c: locus cromosomico: 12p13.31. Questo miRNA fa parte del cluster miR-200c insieme al miR-141. Chim e collaboratori [32] hanno analizzato la sua espressione in tessuti placentari e sangue di donne al terzo trimestre di gravidanza,
ottenendo i seguenti risultati:
- 180.000 copie/ng RNA estratto da tessuti placentari; - 2.400 copie/ng RNA estratto da plasma ;
- 0 copie subito dopo il parto.
Il gruppo di Luo [35] ha riportato questo miRNA come associato alla gravidanza, riscontrandolo a livelli elevati nei tessuti placentari di donne al primo e al terzo trimestre di gestazione. In uno studio condotto sui profili d’espressione dei miRNA in linee di cellule staminali embrionali umane il miR-200c è risultato parte del gruppo di miRNA espressi specificamente in questo tipo di cellule, rispetto alle altre usate come controllo/riferimento [60,62].
2) miR-141: locus cromosomico: 12p13.31. Il miR-141 fa parte del cluster del miR-200c. Chim e collaboratori [32] hanno analizzato l’espressione del miR-141 in tessuti placentari e sangue di donne al terzo trimestre di gravidanza, ottenendo i seguenti risultati:
- 760000 copie/ng RNA estratto da tessuti placentari; - 6600 copie/ng RNA estratto da sangue materno; - 0 copie subito dopo il parto.
Inoltre i livelli d’espressione di questo miRNA sono stati analizzati con un saggio singolo di qRT-PCR su sangue periferico di donne al 1°-2°-3° trimestre di gestazione e
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donne non gravide: il miRNA, presente in tutti i trimestri, decade con un fold change di circa 18, poche ore dopo il parto.
Miura [34], analizzando l’espressione del miRNA in campioni di sangue periferico di donne al 1° e al 3° trimestre di gestazione, ha riscontrato livelli statisticamente significativi solo nel terzo trimestre ed ha constatato anche loro una drastica riduzione subito dopo il parto.
Lo studio di Li [61] ha dimostrato inoltre che il miR-141 ed il miR200c, in quanto parte dello stesso cluster, hanno lo stesso trend d’espressione nel 1° e nel 3° trimestre di gravidanza . Il miR-141 è coinvolto in processi di carcinogenesi del tumore al seno, inoltre come il miR-200c è parte del pattern specifico d’espressione delle hES (cellule staminali embrionali umane) [58].
3) miR-518b: locus cromosomico: 19q13.42. Luo e collaboratori [35] hanno riportato un’espressione placenta-specifica del miRNA nei tre trimestri della gravidanza nel plasma materno e lo hanno ritrovato a livelli bassissimi dopo il parto. Nel 2007, Pineles e collaboratori [46] hanno dimostrato come il miR-518b sia espresso in modo differenziale nel plasma di donne gravide affette da preeclampsia rispetto a gestanti con gravidanza senza complicazioni. Nel 2009, Zhu [47] ha osservato livelli elevati di questo miRNA nella placenta di donne affette da grave preeclampsia e in tal senso, un’ ulteriore conferma è stata data dal lavoro di Hu [57]. Miura e collaboratori [34] lo definiscono miRNA placenta specifico espresso sia nel 1° che nel 3° trimestre di gravidanza, non fanno alcun tipo di analisi nel secondo trimestre. Il gruppo di Mouillet nel 2010 [59] ha verificato come il cluster C19MC, a cui il miR-518b appartiene, sia espresso soltanto nel plasma di donne gravide. Infine Kotlablova [56] ha analizzato l’espressione del miRNA su sangue periferico di donne al 1°-2°-3° trimestre di gravidanza e di donne non gravide, riportando il miR-518b come biomarker ideale per monitorare l’andamento della gravidanza in quanto riscontrabile in tutti i trimestri.
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2. SCOPO DEL LAVORO
Lo scopo del presente lavoro è quello di confermare, in una casistica indipendente, l’eventuale associazione tra l’espressione di specifici miRNA (miR-141, miR-200c, miR-518b) nel plasma di donne, in relazione al loro stato gravidico.
In particolare si analizzerà il profilo d’espressione dei miRNA in donne che si sottopongono a villocentesi nel primo trimestre di gravidanze presso la nostra Unità Operativa e in donne sane non gravide.
Vogliamo inoltre escludere l’esistenza di interferenza legata a gravidanze precedenti paragonando i livelli di espressione dei miRNA tra donne gravide primipare e non. Infine i livelli di espressione dei miRNA saranno messi in relazione con l’indicazione alla diagnosi prenatale.
L‘individuazione di miRNA associati alla gravidanza in maniera statisticamente significativa già nel primo trimestre e la loro correlazione con patologie della madre o del feto, potrebbe permettere, in futuro, l’introduzione di specifici pannelli di miRNA nei protocolli di screening prenatale e nel monitoraggio della gravidanza.
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3. MATERIALI E METODI
3.1 Criteri di selezione dei miRNA analizzati in questo studio
Per la scelta dei miRNA sono stati analizzati gli studi pubblicati dal 2004 sull’associazione tra gravidanza e miRNA presenti nel plasma materno.
La ricerca è stata articolata in due parti:
1. raccolta dei dati generali, ovvero elenco dei miRNA riportati come associati alla gravidanza e assenti in donne non gravide, relazione con il trimestre in cui gli stessi miRNA sono stati rilevati nel plasma materno e il numero di studi in cui sono stati trovati risultati analoghi;
2. valutazione della presenza o meno di una correlazione già osservata tra miRNA gravidanza specifici e determinate fasi di sviluppo embrionale e/o problemi correlati alla gravidanza.
Non potendo, per motivi pratici ed economici, analizzare tutti i miRNA riportati in letteratura come associati alla gravidanza, sono stati scelti i miRNA che soddisfacevano questi criteri:
- in almeno due dei lavori analizzati erano riportati come associati alla gravidanza;
- per ognuno di loro erano già stati pubblicati dei lavori che li correlavano a specifici meccanismi fisiologici o patologici della madre e/o del feto.
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3.2 Criteri di arruolamento delle pazienti nello studio
Lo studio è stato condotto su due coorti distinte di pazienti: il gruppo dei casi (n = 30) costituito da donne gravide che si sono sottoposte a villocentesi tra l’11° e la 13° settimana di gestazione e il gruppo dei controlli (n=30), rappresentato da donne non gravide dello stesso range d’età.
I criteri di inclusione nello studio per il gruppo dei casi sono: - essere tra la 7° e la 14° settimana di gestazione;
- avere una gravidanza non gemellare in corso; - età compresa tra i 25 e 43 anni.
I criteri di inclusione nello studio per il gruppo dei controlli sono: - assenza di gravidanza riferita;
- età compresa tra i 25 e i 43 anni.
I criteri di esclusione nello studio per entrambi i gruppi sono: - positività per HIV-HCV riferita;
- presenza di patologie croniche o oncologiche;
- trattamenti per infertilità e fecondazione assistita in atto;
- terapie farmacologiche in atto che potessero compromettere l'esecuzione dei test previsti.
Tutti i partecipanti alla sperimentazione hanno preso visione del testo informativo e firmato un consenso informato per il trattamento del campione dei dati personali. Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico Area Vasta Nord Ovest (CEAVNO)
22
Classificazione delle partecipanti allo studio (Tab.2)
Codice Volontaria Eta’ Stato gravidico Settimana di gravidanza N° gravidanze avute (inclusa quella attuale) Indicazione alla diagnosi prenatale Esito esame citogenetico 1 32 Si 13 2 2 46, XY 2 32 Si 13 2 2 47, XX, +21 6 39 Si 12 1 1 46, XX 7 36 Si 12 1 1 46, XX 17 33 Si 11 2 2 69, XXX 30 36 Si 12 1 1 46, XX 33 36 Si 13 2 2 46,XX, t(4q;5q), +m/46,XX * 40 38 Si 11 2 2 46, XY 43 45 Si 12 2 2 46, XY 47 40 Si 12 2 2 46, XX 48 40 Si 12 2 2 46, XX 50 38 Si 12 2 2 47, XY, +13 51 37 Si 12 1 1 46, XY 57 40 Si 12 1 1 47XX,+2/ 46 XX* 69 26 Si 12 2 2 46, XY 72 32 Si 12 2 2 46, XX 75 41 Si 11 2 2 47, XX, +21 77 41 Si 12 1 1 46, XY 83 40 Si 12 1 1 46, XX 88 42 Si 12 1 1 46, XY 89 35 Si 12 2 2 46, XY 93 43 Si 12 1 1 46, XY 94 38 Si 12 1 1 46, XX 96 39 Si 13 2 2 46, XY 99 45 Si 12 1 1 46, XY 100 45 Si 12 1 1 46, XY 105 40 Si 13 1 1 46, XX 112 38 Si 12 2 2 46, XY 114 30 Si 13 1 1 46, XY 116 38 Si 12 2 2 46, XX
INDICAZIONE ALLA VILLOCENTESI: “ Età >35 anni “ = 1
“ Test biochimico positivo o altre anomalie” = 2 GRAVIDANZA: “ Prima gravidanza = 1”
“ Seconda gravidanza, inclusa quella in corso = 2 ” “ Terza gravidanza, inclusa quella in corso = 3 ”
23 Codice
Volontaria Eta’ Stato gravidico Settimana di gravidanza N° gravidanze avute Indicazione alla diagnosi prenatale Esito esame citogenetico 1C 35 No - 0 - - 2C 41 No - 3 - - 3C 43 No - 2 - - 5C 34 No - 0 - - 6C 33 No - 1 - - 7C 33 No - 0 - - 8C 33 No - 0 - - 10C 42 No - 1 - - 11C 32 No - 2 - - 13C 37 No - 0 - - 15C 38 No - 3 - - 16C 41 No - 3 - - 17C 40 No - 0 - - 18C 36 No - 1 - - 19C 40 No - 1 - - 20C 34 No - 1 - - 22C 41 No - 4 - - 23C 42 No - 1 - - 24C 37 No - 2 - - 25C 37 No - 2 - - 28C 36 No - 0 - - 29C 37 No - 0 - - 30C 38 No - 0 - - 36C 36 No - 0 - - 40C 43 No - 0 - - 43C 34 No - 1 - - 44C 38 No - 0 - - 45C 36 No - 0 - - 49C 37 No - 0 - - 70C 38 No - 2 - -
(*) Risultati discordanti tra la coltura diretta e a lungo termine. Mosaicismo di 1° livello. “C” = Controlli
24 3.3 Raccolta e processamento del campione
L’analisi dei profili di espressione dei miRNA selezionati è stata effettuata su plasma materno isolato a partire da sangue periferico. Sono state effettuate numerose prove per stabilire velocità e tempi di centrifuga idonei all’isolamento del plasma che preservassero l’integrità dei miRNA circolanti. Di seguito è descritto il protocollo utilizzato in questo studio.
1- prelievo di 4 ml di sangue materno in EDTA;
2- centrifuga a 2000g per 20' per separare gli elementi figurati dal plasma; 3- centrifuga a 3200g per 30' del surnatante ottenuto dal passaggio precedente; 4- trasferimento del surnatante in un nuovo tubino da 2ml autoclavato;
25 3.4 Estrazione dell'RNA
L'estrazione dell'RNA viene effettuata da plasma utilizzando il kit “mirVana™ PARIS™ Kit” (Fig.2) (Life Technologies, Ambion, Austin, TX, USA) in accordo con il protocollo suggerito dal produttore.
Fasi principali del protocollo d’estrazione di RNA da sangue
1. A 625 µl di campione di plasma si aggiungono 625 µl di 2X Denaturing Solution precedentemente riscaldata a 37°C per 10’. La 2X Denaturing Solution contiene un’alta concentrazione di denaturanti caotropici, che inattivano rapidamente le ribonucleasi cellulari.
2. Separazione dell’RNA dal DNA e dalle proteine, realizzata mediante l’aggiunta alla mix precedente di 1250µl di cloroformio. Il campione viene centrifugato a temperatura ambiente per 5’ a 13200 RPM. Dopo centrifugazione sono ben distinguibili tre diversi layers; il pH acido dato dal fenolo cloroformio favorisce la distribuzione di DNA e proteine tra interfase e fase organica, mentre l’RNA rimane sospeso nella fase
acquosa.
3. Trasferimento della sola fase acquosa in uno nuovo tubo e aggiunta di un volume di etanolo assoluto al 100% pari ad 1,25 volte il volume della fase acquosa. L’etanolo causa l’eventuale precipitazione di residui di
DNA presenti.
4. Trasferimento di 700 µl della soluzione in una colonnina “Filter Cartridges” provvista al suo interno di un filtro in grado di legare in modo selettivo l’RNA. Viene effettuata una rapida centrifugazione del Filter Cartridges per 15’’ a 10000 RPM in modo che il campione di interesse rimanga legato
alla membrana. L’eluato viene poi scartato.
26
contengono un volume diverso di etanolo. Ognuno dei lavaggi prevede una breve centrifugata e anche in questo caso dopo ogni lavaggio si scarta l’eluato.
6. Centrifugazione del Filter Cartridges per 1’ a 10000 RPM in modo da poter eliminare l’eventuale eluato ancora presente.
7. Trasferimento del solo filtrino presente all’interno del Filter Cartridges in un nuovo tubo ed eluizione del campione in 55 µl di“Elution Solution” preriscaldata per 30’ a 95° C.
8. Centrifugazione della colonnina con soluzione di eluizione per 30’’ a 10000 RPM.
9. Scartare il filtrino della colonnina e mantenere l’eluato contenente RNA.
La concentrazione dell'RNA estratto è stata misurata al NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, USA) ed ulteriormente validata con una qRT-PCR di prova usando la sonda specifica per l'hsa-miR-16 (controllo endogeno di questo studio).
27
3.5 Analisi dell’espressione dei miRNA mediante Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR)
La Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR), è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA o del cDNA. La quantificazione si basa sull’analisi di segnali di fluorescenza utilizzando chimiche diverse che vanno da coloranti intercalanti che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA (es. SYBR green), a sonde marcate con fluorofori ad ibridazione specifica per il frammento di interesse (es. TaqMan, sonde FRET, Molecular Beacons, Scorpion Probes). Per lo studio dell’espressione genica e dei miRNA la qRT-PCR è preceduta da una fase di retro-trascrizione, ovvero produzione di cDNA complementare all’RNA estratto.
Come la PCR classica, anche la qRT-PCR prevede una fase di denaturazione, una di annealing e una di allungamento. La principale differenza tra le due tecniche di amplificazione consiste nel fatto che nella qRT-PCR la quantificazione del prodotto è svolta nella fase esponenziale della reazione piuttosto che in quella di plateau, si ottengono così risultati molto più accurati. Infatti nella fase esponenziale l’efficienza d’amplificazione subisce influenze minime dai reagenti, enzima e nucleotidi, che sono
presenti ancora in quantità sufficienti.
La misura della quantità dei prodotti di PCR in tempo reale è possibile grazie a sistemi di monitoraggio computerizzati che in tempo reale rilevano i segnali fluorescenti emessi
28
3.5.1 qRT-PCR e TAQMAN MICRORNA ASSAY
In questo studio è stata utilizzata la metodica delle sonde Taqman. I passaggi principali per l’analisi di espressione dei miRNA sono la retrotrascrizione e l’amplificazione in qRT-PCR.
1) RETROTRASCRIZIONE:
sintesi di un filamento di cDNA mediante trascrizione inversa dell’RNA estratto.
I saggi Taqman prevedono in questa fase l’utilizzo di un primer miRNA specifico con struttura a forcina (Figura 4), che garantisce una retrotrascrizione selettiva del solo miRNA maturo, evitando quella dei suoi precursori secondari.
Per la retrotrascrizione è stato utilizzato il kit "TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription" ed i primers specifici per ogni miRNA contenuti nel kit “TaqMan
MicroRNA Assay”.
29 Preparazione mix di retrotrascrizione:
Reagenti Volume (µl)
H2O DEPC 4.16
10X Reverse Transcription Buffer 1.5
100nM dNTPs 0.15
Rnase Inhibitor 0.19
MultiScribe reverse transcriptase 1.0
Primer 5X 3.0
Dopo aver preparato la mix se ne dispensano 10µl a campione. La quantità di RNA richiesta per ogni reazione di retrotrascrizione è 5µl. Nel nostro caso per ogni campione sono state fatte 5 reazioni di retrotrascrizione corrispondenti ai 3 miRNA oggetto di studio, e i 2 riferimenti (miR-16, RNU6B).
Dopo aver incubato in ghiaccio per 5’ RNA e mix, si esegue la reazione di retrotrascrizione usando il Thermal Cycler ‘Biorad DNA engine” , secondo il profilo
di reazione riportato:
Step Tempo (min) Temp (°C)
1 30 16
2 30 42
3 5 85
30 2) AMPLIFICAZIONE DEL cDNA IN qRT-PCR
Il cDNA ottenuto è stato amplificato usando i “TaqMan® MicroRNA Assays” che contengono:
- una sonda TaqMan;
- primers Forward e Reverse miRNA-specifici; - TaqMan® Universal PCR Master Mix’.
La sonda Taqman è un oligonucleotide di circa 20-30 bp, disegnato in modo da ibridarsi in maniera specifica al frammento di interesse durante la reazione di amplificazione. La sonda è modificata chimicamente mediante aggiunta del gruppo Minor Groove Binder (MGB), che, aumentando la temperatura di melting (Tm) della sonda stessa, incrementa
la specificità di legame con il cDNA.
La sonda è dotata di due diversi fluorofori, uno ad alta energia detto Reporter localizzato all’estremità 5’ed un altro a bassa energia detto Quencher al 3'. Durante l’ibridazione della sonda con il cDNA stampo, se il campione viene irradiato, i fotoni emessi dal Reporter in 5' vengono assorbiti totalmente dal Quencher, che annulla così l'emissione del segnale di fluorescenza. Nel corso di ogni ciclo di PCR, nella fase di allungamento del cDNA complementare alla sequenza bersaglio, l’enzima Taq Polimerasi incontra l’estremità 5’ della sonda e con la sua attivita esonucleasica 5’-3’ comincia a degradarla allontanando il Reporter dal Quencher. In questo modo la fluorescenza emessa dal Reporter può esser rilevata. Quest’ultima aumenta ad ogni ciclo proporzionalmente alla quantità di sonda degradata. Alla fine si analizza il numero di cicli di amplifcazione necessari per rilevare un segnale di fluorescenza che raggiunge il “ciclo soglia” o “ct” (valore preimpostato uguale per tutti i campioni). Maggiore è il numero iniziale di copie dell’acido nucleico, minore sarà il numero di cicli necessari per un incremento significativo della fluorescenza. Di seguito è riportato il protocollo utilizzato.
31 Mix di reazione della qRT-PCR:
Reagenti Volume (µl)
H2O DEPC 7.67
TaqMan 2X Universal PCR master mix 10.0 TaqMan MicroRNA Assay Probe 20X 1.0
I Taqman microRNA Assay Probe sono specifici per ogni miRNA quindi sono state
preparate 5 mix diverse ogni volta.
Per la mix di qRT-PCR, sono state considerate tre repliche a campione e tre repliche di un controllo negativo, senza templato, in ogni piastra.
Preparata la mix, se ne dispensano 18.67 µl in ogni pozzetto della piastra,
precedentemente disegnata.
Si aggiungono infine 1.33 µl di cDNA in ogni pozzetto.
Una volta dispensate mix e cDNA, si chiude con appositi tappini la piastra e si
centrifuga brevemente.
Prima di far partire la reazione di qRT-PCR, è importante impostare i parametri di analisi (Software Step One Plus Software by Applied Biosistems): assegnazione dei campioni per ogni pozzetto della piastra, nome dei miRNA analizzati, tipologia di reagenti (Standard e non fast) e cicli di reazione. Il profilo di amplificazione utilizzato in questo studio è riportato nella tabella sottostante.
Step Real Time PCR
Cicli (N=40)
Denaturazione Annealing/Estensione
Tempo (sec) 15’’ 1’
32
E’ stato utilizzato lo strumento “ABI Step One Plus – Real-Time PCR System” (Applied Biosystems), dotato di un modulo ottico che eccita i flurocromi e un detector che raccoglie i dati di fluorescenza emessi da ciascun campione e li trasmette ad un computer; qui un software (Step One Plus Software ) permette di visualizzare la cinetica di reazione dell'amplificato (Figura 5), valutando ad ogni ciclo l'incremento di fluorescenza. Il sistema da in output un diagramma nel quale sull'asse delle ascisse sono riportati i cicli di reazione e su quello delle ordinate l'incremento della fluorescenza.
33 Figura 5- Amplificazione del cDNA in qRT-PCR
34 3.5.2 Interpretazione dei dati di qRT-PCR
La qRT-PCR prevede due metodi di quantificazione del prodotto amplificato: una quantificazione assoluta ed una quantificazione relativa. La quantificazione assoluta richiede la costruzione preliminare di una curva standard per ogni target in esame, utilizzando campioni di cui sia nota la concentrazione assoluta e il numero di copie di DNA o RNA presenti. In seguito i valori di Ct ottenuti dall’analisi di campioni da studiare, saranno interpolati sulla curva standard per la determinazione del numero di copie del frammento d’interesse.
La quantificazione relativa è invece utilizzata per analizzare cambiamenti nell’espressione di un gene in un dato campione in relazione ad un campione di
riferimento (definito calibratore).
In questo caso non è necessaria la costruzione di una curva standard ma è fondamentale normalizzare i dati, usando oltre ad un calibratore, dei geni housekeeping o miRNA di riferimento, espressi in maniera costitutiva in tutti i campioni. La quantificazione relativa si basa sul presupposto che, se la reazione ha efficienze comparabili, il confronto di curve di amplificazione di campioni diversi può fornire indicazioni sulla
concentrazione iniziale di target negli stessi.
Per confrontare diverse curve di amplifcazione è fondamentale l’analisi della cinetica di reazione e la rilevazione della variazione di fluorescenza. Nella curva di cinetica di reazione di una qRT-PCR si individua innanzitutto un valore di “baseline”, che consente di discriminare la fluorescenza specifica da quella aspecifica (fig.6) e un valore di “threshold” o “ciclo soglia”, che può essere impostato manualmente dall’operatore o automaticamente dal software di analisi. Il ciclo nel quale la curva del campione interseca la retta di threshold prende il nome di “ciclo soglia” o “Ct”, questo valore è un indicatore del numero di copie iniziali del target in esame. Come già accennato nel paragrafo precedente, più basso è il valore di
35 3.6 Analisi dei risultati
In questo studio abbiamo utilizzato un metodo di quantificazione relativa. Nello studio sono stati analizzati due miRNA di riferimento il miR16 e l’RNU 6B, dopo diverse prove, è stato scelto di normalizzare i campioni per la successiva analisi statistica con il miR-16, che dava valori stabili e paragonabili tra il gruppo dei casi e dei controlli. Inoltre, in ogni saggio di qRT-PCR, è stato usato come calibratore un pool di RNA ottenuto da donne gravide e non gravide. I valori di Ct per ogni campione sono stati
dunque normalizzati con quelli del
miR-16 (calcolo ΔCt) e con quelli del pool (calcolo ΔΔCt). I valori di ΔCt del pool sono
stati ottenuti sempre in base al miR-16.
Ct = valore dato dal software di analisi per ogni campione e per ogni miRNA
Media Ct = Media aritmetica dei 3 valori di Ct delle 3 repliche dello stesso campione per ogni miRNA analizzato
ΔCt di ogni campione e del pool =
Media aritmetica Ct miRNA target – Media aritm.Ct Controllo
endog.
ΔΔCt di ogni campione =
ΔCt miRNA target del campione – ΔCt miRNA target del pool
Fold Change = 2-ΔΔCt
L’utilizzo di un miRNA di riferimento e di un pool specifico analizzato ad ogni prova e con tutti i campioni, ci consente di ridurre sia l’errore intra che quello inter saggio.
36
37 3.7 Analisi statistica
L’analisi statistica è stata eseguita con il software “Statistical Package For The Social Science” (SPSS by IBM). I livelli di espressione dei miRNA ( valori di 2-ΔΔCt) sono stati confrontati tra i gruppi di donne gravide e non gravide, primipare e non primipare. Per la scelta del test statistico da utilizzare sono stati eseguiti i test di normalità di
Shapiro-Wilk e di
Kolmogorov-Smirnov, dal momento che i valori di 2-ΔΔCt non avevano una distribuzione normale, è stato usato il test non parametrico U di Mann-Whitney.
38
4. RISULTATI
Valori di qRT-PCR ottenuti in questo studio (Tab.3).
VALORI REAL TIME PCR
CODICE
PAZIENTE miR-141 miR-200c miR-518b
ΔΔCt 2-ΔΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt 1 3.74 0.07 3.09 0.12 2.17 0.22 2 4.44 0.05 4.62 0.04 3.42 0.09 6 2.65 0.16 7.29 0.01 5.07 0.03 7 4.64 0.04 5.04 0.03 4.33 0.05 17 2.55 0.17 4.08 0.06 2.37 0.19 30 3.9 0.07 4.29 0.05 2.01 0.25 33 2.6 0.17 1.63 0.32 1.82 0.28 40 3.36 0.1 2.96 0.13 1.39 0.38 43 0.93 0.53 0.63 0.64 1.08 0.47 47 4.71 0.04 6.45 0.01 5.39 0.02 48 2 0.25 3.91 0.07 2.03 0.24 50 4.58 0.04 4.5 0.04 1.72 0.30 51 2.45 0.18 3.67 0.08 3.8 0.07 57 2.41 0.19 2.57 0.17 1.94 0.26 69 2.83 0.14 4.36 0.05 1.12 0.46 72 1.93 0.26 1.99 0.25 0.89 0.54 75 3.49 0.09 3.94 0.07 3.61 0.08 77 1.81 0.29 1.18 0.44 4.24 0.05 83 -0.59 1.5 -0.55 1.46 -2.35 5.09 88 1.09 0.47 3.01 0.12 2.46 0.18 89 4.54 0.04 0.39 0.76 4.51 0.04 93 1.73 0.3 1.66 0.32 0.65 0.64 94 1.88 0.27 2.69 0.16 1.8 0.29 96 -1.18 2.26 -0.44 1.35 -2.8 6.96 99 0.81 0.57 3.26 0.1 1.54 0.34 100 -0.99 1.99 -1.27 2.42 1.35 0.39 105 0.67 0.63 0.21 0.87 -1.78 3.44 112 1.14 0.45 -1.34 2.52 0.56 0.68 114 3.05 0.12 0.68 0.63 2.58 0.17 116 2.4 0.19 -0.74 1.46 2.54 0.17
39 CODICE
PAZIENTE miR-141 miR-200c miR-518 ΔΔCt 2-ΔΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt 1C 7.13 0.01 2.97 0.13 5.54 0.09 2C 4.15 0.06 5.55 0.02 3.14 0.11 3C 5.56 0.02 4.83 0.04 6.74 0.01 5C 3.07 0.12 3.71 0.08 5.89 0.02 6C 2.21 0.22 3.23 0.11 4.75 0.04 7C 3.05 0.12 3.56 0.08 4.7 0.04 8C 3.78 0.07 4.62 0.04 3.53 0.09 10C 1.46 0.36 0.51 0.7 1.86 0.28 70C 1.32 0.4 1.47 0.36 2.29 0.21 11C 2.84 0.14 3.76 0.07 4.29 0.05 13C 0.8 0.57 1.36 0.39 3.18 0.11 15C 2.24 0.21 3.15 0.11 4.55 0.04 16C 2.61 0.16 3.59 0.08 4.26 0.05 17C 3.32 0.1 3.21 0.11 3.42 0.09 18C 0.97 0.51 3.39 0.1 5.17 0.03 19C 2.45 0.18 4.87 0.03 4.81 0.04 20C 2.12 0.23 4.26 0.05 5.06 0.03 22C 1.7 0.31 4.43 0.05 1.25 0.42 23C 2.87 0.14 6.42 0.01 4.7 0.04 24C 4.18 0.06 1.72 0.3 3.13 0.11 25C 2.98 0.13 3.56 0.08 3.07 0.12 28C 0.69 0.62 1.09 0.47 0.5 0.71 29C 0.38 0.77 2.3 0.2 3.04 0.12 30C 1.89 0.27 1.54 0.34 0.72 0.61 36C 2.93 0.13 4.69 0.04 2.13 0.23 40C 0.23 0.85 -1.12 2.17 0.82 0.57 43C 0.6 0.66 0.81 0.56 1.96 0.25 44C -0.01 1.01 1.32 0.4 0.35 0.78 45C 0.95 0.52 1.91 0.27 0.31 0.8 49C 4.74 0.04 0.96 0.51 0.58 0.66 C = Controlli (Tab.3)
40
4.1 Valutazione statistica dell’associazione alla gravidanza nel
primo trimestre dei 3 miRNA analizzati.
4.1.1.1 Distribuzione dei livelli di espressione 2-ΔΔCt del miR-141 nel plasma delle donne prese in esame indipendentemente dallo stato gravidico (n tot= 60).
Dai risultati ottenuti mediante test di Normalità di Shapiro-Wilk e Kolgorov-Smirnov si evince che i valori non sono distribuiti normalmente. Si procederà pertanto all’analisi dei dati mediante un test non parametrico (Test U di Mann-Whitney).
41
4.1.1.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt del miR-141 tra donne gravide (CASI= 30) e donne non gravide (CONTROLLI= 30).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-141 nei due gruppi (P value= 0.953).
42
4.1.2.1 Distribuzione dei livelli di espressione 2-ΔΔCt del miR-200c nel plasma delle donne prese in esame indipendentemente dallo stato gravidico (n tot= 60).
Dai risultati ottenuti mediante test di Normalità di Shapiro-Wilk e Kolgorov-Smirnov si evince che i valori non sono distribuiti normalmente. Si procederà pertanto all’analisi dei dati mediante un test non parametrico (Test U di Mann-Whitney).
43
4.1.2.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt del miR-200c tra donne gravide (CASI= 30) e donne non gravide (CONTROLLI= 30).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-200c nei due gruppi (P value= 0.375).
44
4.1.3.1 Distribuzione dei livelli di espressione 2-ΔΔCt del miR-518b nel plasma delle donne prese in esame indipendentemente dallo stato gravidico
(n tot= 60).
Dai risultati ottenuti mediante test di Normalità di Shapiro-Wilk e Kolgorov-Smirnov si evince che i valori non sono distribuiti normalmente. Si procederà pertanto all’analisi dei dati mediante un test non parametrico (Test U di Mann-Whitney).
45
4.1.3.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt del miR-518b tra donne gravide (CASI= 30) e donne non gravide (CONTROLLI= 30).
E’ presente una differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-518b nei due gruppi (P value= 0.049).
46
4.2 Valutazione statistica tra i livelli d’espressione dei miRNA
analizzati nel plasma delle sole donne gravide (“CASI”= 30)
in relazione allo stato di primipara (n= 15) o multipara
(n= 15).
4.2.1.1 Statistica descrittiva dei due gruppi in relazione all’espressione di miR-141.
4.2.1.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-141 nel gruppo dei “Casi” (n tot= 30), tra donne primipare (n= 15) o multipare (n= 15).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-141 nei due gruppi (P value= 0.457).
47
4.2.2.1 Statistica descrittiva dei due gruppi in relazione all’espressione di miR-200c.
4.2.2.2 Test Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-200c nel gruppo dei “Casi” (n tot=30), tra donne primipare (n=15) o multipare (n=15).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-200c nei due gruppi (P value= 0.680).
48
4.2.3.1 Statistica descrittiva dei due gruppi in relazione all’espressione di miR-518b.
4.2.3.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-518b nel gruppo dei “Casi” (n tot= 30), tra donne primipare (n= 15) o multipare (n= 15).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-518b nei due gruppi (P value= 0.408 ).
49
4.3 Valutazione statistica tra i livelli d’espressione dei miRNA
analizzati nel plasma di donne non gravide al momento
dello studio (“CONTROLLI=30), in relazione all’aver avuto
(n=16)
o
meno
(n=14)
precedenti
gravidanze.
4.3.1.1 Statistica descrittiva dei due gruppi in relazione all’espressione di miR-141.
4.3.1.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-141 nel gruppo dei “Controlli” (n tot= 30), tra donne che non hanno mai avuto gravidanze(n= 14) e donne che hanno avuto gravidanze prima dello studio (n= 16).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-141 nei due gruppi (P value= 0.728 ).
50
4.3.2.1 Statistica descrittiva dei due gruppi in relazione all’espressione di miR-200c.
4.3.2.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-200c nel gruppo dei “Controlli” (n tot= 30), tra donne che non hanno mai avuto gravidanze(n= 14) e donne che hanno avuto gravidanze prima dello studio (n= 16).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-200c nei due gruppi (P value= 0.120 ).
51
4.3.3.1 Statistica descrittiva de due gruppi in relazione all’espressione di miR-518b.
4.3.3.2 Test di Mann-Whitney per il confronto delle medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-518b nel gruppo dei “Controlli” (n tot= 30), tra che non hanno mai avuto gravidanze(n= 14) e donne che hanno avuto gravidanze prima dello studio (n= 16).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-518B nei due gruppi (P value= 0.131 ).
52
4.4 Valutazione statistica tra i livelli d’espressione dei tre
miRNA e l’esito del Test Biochimico nel gruppo dei “CASI”
(n=30).
Confronto effettuato tra :
- 16 gestanti che mostravano un Test Biochimico dall’esito positivo; - 14 gestanti che mostravano un Test Biochimico dall’esito negativo.
4.4.1.1 Statistica descrittiva dei due gruppi relativa all’espressione di miR-141.
4.4.1.2 Test di Mann-Whitney tra le medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-141 nell’ambito dei “CASI” (n tot= 30), tra donne che presentavano un Test biochimico dall’esito positivo (n= 16) o negativo (n= 14).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-141 nei due gruppi (P value= 0.093).
53
4.4.2.1 Statistica descrittiva dei due gruppi relativa all’espressione di miR-200c.
4.4.2.2 Test di Mann-Whitney tra le medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-200c nell’ambito dei “CASI” (n tot= 30), tra donne che presentavano un Test biochimico dall’esito positivo (n= 16) o negativo (n= 14).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-200c nei due gruppi (P value= 0.759).
54
4.4.3.1 Statistica descrittiva dei due gruppi relativa all’espressione di miR-518b
4.4.1 Test di Mann-Whitney tra le medie dei valori di 2-ΔΔCt (fold change) del miR-518b nell’ambito dei “CASI” (n tot= 30), tra donne che presentavano un Test biochimico dall’esito positivo (n= 16) o negativo (n= 14).
Non c’è alcuna differenza statisticamente significativa tra i livelli
d’espressione di miR-518b nei due gruppi (P value= 0.822).
55
OSSERVAZIONI:
Riassumendo, l’unica associazione statisticamente significativa ottenuta è
stata quella del
miR-518b nel confronto tra donne gravide
56
5. DISCUSSIONE
Gli acidi nucleici di origine placentare rilasciati nella circolazione materna durante la gestazione si studiano già da qualche anno per il loro potenziale ruolo nella diagnosi prenatale non invasiva e nel monitoraggio delle complicazioni correlate alla gravidanza. I miRNA placenta specifici derivano dal trofoblasto e sono rilasciati nella circolazione materna durante la gravidanza tramite esosomi. E’ dunque fondamentale vedere quali miRNA placenta specifici sono rilevabili nella circolazione materna, in quale trimestre, e qual è la loro valenza come biomarker diagnostico.
In questo progetto di tesi è stato studiato il profilo di espressione dei 141, miR-200c, miR-518b, riportati in letteratura come associati alla gravidanza, usando come controllo endogeno il miR-16 [61], che ha presentato livelli d’espressione stabili e paragonabili sia nel gruppo dei casi che dei controlli. In particolare l’analisi è stata condotta su 30 donne gravide al primo trimestre di gravidanza, che si sono sottoposte a villocentesi, e su 30 donne non gravide dello stesso intervallo d’età. Il numero limitato della casistica dipende dai criteri di inclusione ed esclusione stringenti applicati in questo studio e quindi dalla difficoltà nel reclutare pazienti e controlli che rispondessero perfettamente ai requisiti richiesti. In questo modo è stato possibile ridurre al minimo le interferenze sui livelli di espressione dei miRNA da parte di fattori secondari, in accordo con i dati di letteratura.
I 3 miRNA analizzati sono stati selezionati dalla letteratura e sono il 141, il miR-200c ed il miR518b.
Sebbene i miRNA miR-200c, miR-141 fossero già stati riportati come associati alla gravidanza, ci interessava capire se la loro associazione fosse specifica per il primo trimestre. Infatti alcuni autori li hanno riscontrati nel primo trimestre, altri nel primo e nel terzo, altri per tutta la durata della gravidanza. Inoltre, essendo parte del pattern d’espressione delle cellule staminali embrionali, livelli d’espressione alterati di questi miRNA potrebbero riscontrarsi in caso di aborti spontanei o essere in qualche modo correlati a valori alterati del test combinato e a risultati patologici dell’esame citogenetico.
57
Il miR-518b, invece, è stato riportato in tutti i lavori analizzati come associato alla gravidanza indipendentemente dal trimestre [34,36,40,41,43,57,61,62,63,64,65], in più è stato riportato il coinvolgimento di questo miRNA nella preeclampsia [41,55,57]. Pertanto abbiamo ritenuto importante validare la presenza del miR-518b nel plasma di donne gravide, a prescindere dalla condizione di primipare, solo durante il primo trimestre di gravidanza. Se è vero che livelli elevati di miR-518b si riscontrano già nel primo trimestre e che possono indicare un rischio aumentato per la donna, la sua analisi d’espressione potrebbe garantire un miglior monitoraggio della gravidanza stessa già dalle primissime fasi.
Nel nostro studio l’unico miRNA risultato associato alla gravidanza in maniera statisticamente significativa già nel primo trimestre è il miR-518b, che fa fa parte del cluster C19MC che comprende 54 miRNA predetti, 43 validati, di cui i più noti sono:
miR-517a, miR517b, miR-516b, miR-525-5p, miR-512-3p, and miR-515-3p. Si tratta di un cluster altamente espresso nel trofoblasto umano primario, essenziale per il mantenimento della normale fisiologia della placenta [49]. Il miR-518b sembra esser implicato nella regolazione dell’invasività, proliferazione ed apoptosi delle cellule del trofoblasto, e per questo potrebbe essere anche coinvolto nella patogenesi della preeclampsia. Inoltre il miR-518b è tra i miRNA sovraespressi nel tessuto placentare di pazienti con mole idatiforme completa rispetto a quello otteuto da aborti spontanei al primo trimestre di gravidanza, con espressione preferenziale nei villi primari [51]. Diversi studi hanno dimostrato un’espressione ridotta di miR-518b (perlopiù in campioni placentari) associata alla presenza di ritardo di crescita
intrauterina [59,65,67].
Nello studio di Kotlabova del 2011 [56] questo miRNA è risultato un marker ottimale a fini diagnostici e prognostici, relativamente ai disturbi legati alla gravidanza sopra menzionati. Ciò ha suggerito un suo potenziale utilizzo come biomarker precoce di preeclampsia da analizzare prima della comparsa dei sintomi clinici caratteristici della stessa.
Morales-Prieto [68] in un lavoro pubblicato nel 2013, mette in evidenza come il
C19MC, rispetto ad altri cluster di miRNA associati alla gravidanza, sia poco espresso
