Distribuzione della proteina in superficie

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tapping mode, mentre nella parte centrale è riportata l’immagine acquisita in KPFM in modalità lift mode. Dalle immagini di topografia è possibile notare gli effetti della lucidatura su TiCP e Ti64 mentre sul Ti64CT si osserva l’effetto del trattamento chimico che crea un pattern microrugoso mettendo in rilievo le fasi β del materiale corrose meno di quelle α. Nel complesso le immagini di topografia non forniscono informazioni riguardo la presenza di un layer proteico a questa scala. Discorso differente invece per le immagini di potenziale, dove per tutti e tre i substrati è possibile identificare un confine tra la goccia depositata per l’adsorbimento (sinistra) e il substrato non interessato dal processo (destra). La differenza di potenziale tra le aree con e senza proteina adsorbita è messa in evidenza dai grafici della colonna destra di Figura 65. In questi grafici è riportato il valore di potenziale seguendo una linea tracciata nell’immagine acquisita in modalità Kelvin probe (linea bianca) ed è chiaro come i livelli di potenziale differiscano quando si passa dalla zona interessata dall’adsorbimento a quella non interessata, con differenza dell’ordine di 50 mV per il TiCP, mentre di circa 100 mV per il Ti64 e il Ti64CT.

Questi diversi valori di differenza nel valore di potenziale possono essere ricondotti a due cause: alla diversa natura dello strato di ossido superficiale formatosi sul titanio¹²⁶ o alle cariche esposte dalla proteina di diversa natura. Nel caso del TiCP il confine relativo alla goccia di soluzione depositata per l’adsorbimento appare meno evidente, a causa di effetti di deposito del bordo della goccia.

Nell’immagine di potenziale relativa al Ti64CT si rilevano degli effetti topografici in corrispondenza dei grani di fase β, ma rimane comunque ben visibile la differenza di potenziale tra le due aree.

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Figura 66: immagini topografiche (colonna sinistra), di potenziale superficiale (colonna centrale) di dimensioni 2x2 μm delle aree interne alla goccia depositata per l'adsorbimento di fibronectina sui tre substrati. Sulla destra grafico del potenziale di

superficie relativo alla linea bianca disegnata nell’immagine di potenziale

Nelle immagini in Figura 66 sono valutate aree interne alla porzione dove è stata depositata la goccia di soluzione proteica per l’adsorbimento. Le immagini sono relative ad aree sui campioni di 2x2 μm.

Ciò che appare dalle immagini relative al TiCP e Ti64 in topografia è la presenza di strutture di forma globulare, che dall’immagine di potenziale non vengono evidenziate. Questo indicherebbe che non ci sono differenze di chimica superficiale tra gli agglomerati e il resto della superficie: si tratta quindi in ogni caso di un layer proteico che assume morfologia diversa in alcuni punti. Nelle immagini di potenziale di TiCP e Ti64 il rivestimento di proteina appare uniforme, con un range di potenziale di 15 mV per il TiCP e circa 20 mV per il Ti64, come confermato anche dai grafici della colonna di destra dove è riportato il valore di potenziale ottenuto dalle immagini in modalità Kelvin probe seguendo la linea bianca tracciata. Queste variazioni di potenziale sono paragonabili al rumore della misura, quindi non significative. Sembrerebbe che quindi la fibronectina formi uno strato continuo sul materiale, ma che

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sia presente anche sotto forma di aggregati. Questo potrebbe essere spiegato dal meccanismo suggerito in letteratura di un adsorbimento inizialmente casuale, e successivamente il verificarsi di fenomeni di coalescenza della proteina adsorbita a formare cluster superficiali^51,127. L’immagine topografica relativa al Ti64CT evidenzia invece un grano di fase β, circondato da grani α, ricoperti entrambi dalla struttura nanoporosa e da un layer proteico. Il potenziale graficato seguendo la linea bianca tracciata nell’immagine in modalità Kelvin probe ha un’ampiezza maggiore rispetto a quello dei substrati precedenti, ed è evidente come sia influenzato dalle caratteristiche topografiche. Ciò che possiamo asserire in base ai dati ottenuti, è che non c’è evidenza di un diverso adsorbimento proteico da parte delle due fasi cristalline del titanio.

Successivamente vengono riportate le immagini acquisite tramite microscopia in fluorescenza. Grazie a questa tecnica è possibile visualizzare la proteina marcata che se eccitata alla giusta lunghezza d’onda emette segnale ad una specifica lunghezza d’onda. Utilizzando i canali adeguati a identificare il fluoroforo di interesse, si è indagata la copertura più o meno uniforme e la formazione di strutture particolari della proteina adsorbita.

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Figura 67: microscopia in fluorescenza dopo adsorbimento di fibronectina su diversi substrati (50x): A: TiCP; B: Ti64; C: Ti64CT

A

B

C

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Le immagini in Figura 67 mostrano il confronto tra i tre tipi di substrato ad ingrandimenti 50x.

L’immagine A è relativa al substrato TiCP, e per quanto debole il segnale è possibile individuare la fibronectina in strutture globulari, così come per l’immagine B relativa al Ti64. Per quanto riguarda l’immagine C relativa al Ti64CT è possibile evidenziare come risulti più marcato il segnale nell’area esaminata, dato dalla fluorescenza della rodamina legata alla fibronectina. Come osservato dalle misure di quantifica ottenute in fluorescenza, questo substrato è in grado di adsorbire più proteina del TiCP e del Ti64, e fornire un segnale che può essere quindi meglio visualizzato tramite microscopia.

Questo conferma l’influenza delle caratteristiche di chimica e morfologia superficiale descritte, comprese l’idrofilicità ed energia superficiale maggiore che rendono più affine la proteina a questo substrato.

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Figura 68: microscopia in fluorescenza dopo adsorbimento di fibronectina su diversi substrati (100x): A: TiCP; B: Ti64; C: Ti64CT

A

B

C

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Le immagini ad ingrandimenti 100x in Figura 68 e 200x in Figura 69 confermano l’informazione derivante da quelle a 50x. Tra i diversi substrati si nota un’organizzazione differente della proteina sulla superficie. Per quanto riguarda il TiCP e il Ti64 la fibronectina forma delle strutture che sono più facilmente individuabili su questi substrati rispetto che sul Ti64CT. In particolare, si vede come la fibronectina assuma sulla superficie una struttura filamentosa sul TiCP e la presenza di una struttura globulare sul Ti64. Diversi studi dimostrano come la disposizione di fibronectina dipenda dalla natura del substrato, ed in particolare dalla bagnabilità^128,129 (la proteina si adsorbe come isole su substrati a bassa bagnabilità e come reticoli su substrati ad alta bagnabilità) e come il tempo del processo di adsorbimento sia determinante per indurre l’aggregazione della proteina e la formazione di strutture più reticolate e complesse¹²⁷. La difficoltà maggiore nell’individuare queste strutture sul Ti64CT potrebbe essere dovuta alla maggiore affinità che la proteina mostra con la superficie di questo substrato, che guida un adsorbimento più uniforme sulla superficie scoraggiando la formazione di aggregati.

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Figura 69: microscopia in fluorescenza dopo adsorbimento di fibronectina su diversi substrati (200x): A: TiCP; B: Ti64; C: Ti64CT

C

B

A

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