Misure in fluorescenza

Alcune misure effettuate nell’ambito di questa tesi hanno utilizzato delle proteine fluorescenti. Queste sono proteine modificate a cui è legato un fluoroforo. Se irradiato con una sorgente luminosa ad una specifica lunghezza d’onda, il fluoroforo è in grado di eccitarsi e rilasciare un segnale caratteristico ad un’altra grandezza d’onda. Negli adsorbimenti effettuati con queste proteine sono state utilizzate albumina legata a rodamina per adsorbimenti di singola proteina (Rhodamine BSA, Cytoskeleton) , albumina legata al fluoroforo alexa 488 (Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor™ 488 conjugate, Thermo Fisher Scientific) negli adsorbimenti sequenziali e coadsorbimenti, e fibronectina legata a rodamina (Rhodamine Fibronectin, Cytoskeleton). Data la minor disponibilità di queste proteine, il protocollo di adsorbimento è stato modificato. Dopo la solita procedura di lavaggio, i campioni sono stati disposti in delle piastre multipozzetto. Ogni pozzetto è stato poi riempito con 1 mL di PBS per circa due minuti (in maniera tale da sommergere completamente il campione), successivamente il PBS è stato aspirato e il campione lasciato asciugare all’aria. Questa è una procedura di condizionamento della superficie volta a favorire lo spandimento della goccia della soluzione proteica durante l’adsorbimento, dato il ridotto volume utilizzato della goccia stessa. I campioni sono stati poi sistemati in una camera umida, contenente un cordoncino bagnato con acqua di carta assorbente lungo il perimetro interno e del parafilm sul fondo per evitare che i campioni scivolassero perdendo la posizione assegnata. Per ogni adsorbimento sono stati usati quattro campioni per substrato, tre su cui effettivamente veniva depositata la goccia di soluzione proteica e uno di controllo su cui era depositata una goccia di PBS. Le soluzioni di proteine sono state preparate alla

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concentrazione solita di 20 mg/mL per la BSA e 0.2 mg/mL per la BFN, disciogliendo la giusta quantità di proteina fluorescente in PBS. Per il coadsorbimento, la soluzione multiproteina è stata preparata mischiando 10 μL di soluzione contente BSA e 10 μL di soluzione contenente BFN. Per l’adsorbimento, una goccia di 10 μL di soluzione proteica è stata depositata sulla superficie del campione e per facilitarne lo spandimento ed evitare l’evaporazione del PBS è stato posizionato un vetrino sopra, con l’accortezza che si formasse un film liquido continuo tra superficie del campione e vetrino, senza la presenza di bolle d’aria. Una foto della camera così preparata per l’adsorbimento è riportata in (Figura 42). La camera è stata poi chiusa dal coperchio e posizionata in incubatrice a 37°C per due ore.

Trascorso questo tempo, la soluzione è risultata non essere evaporata tra la superfice del campione e del vetrino, validando il procedimento effettuato.

Figura 42: preparazione della camera umida per gli adsorbimenti di proteine fluorescenti

Una volta terminato l’adsorbimento, i vetrini sui campioni sono stati rimossi. Sono stati poi preparati tre contenitori di PBS, e ogni campione è stato immerso per tre volte in ciascuno, lasciando cadere la goccia di soluzione residua rimanente sul campione su della carta assorbente al termine dell’immersione in ogni contenitore. Successivamente i campioni sono stati posizionati in una piastra multipozzetto (con la superficie relativa all’adsorbimento rivolta verso l’alto). Ogni pozzetto è stato riempito con 1 mL di PBS facendo attenzione con la pipetta a non versare soluzione direttamente sulla superficie del campione. Trascorsi due minuti la soluzione di PBS è stata aspirata da ogni pozzetto e il processo ripetuto per altre due volte. Questo protocollo di lavaggio, differente rispetto a quello degli

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adsorbimenti riguardanti le proteine non fluorescenti, è stato messo a puntoperché il segnale che si ottiene dalle misure in fluorescenza è particolarmente sensibile a eventuali residui di proteina non adesi.. A questo punto sui campioni è stata depositata una goccia di montante (Fluoroshield, Sigma) usato per preservare le caratteristiche dei fluorofori legati alle proteine. Su questa goccia è stato poi posizionato un nuovo vetrino, e i campioni sono stati disposti su un foglio di plastica trasparente per essere immediatamente analizzati. Oltre ai campioni, sul foglio di plastica sono stati posizionati anche dei vetrini quadrati su cui è stata depositata una goccia di soluzione proteica a concentrazione nota di 2 mg/mL e 0.2 mg/mL per l’albumina e 0.2 mg/mL e 0.02 mg/mL per la fibronectina. Su questa goccia era poi depositato un vetrino come per la superficie dei campioni. Questo per avere un riferimento del tipo e dell’intensità del segnale in fluorescenza della proteina nella misura descritta successivamente.

5.8.1. Acquisizione di immagine in fluorescenza tramite ChemiDoc MP Imaging System Una volta sistemati i campioni su un foglio di plastica come descritto in precedenza, questi venivano posizionati nello strumento ChemiDoc MP Imaging System (BIO-RAD) come mostrato in Figura 43.

Figura 43: sulla sinistra strumento ChemiDoc MP Imaging System (BIO-RAD)23, sulla destra dettaglio della disposizione dei campioni nella camera dello strumento

La peculiarità di questo strumento è che permette di avere un campo di acquisizione di 21x16.8 cm, e quindi di ottenere un’immagine che comprenda tutti i campioni contemporaneamente. Questo permette di eseguire un’analisi comparativa dell’intensità del segnale fluorescente proveniente dalla superficie dei diversi campioni sottoposti alle stesse condizioni di misura. Lo strumento è in grado di irradiare il campo di misura con sorgenti luminose a diversa lunghezza d’onda, impostabile a seconda del tipo di fluoroforo che si intende eccitare, e di acquisire il segnale proveniente dai campioni attraverso filtri che permettono di identificare la radiazione specifica rilasciata dai fluorofori eccitati.

All’utente è fornita un’immagine colorimetrica del campo di misura, con i pixel di intensità di colore

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diverso in base all’intensità di segnale rilevato in quel punto. I tempi di acquisizione e la lunghezza d’onda della sorgente irradiante sono perciò stati settati a seconda della misura da effettuare, e i dati sono stati successivamente rielaborati tramite un software (Image Lab Software). Tramite questi dati è stato possibile ottenere grafici che descrivessero l’intensità del segnale proveniente dai diversi campioni analizzati. Questo permette di avere un’idea della quantità di proteina adsorbita da un campione rispetto ad un altro campione di diverso substrato per quella specifica misura.

5.8.2. Microscopia in fluorescenza

I campioni su cui è stato effettuato l’adsorbimento con proteine fluorescenti sono stati osservati poi singolarmente al microscopio LSM 900 (ZEISS) (Figura 44), con ingrandimenti 50x, 100x, 200x. Il microscopio è dotato filtri in fluorescenza, per eccitare e rilevare la presenza di proteine fluorescenti sul campione (grazie alla presenza dei fluorofori legati alla proteina). Il segnale rilevato dalla superficie viene poi rielaborato da un software del pc collegato allo strumento, cosicché è stato possibile acquisire delle immagini sia nel visibile che nei canali per osservazione delle proteine fluorescenti, e aggiungere il riferimento di scala. Le osservazioni sono state condotte cercando di far trascorrere meno tempo possibile dal processo di adsorbimento, in maniera tale che il montante depositato tra superficie del campione e vetrino non si fosse asciugato e il fluoroforo deteriorato.

Figura 44: microscopio LSM 900 (ZEISS)¹⁰⁷