In soluzione acquosa, H2S è un acido debole e si dissocia in ione idrogeno (H+) e ione
idrogeno solfuro (HS-), il quale a sua volta si dissocia in (H+) e anione solfuro (S2-). A pH e temperatura fisiologici, in accordo con l'equazione di Henderson-Hasselbach, circa il 20% dell'H2S totale è indissociato e circa l '80% subisce la prima dissociazione, mentre la
seconda dissociazione è trascurabile (Fig.26).
Pertanto, una significativa quantità di H2S e HS- coesistono, ed entrambe le specie
contribuiscono direttamente all'azione biologica di H2S. H2S non dissociato è altamente
lipofilo, attraversa facilmente le membrane e penetra in tutti i tipi di cellule (Hughes et al 2009).
H
2S
H
++ HS
-2H
++ S
2-Figura 26. Dissociazione di H2S in soluzione acquosa.
Proprio a causa delle suddette proprietà chimico-fisiche di H2S, lo ione HS- e i sali di
solfuri, sono composti che generano efficacemente H2S, dopo la protonazione in
soluzione acquosa. NaHS è il sale che dona H2S più usato a scopi sperimentali. Tuttavia
non è adatto per l'utilizzo clinico, poiché forma rapidamente H2S, causando effetti avversi
come l'abbassamento acuto ed eccessivo della pressione sanguigna, seguita da una rapida eliminazione del gas.
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Altri sali, come il solfuro di calcio, sono stati proposti come possibile alternativa a NaHS, ma il tasso e meccanismo di rilascio di H2S di questi due sali inorganici, sono quasi
equivalenti (Li et al 2009). In clinica, i donatori ideali di H2S, sono quelli che rilasciano il
gas a concentrazioni basse, in modo lento e continuo (Caliendo et al 2010). Il donatore di H2S, di origine sintetica, più studiato è il morfolin-4-ium 4-metossifenil-morfolino-
fosfinoditioato GYY4137 (Fig. 27 a), inizialmente impiegato nella vulcanizzazione della gomma industriale e poi riscoperto come donatore di H2S, in grado di rilasciare il gas
lentamente (Li et al 2008). GYY4137 è stato ampiamente impiegato come strumento farmacologico per studiare gli effetti di H2S (Li et al 2008) e proposto come potenziale
nuovo farmaco e composto di riferimento per studiare e confrontare altri donatori lenti di H2S (Martelli et al 2013; Barresi et al 2017). È stato inoltre testato per diverse
applicazioni, nei confronti dell''infiammazione (Whiteman et al 2010), per gli effetti antiproliferativi (Lee et al 2011; Lee et al 2014; Hellmich et al 2015; Lu et al 2014), contro il glaucoma (Patil et al 2017), contro l'uropatia ostruttiva cronica (Lin et al 2016), nell'osteogenesi (Jiang et al 2015), per l'effetto vasorilasciante (Chitinis et al 2013), nell'aterosclerosi (Liu et al 2013) e per l'attivazione piastrinica (Grambow et al 2014). ll rilascio di H2S da parte di GYY4137 è fortemente potenziato dal pH acido e ridotto dalle
basse temperature (Li et al 2008). Inoltre, il rilascio di H2S a pH 7,4, viene incrementato
significativamente dalla presenza di tioli organici come la L-cisteina (Martelli et al 2013). GYY4137 induce forti effetti vasorilascianti, antagonizzati dai bloccanti di KATP. È
significativo notare che NaHS ha mostrato una potenza vasorilasciante inferiore a GYY4137, suggerendo che la presenza di concentrazioni più basse di H2S, per un tempo
prolungato, può garantire effetti farmacologici migliori rispetto ad alte concentrazioni di "picco", seguite da un rapido declino (Li et al 2008). GYY4137 ha fornito alcune informazioni utili sul ruolo controverso dei donatori di H2S e di H2S stesso,
nell'infiammazione. Nei macrofagi di ratto, la somministrazione di alte concentrazioni di NaHS aumentano la produzione di mediatori pro-infiammatori, come NO, TNFα, IL-1β e IL6. Al contrario, GYY4137 ha causato una significativa riduzione di questi mediatori e, contemporaneamente, un aumento di mediatori anti-infiammatori, come le chemochine e IL-10 (Whiteman et al 2010). Questi importanti dati sperimentali suggeriscono che gli effetti di donatori di H2S, sui processi infiammatori, sono influenzati dalla velocità del
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(Whiteman et al 2010). La ricerca di nuovi donatori di H2S, lenti, sicuri e solubili in acqua,
ha portato Zhou e colleghi, a valutare le proprietà biologiche di due tioaminoacidi come la
tiovalina la tioglicina (Fig.27 b,c) e in questo studio, sono state osservate proprietà
vasorilascianti, insieme ad un aumento dei livelli di cGMP, nelle cellule di muscolatura liscia di aorta di ratto (Zhou et al 2012). Successivamente, tali dati preliminari sono stati integrati con studi cardiaci, che hanno dimostrato l'inibizione della citotossicità indotta da H2O2 sui cardiomiociti, mediante la somministrazione di tiovalina (Chatzianastasiou et al
2016). Sulla base dell'osservazione di alcuni derivati della N- (benzoiltio) benzammide, i quali erano stabili in soluzioni acquose ed in grado di rilasciare H2S dopo interazione con
cisteina o GSH ridotto, sono stati impiegati dei modelli di pertiolo, per lo sviluppo di una serie di donatori di H2S lenti, considerando che la cisteina pertiolo (chiamata anche
tiocisteina) è un intermedio nella biosintesi dell'H2S (Zhao et al 2013). Un altro tipo
interessante di donatore di H2S è rappresentato dal modello N-mercapto e in particolare
da due serie di N- (Aciltio) ammidi (Fig.27 d) e 1- (benzoiltio) -3-feniluree (Fig.27 e). Tra i derivati di queste serie, in grado di rilasciare H2S, sono state selezionate tre ammidi N-
(Aciltio), per la valutazione delle proprietà cardioprotettive sui cardiomioblasti H9c2 sottoposti a un modello cellulare di I/R miocardica, indotto da alte concentrazioni di H2O2
(400 μM). Su questo modello in vitro, le ammidi N- (Aciltio) selezionate, hanno mostrato una significativa riduzione del danno indotto da H2O2, misurato come vitalità cellulare,
inoltre la determinazione della lattato deidrogenasi (LDH) nel mezzo cellulare, ha mostrato che le ammidi N- (Aciltio) erano anche in grado di attenuare significativamente il rilascio di questo marker di danno cellulare. Come ulteriore approfondimento, è stato anche registrato il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), poiché una perdita di MMP è un segno riconosciuto di sofferenza cellulare. I risultati hanno mostrato che le ammidi N- (Aciltio) evitavano la perdita di MMP e conservavano le funzioni mitocondriali (Zhao et al 2015). Un caso particolare di donatore di H2S, è rappresentato da una miscela
di composti di zolfo inorganici, in cui l'octatiocano è il composto più abbondante. Questa miscela denominata SG1002 (Fig.27f), è stata proposta come donatore di H2S e anche se
la caratterizzazione del suo potenziale rilascio di H2S non è stato riportato in dettaglio, ha
mostrato proprietà cardioprotettive nei modelli murini di malattie cardiache. In particolare, la somministrazione orale di SG1002 ha causato un effetto cardioprotettivo attraverso l'attivazione di una cascata complessa di eventi che portano ad un aumento
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della biodisponibilità di NO. In particolare, SG1002, durante lo sviluppo di insufficienza cardiaca indotta da ipertensione, ha dimostrato la proprietà di preservare la funzione mitocondriale, ridurre lo stress ossidativo e aumentare la densità vascolare miocardica prevenendo l'ipertrofia cardiaca scompensata (Kondo et al 2013). Recentemente è stato riscontrato che SG1002 aumenta i livelli di H2S nel sangue e la biodisponibilità di NO
circolante, nei volontari sani e nei pazienti con insufficienza cardiaca in uno studio clinico di fase I (Polhemus et al 2015). Un candidato interessante come donatore di H2S è
rappresentato dall'isotiocianato naturale sulforafano (Fig.28a), un glucosinolato, metabolita secondario della glucorafanina, presente in diverse piante commestibili della famiglia delle Brassicaceae come i broccoli (Brassica oleracea L.) e la rucola (Eruca sativa Mill.).
Il sulforafano è stato inizialmente descritto come un agente cardioprotettivo contro il danno da I/R, probabilmente attraverso l'attivazione dei canali KATP mitocondriali e per le
sue proprietà antiossidanti (Piao et al 2010). Infatti, su cuori di ratto allestiti con la tecnica Langendorff, sottoposti a un ciclo di 20 min di ischemia e 50 min di riperfusione, il sulforafano somministrato per via intraperitoneale per tre giorni (500 μg / kg / die), è stato in grado di migliorare la funzionalità del ventricolo sinistro successivamente all'evento ischemico, ha incrementato il flusso coronarico, ha diminuito la dimensione dell'area infartuata e il rilascio di LDH. Inoltre, la somministrazione di sulforafano ha
Figura 28. Strutture chimiche di alcuni H2S donors di origine naturale e struttura chimica del p-
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portato alla diminuzione della concentrazione del peptide natriuretico atriale, dei livelli di Bax e caspasi-3, aumentando i livelli di superossido dismutasi (SOD), catalasi, Bcl-2 ed eme ossigenasi-1 e tutti questi effetti sono stati neutralizzati da un trattamento con un bloccante selettivo di canali KATP mitocondriali, come l'acido 5-idrossidecanoico (Piao et al
2010). Il rilascio di H2S, da parte di alcuni isotiocianati naturali, presenti in molte specie di
piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae, è stato chiaramente dimostrato da Citi e colleghi. Infatti sostanze come l'allil-isotiocianato (Fig.28 b), presente nella senape nera (Brassica nigra) , 4-idrossibenzil isotiocianato presente nella senepe bianca (Sinapis alba ), benzil isotiocianato, presente nel "crescione" (Lepidium sativum ) ed erucina (Fig.28 c) presente sia nel cavolo (Brassica oleracea) che nella rucola (Eruca sativa), hanno mostrato proprietà di rilascio di H2S in presenza di un eccesso di L-cisteina ed il rilascio era
probabilmente dovuto al comportamento nucleofilo dell'amminoacido (Citi et al 2014). In un altro lavoro di Martelli e colleghi, sono stati valutati diversi isotiocianati sintetici e le loro proprietà di rilascio di H2S sono state confrontate con quelle di GYY4137 e con quelle
di un altro donatore naturale di H2S, che è diallidisolfuro (DADS Fig.27 f). La maggior parte
degli isotiocianati testati mostrava proprietà di rilascio di H2S paragonabili a quelle di
GYY4137 e DADS. Tra questi donatori sintetici di H2S, il p-carbossifenilisotiocianato
(PhNCS-COOH Fig. 28 d) ha mostrato degli interessanti effetti a livello cardiovascolare. Infatti evoca degli effetti vasorilascianti su diversi modelli di muscolatura liscia vascolare (Martelli et al 2014) e degli effetti cardioprotettivi contro il danno da I/R attraverso l'attivazione dei canali mito KATP e l'attenuazione dello stress ossidativo (Testai et al 2016).
Tra varie sostanze di origine naturale, in grado di rilasciare H2S, i polisolfuri allilici,
presenti in molte piante della famiglia Alliaceae, rappresentano uno strumento interessante per testare le proprietà di potenziali H2S-donor, derivati dalle piante. In
particolare, il dialliltrisolfuro (DATS Fig.28 e) un polisolfuro isolato dall'aglio fresco, ha dimostrato attività come donatore di H2S in un lavoro molto interessante di Benavides e
colleghi (Benavides et al 2007). Più recentemente, sulla base delle consolidate proprietà cardiovascolari mostrate da H2S, Predmore e colleghi, hanno condotto un ampio studio
sul ruolo della somministrazione esogena dei DATS donatori di H2S, nella protezione del
miocardio dal danno ischemico. A tale scopo, i topi maschi C57 BL6/J sono stati sottoposti a un danno da I/R miocardica mediante legatura dell'arteria coronaria sinistra e trattati con DATS 200 μg / kg prima della riperfusione. I risultati hanno dimostrato che la
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somministrazione di DATS ha ridotto significativamente la dimensione dell'infarto ed i livelli di troponina 1 circolanti; in più ha migliorato la funzione contrattile del miocardio. Dopo la lesione I/R, i livelli di H2S del miocardio sono risultati notevolmente diminuiti, ma
la somministrazione di DATS è stata in grado di ripristinarli completamente. A livello subcellulare, il DATS ha ridotto la respirazione mitocondriale, in modo concentrazione dipendente e, dopo riperfusione, ha migliorato significativamente l'accoppiamento dell'ossidazione e della fosforilazione, a livello mitocondriale. Un altro dato importante è che nel cuore, la eNOS è stata attivata dopo il trattamento DATS e questo effetto ha portato ad un aumento dei livelli plasmatici di nitrito e nitrato (Predmore et al 2012). Lo sviluppo di farmaci ibridi, contenenti una porzione capace di donare di H2S, sono stati
progettati a partire da un farmaco conosciuto, in modo da aggiungere alle ben note caratteristiche farmacologiche della molecola nativa, le proprietà di H2S. Tra le diverse
molecole ibride, i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) hanno rappresentato le prime molecole chimeriche studiate nella cardioprotezione.
Figura 29. Strutture chimiche di S-Diclofenac, ACS14 e ACS21.
In particolare S-diclofenac (Fig.29 a), il derivato del diclofenac capace di rilasciare H2S,
somministrato a 3, 10 e 30 μM, 20 minuti prima di indurre il fenomeno ischemico, insieme all'inibizione delle prostaglandine, aveva dimostrato un marcato effetto anti- ischemico in cuori riperfusi di coniglio. Questo effetto benefico è stato accompagnato da un aumento di GSH, dotato di ben note proprietà anti-ossidanti e da una riduzione sia della creatina chinasi (CK), che dell'attività di LDH nei perfusati cardiaci; inoltre a livello funzionale S-diclofenac normalizza la pressione di perfusione coronarica e migliora la pressione sviluppata dal ventricolo sinistro. L'attività cardioprotettiva di S-diclofenac è stata parzialmente prevenuta utilizzando il bloccante del canale KATP glibenclamide,
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supponendo un coinvolgimento dell'apertura di questo canale, nel meccanismo d'azione di S-diclofenac a livello cardiaco (Rossoni et al 2008). La valutazione delle proprietà cardioprotettive dei farmaci FANS donatori di H2S (FANS-H2S) è stata anche valutata
studiando i derivati dell'aspirina (ACS 14 Fig. 29 b) e dell'acido salicilico (ACS21 Fig. 29 c), su diversi parametri cardiovascolari. In particolare, su cuori di ratto isolati e perfusi, ACS14 e ACS21 hanno ridotto significativamente il danno miocardico dopo I/R, riducendo anche la quantità di CK e LDH (Rossoni et al 2010). Un approccio interessante contro il danno I/R, è stato l'impiego di una molecola che è in grado di accumularsi nei mitocondri.
Figura 30. Strutture chimiche di AP39 e Zofenipril.
A questo scopo, il derivato ibrido ottenuto coniugando il trifenilfosfonio (TPP+), che si accumula selettivamente nella matrice mitocondriale, con un ditioltione [5- (4- idrossifenil) -3H-1,2-ditiolo-3-tione](DTT), una frazione in grado di rilasciare H2S, è stato
testato contro il danno da I/R miocardica. Il nuovo derivato ibrido, AP39 (10oxo-10- (4- (3- tioxo-3H-1,2-ditiol-5il) fenossi) decil) trifenilfosfonio bromuro (Fig.30 a) è stato in grado, quando somministrato nel periodo di riperfusione, di esercitare un effetto protettivo sui cuori di ratto maschio Sprague-Dawley sottoposti a infarto miocardico. Inoltre, nei mitocondri isolati sub-sarcolemmatici e interfibrillari, AP39 ha ridotto significativamente la generazione di ROS mitocondriale senza influenzare la respirazione mitocondriale. AP39 è stato anche in grado di inibire l'apertura di MPTP e un'ulteriore inibizione additiva è stata osservata quando AP39 è stato co-incubato con ciclosporina A (Karwi et al 2017). Tra le molecole in grado di rilasciare H2S, dobbiamo menzionare un noto inibitore
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impiegato nella farmacoterapia dell'ipertensione e solo recentemente riscoperto come donatore di H2S. Il rilascio di H2S da parte di Zofenopril, non dovuto all'inibizione
dell'enzima ACE, potrebbe spiegare gli effetti benefici additivi degli ACE inibitori sulfidrilati rispetto a quelli non sulfidrilati (Bucci et al 2014). Un pretrattamento di 7 giorni con zofenopril, sia nei topi (10 mg / kg per os) che nei suini (30 mg / die per os), ha ridotto significativamente la dimensione dell'infarto miocardico e i livelli di troponina I cardiaca dopo il danno I/R (Donnarumma et al 2016). Tuttavia i benefici effetti cardiovascolari di zofenopril e del suo metabolita attivo zofenoprilato, coinvolgono anche la componente vascolare. Infatti la capacità di rilasciare H2S , porta ad un processo pro-angiogenico,
dipendente dall'attivazione dei canali KATP e dall'attivazione di Akt, eNOS e ERK1/2 .
Questo è utile in quelle malattie cardiovascolari in cui è necessario un ripristino della funzione vascolare e la stimolazione di processi angiogenenici (Terzuoli et al 2015). Inoltre il ruolo protettivo dello zofenoprilato a livello vascolare è stato dimostrato anche attraverso la sua attività antinfiammatoria nelle cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) su cui zofenoprilato è stato in grado di abolire la risposta proinfiammatoria, indotta da IL-1β, in un modo CSE/H2S dipendente (Monti et al 2016).
Questi risultati sono molto interessanti perché lo zofenopril è un esempio dei possibili effetti benefici additivi ottenuti quando una molecola in grado di rilasciare H2S, viene
applicata nella terapia clinica comune.
Infine, sta emergendo una nuova classe di derivati: i "NOSH-drug", ovvero farmaci che rilasciano sia NO che H2S. Ad ora tre diversi derivati appartenente ai FANS, ovvero NOSH-
aspirina, NOSH-naproxen e NOSH sulindac sono stati sintetizzati e testati, dimostrando
un miglioramento della sicurezza gastro-intestinale e di entrambe le proprietà anti- infiammatorie e anti-piastriniche, rispetto alla loro molecola FANS nativa (Chattopadhyay et al 2016; Kashfi et al 2015). Queste caratteristiche migliorate nei farmaci NOSH potrebbero rappresentare ipotesi favorevoli per future intuizioni anche sulle loro potenziali proprietà cardiovascolari.
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2.Scopo della ricerca
Il solfuro di idrogeno (H2S), molecola gassosa nota fino a poco tempo fa solo come agente
tossico, è ormai un noto gas trasmettitore endogeno che, a concentrazioni fisiologiche, gioca un ruolo fondamentale in vari processi biologici in numerosi distretti dell'organismo. In particolare è coinvolto nella regolazione del sistema cardiovascolare, mostrando gli stessi effetti benefici di NO. Un'alterazione della biosintesi di H2S o una
diminuzione della sua concentrazione endogena, influiscono sulla patogenesi dell'ipertensione e di molte altre patologie a livello cardiovascolare. La ricerca di sostanze in grado di rilasciare H2S sembra essere una nuova strategia terapeutica per trattare
diverse patologie cardiovascolari, in particolare è stato visto che sostanze come NaHS, che rilasciano H2S rapidamente e con una concentrazione di picco elevata, vengono
utilizzate come standard di riferimento in molti esperimenti, ma non possono avere valore terapeutico in quanto causano molti effetti collaterali indesiderati. Invece sostanze donatori di H2S come GYY4137, che rilasciano H2S in modo lento, graduale e costante,
hanno valore terapeutico perché mantengono stabili i livelli di H2S endogeni. L'attenzione
di questa ricerca è stata rivolta all'analisi del rilascio di H2S, con metodo amperometrico,
di sostanze di origine commerciale sintetica e di origine naturale. Questa analisi è stata condotta in assenza ed in presenza di cisteina, una sostanza in grado di mimare la presenza di tioli endogeni. Successivamente è stato analizzato l'effetto di queste sostanze H2S-donors a livello del distretto coronarico, in cuori di ratto isolati e perfusi con la
tecnica Langendorff, per valutare i loro effetti vasodilatatori sul distretto coronarico e gli effetti su altri parametri cardiaci come l'RPP e la dp/dt.
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Le sostanze studiate nel mio percorso di tesi sono mostrate nella tabella 1;
N,N-Feniltiourea (Sigma-Aldrich®)
N-feniltiourea (Sigma-Aldrich®)
Allilisotiocianato (Sigma-Aldrich). Questa sostanza si trova nella pianta di Brassica
Nigra.
Erucina, Glucoerucina e l'estratto di Eruca sativa Mill (gentilmente forniti
dall'istituto CREA di Bologna).
Gruppo funzionale Nome Struttura
Fenil-tiouree
N,N'-Difeniltiourea
N-Feniltiourea
Isotiocianati
Allil-isotiocianato
Erucina
Glucosinolati
Glucoerucina
51 Erucina, glucoerucina e l'estratto idroalcolico liofilizzato di Eruca sativa Mill, sono stati
ottenuti dalla macinazione dei semi disoleati della pianta. L'estratto è titolato in glucosinolati, glucorafanina e glucoerucina, per un totale di 400μM/g di estratto di cui 380 ± 12 di glucoerucina e 20 ± 1 di glucorafanina
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