Valutazione degli effetti coronarodilatatori di nuovi H2S-donors naturali e sintetici.

1

U

NIVERSITÀ DI

P

ISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia

Tesi di Laurea

VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI CORONARODILATATORI DI NUOVI

H

S-DONORS NATURALI E SINTETICI.

Relatori:

Prof. Vincenzo Calderone

Dott.ssa Lara Testai

Correlatore:

Dott.ssa Valentina Citi

CANDIDATO:

Elena D'Asaro

2

Indice

1.3.1 Attivazione dei canali KATP. ... 13

1.3.2 Attivazione dei canali KCa ... 15

1.3.3 Attivazione dei canali Kv7 ... 16

1.4 Cross-talk tra NO e H2S a livello cardiovascolare. ... 17

1.5 H2S: Ruolo nell'organismo ... 23

1.5.1 Sistema Respiratorio. ... 23

1.5.2 Sistema gastrointestinale. ... 24

1.5.3 Sistema endocrino. ... 25

1.5.4 Sistema nervoso. ... 26

1.5.5 Effetti biologici di H2S nel Cancro. ... 28

1.5.6 Effetti di H2S nel sistema cardiovascolare. ... 31

1.6 H2S Donors: ... 41

2.Scopo della ricerca... 49

3.Materiali e Metodi ... 52

3.1 Determinazione amperometrica di H2S ... 52

3.1.1 Strumentazione per visualizzare il rilascio di solfuri. ... 52

3.1.2 Composti e sostanze ... 54

3.2 Protocollo sperimentale per la determinazione del rilascio di H2S da parte di H2 S-donors. ... 54

3

3.2.2 Standard. ... 55

3.2.3 Rilascio di H2S da parte di H2S-donor. ... 55

3.2.4 Analisi dei dati. ... 55

3.3 Valutazione degli effetti degli H2S-donors sui parametri cardiaci ... 57

3.3.1 Animali ... 57

3.3.2 Allestimento ... 57

3.3.3 Valutazione dei parametri cardiaci ... 58

3.3.4 Sostanze utilizzate ... 59

3.3.5 Protocolli sperimentali ... 59

3.3.6 Analisi dei dati ... 60

4.Risultati e discussione ... 61

4.1 Bibliografia ... 76

4

1. Introduzione

Negli ultimi decenni, la ricerca si è concentrata maggiormente nel comprendere il ruolo fisiologico dei 'gas trasmettitori' come l'ossido nitrico (NO), il primo esempio di gas trasmettitore, il monossido di carbonio (CO) e per ultimo, il solfuro di idrogeno (H2S)

(Fig.1). Questo campo, ancora largamente inesplorato, ha portato alla scoperta di molte importanti funzioni biologiche, che vedono protagonisti questi tre gas trasmettitori con conseguenti spunti per la scoperta di nuovi farmaci (Moore et al 2003; Olson and Donald

2009).

NO

CO

H

S

Un gas trasmettitore endogeno presenta diverse caratteristiche, come:

 una diffusione libera attraverso le membrane biologiche,

 una regolata produzione endogena nei tessuti dei mammiferi,

 la capacità di modulare vie e funzioni biologiche a concentrazioni fisiologiche,

 la presenza di target biologici specifici (Wang 2002; Farrugia and Szurszewski 2014),

 una breve emivita e una potenziale tossicità a concentrazioni elevate (Kasparek et al 2007; Wang 2012).

Inizialmente NO, CO e H2S, erano conosciuti solo per la loro tossicità (Ponderoso et al

1996; Wei et al 2000; Sarkela et al 2001; Calabrese et al 2007), in realtà ciascuno dei tre gas trasmettitori presenta sia effetti benefici sia effetti tossici. L'ossido nitrico (NO) è stato il primo esempio di gas-trasmettitore e la conoscenza dei suoi molteplici ruoli nella modulazione fisiologica del sistema cardiovascolare (CV) ha rivoluzionato profondamente lo sviluppo della farmacologia del sistema CV negli ultimi anni (Abe and Kimura 1996;

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Doeller et al 2005; Szabo 2007). Infatti NO a concentrazioni fisiologiche, presenta effetti benefici nei confronti di molti distretti ad esempio nell'apparato gastrointestinale, promuovendo l'inibizione della contrazione della muscolatura liscia intestinale e nel sistema cardiovascolare, causando la vasodilatazione, promuovendo l'angiogenesi ed esercitando un ruolo chiave nella cardioprotezione. Inoltre sembra anche essere coinvolto nella modulazione dei processi infiammatori, nei confronti dei quali sembra avere un'azione anti-infiammatoria (Li et al 2009; Baumgart et al 2009). Ad alte concentrazioni però questo gas promuove molti effetti tossici dati dalla sua capacità di produrre specie reattive, ad esempio i ROS (reactive oxygen species), i quali producono molti danni in particolare a livello del sistema nervoso (SN) e del sistema cardiovascolare (Ponderoso et al 1996; Wei et al 2000, Sarkela et al 2001; Calabrese et al 2007). Dopo NO, anche il monossido di carbonio (CO) è stato rivalutato e considerato come un gas modulatore di molte funzioni biologiche (Abe and Kimura 1996; Doeller et al 2005; Szabo 2007). Infatti anche il CO a concentrazioni fisiologiche mostra molti effetti benefici a livello del sistema gastrointestinale, cardiovascolare e nei confronti di fenomeni infiammatori (Li L et al 2009; Baumgart et al 2009), ma al contrario del NO mostra poche possibilità di sviluppo farmacologico, a causa della sua elevata tossicità e della scarsa maneggevolezza. Infatti CO lega saldamente l'emoglobina, impedendone il legame con l'ossigeno, e conduce rapidamente a morte (Whiteman et al 2004; Whiteman et al 2005). Infine un altro gas, che ha attirato un grande interesse scientifico, è il solfuro di idrogeno (H2S) (Abe and Kimura 1996; Doeller et al 2005; Szabo 2007; Polhemus and Lefer 2014).

6

Questo gas, incolore, infiammabile, solubile in acqua, che presenta il classico odore di uova marce, è ora conosciuto come un composto endogeno prodotto in quantità consistenti nei tessuti dei mammiferi. H2S esercita vari effetti fisiologici in molti sistemi

(Fig.2), in particolare nel distretto cardiovascolare (Abe and Kimura 1996; Doeller et al 2005; Szabo 2007; Miao et al 2016). H2S presenta una grande potenzialità nel campo dei

modulatori endogeni; infatti condivide molti effetti benefici con NO, in particolare quelli a livello del sistema CV, (Li et al 2009; Baumgart et al 2009) ma non porta alla produzione di ROS, anzi, ha dimostrato di agire come "scavenger" nei confronti di questi (Whiteman et al 2004; Whiteman et al 2005). L'attività benefica o tossica di H2S è fortemente

influenzata dalla concentrazione del gas. Infatti molte delle risposte biologiche indotte da H2S seguono una curva dose-risposta bifasica, dove basse concentrazioni promuovono

effetti cito-protettivi, mentre alte concentrazioni promuovono effetti cito-tossici (Szabo et al 2014). Infatti concentrazioni inferiori a 20μM stimolano la fosforilazione ossidativa e l'incremento della sintesi di ATP, poiché H2S (a queste concentrazioni) funge da substrato

della respirazione cellulare, portando ad effetti cito-protettivi. Al contrario, concentrazioni di circa 50μM causano una completa inibizione del complesso IV della catena respiratoria mitocondriale, portando ad effetti cito-tossici (Nicholls and Kim 1982). Il duplice aspetto di H2S suggerisce l'esistenza di un valore soglia del gas, in grado di

discriminare tra effetti benefici e una serie di effetti tossici che possono portare la cellula a morte (Pun et al 2010).

7

1.1 H

S: biosintesi endogena

Figura 3. Reazioni chimiche che portano alla produzione di H2S endogeno.

H2S endogeno è prodotto nei tessuti dei mammiferi prevalentemente attraverso una via

enzimatica, ma anche attraverso una via non enzimatica (Fig.3). La via non enzimatica, sebbene meno importante, procede attraverso la riduzione non enzimatica dello zolfo elementare ad H2S, utilizzando equivalenti di riduzione, ottenuti dall'ossidazione del

glucosio (il più importante è il lattato) (Fig.4).

2C

H

0

+ 6S

+ 3H

O

3C

H

O

+ 6H

S + 3CO

Figura 4. Reazione di ossidazione del glucosio.

Oltre a questi prodotti ottenuti dall'ossidazione del glucosio, che supportano maggiormente la produzione di H2S, sono presenti anche altri substrati, per esempio

carrier di elettroni come il NADH e NADPH e anche il GSH che ha proprietà di stimolare la produzione di H2S nei lisati cellulari di eritrociti umani. Probabilmente il GSH è il diretto

responsabile della maggior parte della produzione di H2S, il quale a sua volta, dopo essere

stato ossidato a GSSH , viene ridotto dal NADPH e riutilizzato nuovamente (Wang 2002; Searcy et Lee 1998). Per quanto riguarda invece la via enzimatica , L-cisteina è il substrato per la produzione di H2S e questo processo è garantito da due enzimi piridossale-5-fosfato

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(Vit B6) dipendenti che sono la cistationina- -sintasi (CBS) e la cistationina- -liasi (CSE)

(Chen et al. 2004). CBS e CSE sono largamente presenti nei tessuti dei mammiferi, ma la loro distribuzione non è omogenea (Kamoun 2004).

CBS è considerato come un enzima citoplasmatico,

però è stata documentata la sua presenza nei mitocondri di cellule normali e tumorali (Szabo et al 2013; Teng et al 2013). Questo enzima si trova in grandi quantità nel cervello (Abe and Kimura ; 1996)

e oltre che nel SN è stato anche trovato in vari altri tessuti, come il sistema cardiovascolare, il sistema respiratorio, nel tratto gastrointestinale (Whiteman et al 2011, Bucci et al 2014; Kimura 2014,2015) e nel fegato. Qui la CBS svolge maggiormente una funzione "detossificante" attraverso il metabolismo dell'omocisteina e la sua produzione è influenzata da ormoni, come i glucocorticoidi e l'insulina ( Fiorucci et al ; 2006, Ratnam et al 2002). Infine la CBS è presente anche nel rene, dove la sua produzione è influenzata anche da ormoni come il testosterone (Vitvitsky et al 2007). L'enzima CBS umano ha una struttura ad omotetramero e ciascuna subunità ha una dimensione di 63 kDa (Miles and Kraus 2004) (Fig.5), inoltre catalizza molte reazioni che portano alla produzione di H2S, come ad

esempio: la conversione della cisteina, in presenza di acqua, in serina ed H2S, la

condensazione della cisteina con omocisteina ad ottenere la cistationina e H2S, ed infine

la condensazione di due molecole di cisteina e dare lantionina e H2S (Fig.6). Inoltre

l'attività della CBS è considerata come la principale via di eliminazione dell'omocisteina (Singh et al 2011; Singh et al 2009).

9

Infatti la carenza di CBS è la causa più comune di omocisteinuria, un difetto metabolico che si manifesta dall'infanzia, dove sono state riscontrate molte mutazioni che portano ad una inattivazione della CBS ( Meier et al 2003, Yamanishi al 2006).

La CSE invece è considerata come la maggiore fonte di H2S nel sistema CV (Ishii et al 2004), dove il tasso di

produzione dell' H2S è stimato essere nel range del 3-6

nmol/min/g di tessuto. Sebbene originariamente si pensasse che la CSE fosse espressa nelle cellula di muscolatura vascolare, e non nelle cellule dell'endotelio, (Zhao et al 2001; Wang 2003) alcuni studi immunoistochimici più recenti hanno evidenziato che la CSE è maggiormente localizzata nello strato endoteliale e poco espressa nelle cellule di muscolatura liscia vascolare (Yang et al 2008). Inoltre la delezione genica di CSE causa un significativo calo della concentrazione di H2S nel sangue e negli organi del

sistema CV dei topi, con conseguente sviluppo di ipertensione e riduzione della risposta vasorilasciante (Yang et al 2008). La CSE, in condizioni basali, è presente nel citosol, sebbene abbia la capacità di traslocare nei mitocondri sotto un prolungato aumento di calcio intracellulare promosso da uno ionoforo del calcio. In condizioni fisiologiche, però, nessuno stimolo è in grado di alterare la sua distribuzione cellulare (Fu et al 2012). CSE ha una struttura di omotetramero e ciascuna subunità ha un peso molecolare di 45 kDa

Figura 6. Reazioni di produzione di H2S.

10

(Kabil and Banerjee 2014; Kimura, 2014) (Fig.7). Catalizza molte reazioni che portano alla formazione di H2S, ad esempio: la condensazione di due molecole di L-cisteina, con

conseguente formazione di un dimero, il quale viene trasformato in tiocisteina, piruvato e H2S. A sua volta la tiocisteina subisce due diversi destini metabolici; uno che, attraverso

una via non enzimatica, porta alla formazione di L-cisteina e H2S e un altro ,mediato dalla

CSE, che prevede la reazione della tiocisteina con un tiolo (ad esempio cisteina o GSH), portando alla formazione di H2S e CysS-R (Stipanuk & Beck 1982; Yamanishi & Tuboi 1981)

(Fig.8)

2L-Cysteine

L-Cystine

Vit B

Thiocysteine+Pyruvate+NH

+ R-SH

L-Cysteine + H

S

Vit B

CysSR + H

S

La produzione di H2S endogeno è anche mediata da un terzo sistema, che vede il

coinvolgimento dell enzima cisteina aminotransferasi (CAT), il quale catalizza la reazione tra cisteina e -Ketoglutarato, portando alla formazione del 3 mercaptopiruvato e L-glutammato. Il composto formatosi può essere desolforato dalla 3-mercaptopiruvato solfotransferasi (3MST), un enzima mitocondriale, portando alla formazione di H2S (Kuo et

al 1983; Shibuya et al 2009) (Fig.9).

Dimerization

CSE

CSE Non enzimatically

11

L-Cysteine + -Ketoglutarate 3-Mercaptopyruvate + L-Glutamate

Pyruvate+H

S

Thiosulphate + Pyruvate

GSH

H

S + H

SO

+ GSSG

Figura 9. Reazioni di biosintesi di H2S attraverso la via CAT/3-MST.

CAT

Vit B6

3-MST

+ SO32- CAT

12

1.2 H

S: catabolismo

Per quanto riguarda le vie responsabili del catabolismo di H2S, è da considerare che

questo composto può essere facilmente ossidato da agenti circolanti, poichè presenta caratteristiche riducenti (Whiteman et al 2004; Whiteman et al 2005; Chang et al 2008; Geng et al 2004). Tuttavia la più importante via del catabolismo di H2S si trova a livello

mitocondriale. Qui il solfuro, attraverso una via non-enzimatica, viene ossidato a tiosolfato. Il tiosolfato viene successivamente biotrasformato dall'enzima rodanasi, chiamata anche tiosolfato sulfotransferasi (TST), a solfito il quale a sua volta viene ossidato a solfato, dalla solfato ossidasi (Goubern et al 2007; Hildebrandt and Grieshaber 2008) (Fig.10a). Un altro meccanismo coinvolto nel catabolismo di H2S è la formazione

della sulfoemoglobina, che si ottiene dalla reazione di H2S con la metaemoglobina.

Questo prodotto può essere usato come biomarker della concentrazione plasmatica di H2S (Kurzban et al. 1999;Ishigami et al 2009) (Fig.10b). Un'altra via alternativa, che opera

solo a livello del citosol e che coinvolge piccole quantità di H2S, è la metilazione di H2S

dall'enzima tiolo-S-metiltransferasi, che porta alla formazione del metantiolo e del dimetilsolfuro (Furne et al 2001; Kimura 2012) (Fig.10c).

a

2HS

-

+ 2O

₂

S

₂

O

₃

2-

+ H

₂

O

S

2

O

3

2-

+ CN

-

SCN

-

+ SO

3

2-SO

3

2-

SO

4

2-b

H

₂

S + metaemoglobina

sulfoemoglobina

c

H

₂

S

CH

₃

-SH

CH

₃

-S-CH

₃

Figura 10. Reazioni di catabolismo di H2S. TST

SO

13

1.3 Meccanismi d'azione di H

S.

Il primo meccanismo che spiega l'azione biologica di H2S è la sua capacità di interagire con

i sistemi redox; infatti H2S reagisce con molte specie altamente reattive, come il perossido

nitrico, l'anione radicale superossido e il perossido di idrogeno (Whiteman et al 2004; Mitsuhashi et al 2005; Geng et al 2004; Kabil and Banerjee 2010). La loro neutralizzazione da parte di H2S rappresenta un meccanismo di protezione di proteine e lipidi dal danno

ossidativo indotto da queste molecole (Whiteman M et al 2004; Whiteman M et al 2005). Il ruolo cito-protettivo non specifico di H2S è anche dimostrato dal fatto che il gas riduce

la produzione dei ROS e la sovra-espressione della caspasi-3, previene la caduta del glutatione e la perdita del potenziale di membrana nei mitocondri di cardiomioblasti di ratto (Chen et al 2009). Inoltre H2S riduce eventi dannosi, associati a stress ossidativo e a

stress proteolitico, come la nitrazione dei residui di tirosina e l'attivazione delle metalloproteasi nella matrice miocardica (Mishra et al 2010).

1.3.1 Attivazione dei canali KATP.

Insieme a questi meccanismi non specifici, H2S esercita anche effetti attraverso specifiche

interazioni con target molecolari, in particolare in molti sistemi l'azione di H2S è mediata

dall'attivazione dei canali del potassio ATP- sensibili (KATP) (Zhao et al 2001). Infatti molti

effetti di H2S sono mimati da sostanze che attivano questi canali, come Pinacidil e

Diazossido, e aboliti da sostanze che li bloccano, ad esempio la Glibenclamide. I canali KATP

sono particolarmente importanti per diverse funzioni biologiche e vedono una collocazione pressoché ubiquitaria. Infatti li troviamo nelle cellule pancreatiche, nei neuroni, nel miocardio, nell'apparato scheletrico e nelle cellule di muscolatura liscia. I canali KATP sono considerati come un efficiente meccanismo biologico, capace di collegare

lo stato metabolico cellulare, con la loro attivazione/inibizione (Nichols 2006). Infatti in condizioni di elevato metabolismo energetico intracellulare, l'alta concentrazione di ATP è il principale fattore di inibizione del canale, al contrario in condizioni di basso metabolismo energetico intracellulare con l'aumento dei livelli di ADP e la diminuzione del rapporto ATP/ADP, si ha un' attivazione del canale, che assicura un flusso in uscita di ioni potassio (K+) con conseguente iperpolarizzazione di membrana. Questo peculiare meccanismo di attivazione/inibizione metabolismo-dipendente rende questi canali profondamente coinvolti nella regolazione di molte funzioni biologiche, come l'attività

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cardiaca, la regolazione del tono della muscolatura liscia, la secrezione di insulina, il rilascio di neurotrasmettitori (Nichols 2006). I canali KATP presentano una struttura ad

etero-ottamero (Fig.11), infatti sono formati dalla combinazione di due tipi di sub-unità transmembrana:

 le Kir cioè proteine formanti il poro, che appartengono alla famiglia delle "inward

rectifying potassium channel" ovvero proteine che facilitano l'entrata di cariche positive verso l'interno della cellula, piuttosto che verso l'esterno.

 le SUR (recettore per la sulfoniluree), subunità proteiche che fanno parte del sito

di legame del recettore per l'ATP, fungendo da "sensore" per il rapporto ATP/ADP. In particolare i canali KATP sono formati da quattro proteine Kir appartenenti alla

sottofamiglia 6 (Kir6) e a ciascuna di queste, è associata una subunità SUR (Miki et al 2005; Bryan et al 2004).

Figura 11. Struttura del canale KATP.

Vista la complessa struttura del canale KATP, è stato osservato che diversi tessuti

esprimono canali KATP formati da diverse combinazioni delle sub-unità Kir6 e SUR, ed è

stato anche dimostrato, attraverso esperimenti con mutazioni puntiformi sito-specifiche, che l'attivazione da parte di H2S del canale KATP, richiede obbligatoriamente la

contemporanea espressione di entrambe le sub-unità, mentre H2S è inefficace quando

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canale KATP sia localizzato sulla sub-unità SUR, in particolare a livello extracellulare

N-terminale (Jiang et al. 2009).

1.3.2 Attivazione dei canali KCa

Oltre all'interazione con i canali KATP, un altro tipo di canale al potassio sembra essere un

possibile target di H2S; si tratta del canale del potassio calcio-attivato (KCa) (Henning B et

al.2009). Questi canali sono classificati in base alla intensità di conduttanza:

 SK (canali e bassa conduttanza 2-25pS),

 IK ( canali a conduttanza intermedia 25-100 pS),

 BK (canali ad elevata conduttanza 100-300 pS).

Di questi, i canali BK sono quelli più studiati grazie all'elevata conduttanza e quindi al loro ruolo più significativo a livello cellulare.

I canali BK possiedono un duplice meccanismo di attivazione: sono infatti regolati sia dalla concentrazione intracellulare di ioni calcio, sia dal potenziale di membrana ed entrambi agiscono in maniera indipendente ma sinergica (Hooringan et al 2002). Insieme a questi due meccanismi, altri stimoli sono responsabili dell'attivazione di questi canali, come gli altri due gas trasmettitori NO e CO (Marijic et al 2001; Boloyina et al 1994; Wang et al 1997). Uno studio ha mostrato che H2S incrementa flussi di ioni in uscita attraverso il

canale BK, inducendo un incremento reversibile dell'apertura dei canali, probabilmente in maniera voltaggio-dipendente, ma calcio-indipendente (Sitdikova 2010). Questi dati hanno suggerito che H2S possa essere un attivatore di questo tipo di canali. Comunque

altri studi hanno invece riportato che i canali BK, presenti sul cellule HEK293, sono inibiti da H2S ma attivati da CO (Telezhkin et al 2009).

16 1.3.3 Attivazione dei canali Kv7

Oltre all'interazione di H2S con i canali KATP ed i canali BK, recentemente è stato ipotizzato

anche un coinvolgimento di H2S sull'attivazione di canali del potassio voltaggio attivati

KV7. Infatti, sulla base di studi funzionali, è stato ipotizzato che H2S agisca come un fattore

rilasciante derivato dagli adipociti (ADRF), attivando i canali Kv7 e provocando una risposta vasorilasciante sia sull'aorta, sia sull'arteria mesenterica di ratto, entrambe precontratte. Questo effetto è antagonizzato non solo da inibitori della CSE, ma anche da sostanze bloccanti dei canali Kv7 come XE991 (Schleifenbaum J et al 2010; Kohn C et al 2012). I canali del potassio Kv7 voltaggio attivati, giocano un ruolo cruciale sulla stabilizzazione del potenziale di membrana a valori di riposo negativi, contrastando l'eccitabilità elettrica in molti tipi di cellule (Robbins J 2001). Attualmente sono stati riconosciuti cinque sottotipi di canali Kv7 (Kv7.1-KV7.5) ciascuno dei quali mostra una

diversa distribuzione tissutale (Soldovieri MV et al 2011). La presenza dei canali Kv7 è stata dimostrata nelle cellule di muscolatura liscia vascolare (VSM cells), dove agiscono come un "freno sottosoglia". Questi canali vengono attivati a circa -60mV e mantengono il potenziale di membrana a riposo, lontano dalla soglia di attivazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (attivati a circa -40mV), prevenendo così la vasocostrizione (Ohya et al 2003; Mackie et al 2008; Mani et al 2011). Tra tutti i sottotipi di canali KV7, il KV7.4 è

quello maggiormente espresso a livello della muscolatura liscia vascolare; i KV7.1, KV7.3 e

il KV7.5 hanno una espressione variabile, mentre il KV7.2 sembra essere assente (Ng FL et

al 2011; Schenzer et al 2005; Bentzen et al 2006; Jepps et al 2011). Per indagare l'ipotesi del coinvolgimento di H2S sui canali Kv7 del potassio, Martelli e colleghi hanno testato

varie sostanze bloccanti dei canali del potassio su anellini di aorta, in cui è stato indotto un vasorilasciamento con NaHS. Da questi dati è stato visto che sostanze bloccanti dei canali Kv7, come linopirdina e XE991, hanno marcatamente antagonizzato la risposta vasorilasciante indotta da NaHS, supportando l'ipotesi del coivolgimento dei canali Kv7 nella risposta vasorilasciante. Le informazioni, ricavate da modelli vascolari di ratto, sono state traslate su cellule di muscolatura liscia vascolare umana (HASMC). Infatti NaHS su HASMC provoca un'iperpolarizzazione di membrana attraverso una fuoriuscita di ioni potassio. La retigabina, un attivatore dei canali Kv7, causa una lenta ma concentrazione-dipendente iperpolarizzazione della membrana delle HASMC, con un EC50 intorno al 10μM e questa concentrazione è simile a quella descritta per l'attivazione dei canali

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Kv7.4. Entrambi i bloccanti dei canali Kv7 linopirdina e XE991 antagonizzano significativamente l'iperpolarizzazione indotta da NaHS. Questi risultati supportano l'ipotesi che l'attivazione dei canali Kv7 presenti a livello vascolare, contribuiscano alla risposta vasorilasciante provocata da NaHS (Martelli et al 2013).

1.4 Cross-talk tra NO e H

S a livello cardiovascolare.

Nell'ultimo decennio è stata ipotizzata l'esistenza di un "cross talk" tra i due principali gas trasmettitori, NO e H2S in particolare a livello del sistema cardiovascolare, dove i due gas

svolgono i loro effetti più importanti (Whiteman and Moore 2009). Infatti i due gas si influenzano mutualmente a diversi livelli, dalla loro biosintesi, alle varie risposte biologiche a livello di targets cellulari (Gao et al 2012; Yong et al 2011). Come verrà trattato più approfonditamente nel capitolo successivo dedicato, H2S viene prodotto sia

attraverso una via non enzimatica, mediata da processi ossido-riduttivi che coinvolgono principalmente lo zolfo elementare ed il glucosio, sia da una via enzimatica che coinvolge gli enzimi cistationina-β-sintasi (CBS), cistationina-γ-liasi (CSE) e la 3-mercaptosulfotransferasi (3-MST) in combinazione con la cisteina aminotransferasi (CAT). Anche NO viene prodotto attraverso una via enzimatica per mezzo della ossido nitrico sintasi (NOS); di questo enzima esistono varie isoforme:

 nNOS, generalmente presente nel sistema nervoso centrale (CNS) la quale però è stata anche individuata nei nervi autonomi della muscolatura liscia dei vasi, nel tratto gastrointestinale, nel tratto respiratorio e nel tratto genitourinario (Forstermann et al 1994).

 iNOS, detta NO sintasi inducibile, che è stata identificata nelle diverse cellule immunologiche come i macrofagi (Marletta et al 1988) e i neutrofili (Yui et al 1991).

 eNOS, principalmente espressa nelle cellule endoteliali ma è anche presente in altri tipi di cellule come i cardiomiociti, epatociti, cellule intestinali, piastrine, neuroni e astrociti (Marsden et al 1993).

18

Lo ione nitrito (NO2─) e lo ione nitrato (NO3─) sono considerati come prodotti finali del

metabolismo endogeno di NO nelle cellule dei mammiferi, e vengono fisiologicamente riciclati per generare NO e altri ossidi di azoto (Lundberg et al 2008; Lundberg et al 2010). Recentemente questi ossidi di azoto, sono stati riconosciuti come "riserve" di NO nei tessuti dei mammiferi, in aggiunta alla sintesi endogena del gas, da parte delle NOS (Lundberg et al 2008). Inoltre è stato proposto anche un altro meccanismo di riserva di NO, ovvero che il glutatione ridotto (GSH) viene nitrosilato per generare S-nitroso-L-glutatione (GSNO) (Guix et al 2005). Da questo, attraverso alcuni enzimi come la GSH perossidasi e la thioredoxina reduttasi, viene liberato NO (Hou et al 1996; Nikitovic et al 1996). NO endogeno viene rapidamente metabolizzato e la sua eccessiva produzione, può essere dannosa per la cellula. Whiteman e colleghi hanno visto che, una miscela di vari NO-donors e NaHS (H2S donor) formano nuove specie chimiche conosciute come

nitrosotioli (Whiteman et al 2004) (Fig.12).

Per quanto riguarda gli effetti sinergici o antagonisti dei due gas, NO e H2S, in questi ultimi

anni si sono ottenuti molti risultati, talvolta anche discordanti fra loro. Un effetto interessante dei due gas, è stato osservato sull'attività contrattile dei cardiomiociti (Fig.13); infatti basse concentrazioni di NO manifestano un effetto inotropico positivo, mentre alte concentrazioni presentano un effetto inotropico negativo (Kojda and Kottenberg 1999).

Figura 12. Reazioni tra H2S e NO che portano alla formazione di nitroso tioli (Nagpure and

19

Anche NaHS ha un effetto inotropico negativo sui cardiomiociti (Geng et al 2004; Geng et al 2004). In uno studio è stato ossservato che una miscela di due tipi di donors, sodionitoprussiato (SNP) e NaHS, ha mostrato nei cardiomiociti, un marcato incremento dell'inotropismo, accompagnato da un incremento della velocità di contrazione e del rilassamento (Yong et al 2010). È stata ipotizzata quindi, una possibile interazione tra H2S

e NO a formare delle specie che possano avere un effetto inotropo e lusitropo positivo. La specie HNO e HSNO sono i principali candidati (Yong et al 2010; Filipovic et al 2012).

L'interazione tra H2S e NO sembra avere un ruolo anche nella cardioprotezione (Fig.14).

Infatti sia NO, derivante dalla eNOS, sia H2S manifestano dei forti effetti cardiprotettivi

contro patologie cardiovascolari come il danno da ischemia/riperfusione e l'insufficenza cardiaca; quindi i due gas potrebbero agire sinergicamente per proteggere il cuore da lesioni ischemiche (Roberts et al 2013; Liu et al 2012). L'inibizione della produzione di NO con L-NAME, un inibitore non selettivo della NO sintasi, attenua in modo significativo gli effetti cardioprotettivi del precondizionamneto con H2S (Pan et al 2006). La

somministrazione di NaHS allevia la cardiomiopatia tossica indotta da isoproterenolo, attraverso l'elevazione di livelli di NO nel miocardio e nel siero (Sojitra et al 2012). Inoltre H2S potrebbe regolare la produzione di NO attraverso la modulazione dell'attività di

eNOS e iNOS. Infatti è stato dimostrato che Il pretrattamento con H2S attiva la via eNOS,

in modo da conferire protezione contro il danno ischemico (Yong et al 2008). Infine, uno studio ha mostrato che l'applicazione esogena del SNP incrementa l'espressione di CBS e CSE, che si traduce nell'aumento della produzione di H2S nei tessuti di ratto (Zhao et al

20

2003). Questi dati suggeriscono che H2S e NO possono influenzare la loro produzione

reciprocamente, portando a dei possibili effetti durante situazioni ischemiche (Zhao et al 2003).

I due gas trasmettitori NO e H2S, sembrano cooperare reciprocamente anche nel

controllo del tono vascolare (Hosoki et al 1997) (Fig.15). È stato visto che un pretrattamento con 30μM di NaHS, aumenta significativamente il rilasciamento di cellule di muscolatura liscia, indotto da donatori esogeni di NO come il sodionitroprussiato (SNP) e la 3-morfolinosidnonimina. Inoltre NaHS sposta la curva dose-risposta, di entrambi i donatori di NO, a concentrazioni più basse (Hosoki et al 1997). Questi dati sono stati confermati da uno studio di Coletta e colleghi, in cui un pretrattamento con basse concentrazioni di NaHS, (30μM, 15 min), potenzia la risposta vasorilascinate su aorta toracica, dell'acetilcolina e del 2-(N,N-diethylamino)-diazenolate-2oxied (DEA/NO) (Coletta et al 2012). Inoltre è stato anche visto che il silenziamento del gene che codifica per l'enzima CSE, causa una sostanziale riduzione della risposta vasodilatatoria in anellini di aorta toracica, di entrambi i due vasodilatatori. Kubo e colleghi hanno comparato gli effetti di dosi cumulative di NaHS (1-300μM) sugli effetti vasorilascianti endotelio-dipendenti e endotelio-inendotelio-dipendenti di aorta toracica. Da questi dati è emerso che un pretrattamento con bassi dosi di NaHS, inibisce significativamente il vasorilasciamento indotto da acetilcolina, ma non influenza quello indotto da SNP (Kubo et al 2007). D'altra parte Zhao e colleghi hanno dimostrato che il SNP aumenta la produzione di H2S,

attraverso l'incremento dell'espressione e dell'attività della CSE nel tessuto vascolare di

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ratto, in maniera concentrazione dipendente (Zhao et al 2003). Inoltre Geng e colleghi hanno mostrato che NaHS inibisce la produzione di NO in cellule di tessuto aortico e che basse concentrazioni di NaHS downregolano la via L-arginina/NO (Geng et al 2007). Zhao e Wang hanno dimostrato che la potenza vasorilasciante indotta da H2S (0,01-1mM) è

attenuata dalla rimozione dell'endotelio e dall'utilizzo di L-NAME (Zhao and Wang 2002). Coletta e colleghi, hanno notato che l'inibizione della eNOS porta ad una diminuzione dell'azione vasorilasciante stimolata da H2S, dimostrando che NO, prodotto dalla eNOS, è

richiesto negli effetti vascolari promossi da H2S (Coletta et al 2012). Il silenziamento

dell'enzima CSE, responsabile della produzione di H2S, porta alla riduzione della

formazione di cGMP NO-indotta e attenua il vasorilasciamento promosso dall'acetilcolina, individuando un parziale coinvolgimento di H2S, nell'azione vascolare di NO. L'azione di

H2S e NO converge a livello del cGMP, poichè H2S mantiene un effetto inibitorio sulla

fosfodiesterasi 5 (PDE5), ritardando la degradazione del cGMP (Coletta et al 2012).Uno

studio ha dimostrato come la somministrazione di L-NAME, causa una disfunzione del pathway di H2S a livello vascolare. Infatti la somministrazione di L-NAME in ratti Wistar

per 6 settimane, induce una down-regulatiuon del gene che codifica per la CSE e un decremento dell'attività della CSE. Questo trattamento riduce anche i livelli di H2S nel

plasma e la produzione di H2S a livello dell'aorta toracica e dell'arteria mesenterica

superiore (Zhao et al 2003). Uno studio di Testai e colleghi, ha messo in evidenza una differente interazione tra H2S e NO, in arterie coronariche di animali ipertesi e normotesi.

In particolare è stato osservato che in ratti normotesi (NTRs), il rilasciamento di arterie coronariche promosso da H2S, richiede NO e viceversa il rilasciamento promosso da NO

richiede H2S. Si può ipotizzare quindi che in ratti normotesi, H2S e NO possano

mutualmente interagire per promuovere un accumulo di cGMP intracellulare, in accordo con altri studi. Al contrario in condizioni di ipertensione, questa interazione tra H2S e NO è

perduta; questo porta ad ipotizzare, in condizioni di ipertensione, vengano promossi e/o rafforzati dei meccanismi mediati da NO indipendenti da H2S, e dei meccanismi mediati

da H2S indipendeti da NO, portando alla perdita dela croos-talk tra i due gas (Testai et al

22

23

1.5 H

S: Ruolo nell'organismo

Le cellule nei tessuti dei mammiferi sono fisiologicamente esposte a concentrazioni di H2S

nell'ordine del micromolare (Papapetropulos et al 2015) e, nonostante le basse concentrazioni, H2S gioca un ruolo importante come modulatore endogeno di diverse

funzioni biologiche ad esempio a livello del sistema respiratorio (Kubo et al 2007), del sistema gastrointestinale (Farraugia and Szurszewski 2014), del sistema endocrino (Carter and Morton 2016), del sistema nervoso (Kamat et al 2015) e nel sistema cardiovascolare (Bucci and Cirino 2011; Yang and Wang 2015); inoltre è stato anche osservato un importante ruolo di H2S nella biologia del cancro (Mark et al 2015).

1.5.1 Sistema Respiratorio.

A livello del sistema respiratorio, H2S sembra avere un ruolo importante nel

rilasciamento della muscolatura liscia (Fig.16).

Studi dimostrano che H2S causa un significativo e marcato rilasciamento della

muscolatura liscia bronchiale in esperimenti condotti su topi. Sebbene l'attivazione del canale KATP e la possibile cooperazione con il sistema NO/cGMP, sono chiaramente

coinvolti nella modulazione del tono vascolare (Moore et al 2003; Ali et al 2006; Kubo et al 2007), la riposta rilasciante mediata da H2S nelle cellule di muscolatura liscia dei

bronchi di topo, sembra non coinvolgere il crosstalk con NO (Kubo et al 2007). La produzione di H2S mediata dalla CSE, sembra anche esercitare un ruolo benefico nei

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confronti dell'asma. Infatti H2S inibisce la degranulazione mastocitaria antigene-indotta,

evidenziando un possibile ruolo del gas trasmettitore anche per altre malattie su base infiammatoria (Wu et al 2007; Wu et al 2008; Chenet al 2009; Martelli et al 2015). Inoltre sembra anche avere un ruolo protettivo nei confronti della broncopneumopatia cronico-ostruttiva; infatti aumentati livelli di H2S nel siero, in soggetti con una lieve BPCO,

sembrano avere un ruolo nella protezione delle vie respiratorie, contrastando lo stress ossidativo, l'infiammazione e prevenendo la progressione della malattia. D'altra parte quando i livelli nel siero di H2S si abbassano, i pazienti presentano un peggioramento del

quadro clinico della malattia (Chen et al 2005). Infine H2S sembra avere una marcata

azione antinfiammatoria dimostrata anche sperimentalmente, attraverso studi condotti su modelli di danno acuto nel polmone di ratto, indotto da acido oleico. Qui la somministrazione di NaHS porta ad un decremento di citochine pro-infiammatorie, come IL-6 e IL-8 e aumentati livelli di citochine anti-infiammatorie, come IL-10 (Li et al 2008).

1.5.2 Sistema gastrointestinale.

Un altro distretto in cui è presente H2S è quello gastrointestinale, dove regola la motilità

(Farraugia and Szurszewski 2014). Infatti causa un rilasciamento dose-dipendente delle cellule di muscolatura liscia del colon e dell' ileo. Questo effetto è antagonizzato dalla glibenclamide, un bloccante dei canali KATP, indicando il chiaro coinvolgimento di questi

nell'azione rilasciante. Oltre all'effetto rilasciante sulla muscolatura, H2S presenta anche

una funzione anti-nocicettiva. Questa azione è dimostrata dalla riduzione, da parte di H2S,

dello stimolo dolorifico indotto dalla distensione colon-rettale nei ratti. L'effetto anti-nocicettivo è di nuovo impedito dai bloccanti dei canali KATP, ma questo effetto è

indipendente dall'attività rilasciante di H2S sulla muscolatura liscia (Fiorucci et al 2006).

H2S presenta un ruolo protettivo a livello dello stomaco e del piccolo intestino; infatti

incrementa il flusso sanguigno gastrico, diminuisce la produzione di mediatori dell'infiammazione e incrementa la produzione di prostaglandine. Tutto questo risulta in un effetto protettivo nei confronti della mucosa gastrica, contro danni da stimoli nocivi come farmaci, etanolo e stress (Magierowski et al 2015).

25 1.5.3 Sistema endocrino.

Il ruolo cruciale dei canali KATP nel controllo della secrezione di insulina da parte delle

cellule pancreatiche, è già ben conosciuta. Infatti la risposta ipoglicemica indotta da sostanze bloccanti dei canali KATP (per esempio farmaci come le sulfaniluree), sono

largamente impiegati nel controllo farmacologico del diabete di tipo 2. L'attivazione farmacologica dei canali KATP, è stata recentemente indicata come possibile strategia per

proteggere le cellule pancreatiche in pazienti con sindrome metabolica dalla morte cellulare, che è considerata la principale causa di progressivo sviluppo del diabete di tipo 2, in questi pazienti (Hansen et al 2004). H2S è probabilmente coinvolto nella secrezione

di insulina, infatti relativamente grandi quantità di CSE e CBS sono state trovate nel pancreas. In recenti studi, l'espressione pancreatica della CSE e la produzione di H2S sono

state analizzate in ratti grassi diabetici di Zucker (ZDF), in ratti grassi di Zucker (ZF) e in ratti magri di Zucker (ZL), ed è stato osservato che i livelli di CSE e di H2S sono molto più

elevati in ZDF, piuttosto che in ZF e ZL. Di conseguenza i ratti ZDF mostravano un ridotto livello di insulina nel siero, iperglicemia e insulino-resistenza. Dopo un trattamento di quattro settimane con una iniezione intraperitoneale di PAG (inibitore dell' enzima CSE), è stato osservato un incremento dei livelli di insulina nel siero e un'abbassamento dell'iperglicemia. L'applicazione di 100μM di H2S ha incrementato significativamente la

corrente di potassio attraverso i canale KATP, la quale è invece inibita da sostanze bloccanti

dei canali KATP come la gliclazide 1μM (Wu et al 2009). In accordo con la stimolazione da

parte di H2S dei canali KATP, PAG incrementa il rilascio di insulina da cellule di insulinoma

di ratto (INS1-E)(Yang et al 2005), mentre l'applicazione di H2S esogeno riduce i livelli di

insulina glucosio-indotta in queste cellule (Yang et al 2005) e in cellule di isole pancreatiche di ratto isolate. Altri esperimenti hanno dimostrato che H2S endogeno, così

come H2S esogeno, possono indurre apoptosi in INS1-E, attraverso un incremento dell'

attivazione della via p38 MAPK del reticolo endoplasmatico (Yang et al 2007). È stato recentemente scoperto che alte concentrazioni di glucosio, il quale di per sé è uno stimolo pro-apoptotico nei confronti delle cellule del pancreas, incrementa l'espressione della CSE e la formazione di H2S, in cellule di pancreas di animali

normoglicemici. H2S esogeno inibisce l'apoptosi, indotta da alte concentrazioni di

glucosio, in cellule pancreatiche; quindi un incremento della produzione di H2S

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preserva le cellule pancreatiche dalla tossicità glucosio indotta, e attenua la morte delle cellule pancreatiche promossa da alte concentrazioni di glucosio (Kaneko et al 2009). Un altro studio (Brancaleone et al 2008) ha mostrato che la biosintesi enzimatica di H2S è

alterata nei modelli di ratto di diabete di tipo 1 e che tale riduzione di H2S è associata ad

un'alterazione della reattività vascolare. Tutte queste informazioni suggeriscono che un deficit di H2S può avere un ruolo rilevante nella progressione del diabete associata a

complicanze cardiovascolari.

1.5.4 Sistema nervoso.

Un' alta espressione della CBS, a livello dell'ippocampo e del cervelletto di ratto, è stata per la prima volta osservata da Abe e Kimura nel 1996, i quali hanno anche dimostrato la presenza di H2S negli omogenati di cervello (Abe and Kimura; 1996 ). Questi risultati sono

stati rafforzati dal fatto che inibitori della CBS riducono la concentrazione di H2S nel

cervello, così come i livelli di H2S sono ridotti in topi CBS-knockout (Eto K et al 2002). Nei

neuroni del SNC, H2S promuove la produzione di cGMP, portando ad un incremento della

sensibilità dei recettori NMDA del glutammato (Kimura 2000). Questa sensibilizzazione è promossa da concentrazioni di H2S piuttosto elevate (50-160μM), le quali contribuiscono

all'induzione del potenziamento a lungo termine dell'ippocampo e ad un miglioramento della plasticità neuronale, portando ad un miglioramento dell'apprendimento e della memoria (Kimura et al 2000; Kimura 2013). L'aumentata produzione di cAMP, attiva la proteina chinasi A, la quale regola molte funzioni cerebrali attraverso la fosforilazione intracellulare di residui proteici, ma questo non è il solo meccanismo intracellulare in cui sembra essere coinvolto H2S. Infatti sembra anche avere un ruolo nella protezione dei

neuroni dallo stress ossidativo, attraverso l'attivazione della tirosina chinasi a monte del recettore (Tan et al 2010). Recenti studi riportano che H2S inibisce la produzione di NO

lipopolisaccaride (LPS)-indotta nelle microglia, tramite l'inibizione della via del p38-MAPK; inoltre le MAPK regolano molte funzioni cellulari come l'apoptosi, la differenziazione e il metabolismo. Questi dati suggeriscono un ruolo di H2S nel trattamento dell'ischemia

cerebrale e nelle malattie neuro-infiammatorie. Inoltre H2S sembra promuovere

l'incremento di Ca2+ intracellulare nelle microglia, il quale rappresenta la più importante forma di difesa immunitaria attiva nel SNC. Queste osservazioni, insieme al fatto che H2S

27

attenua l'infiammazione LPS-indotta (Hu et al 2007), sembrano indicare un ruolo protettivo di H2S nei confronti dell'infiammazione e del danno neuronale (Tan et al 2010;

Bhatia et al 2015). È stato recentemente studiato l'effetto anti-infiammatorio e neuroprotettivo dell'H2S endogeno biosintetizzato dall'enzima CBS, negli astrociti umani. I

risultati ottenuti hanno suggerito un grande potenziale terapeutico per fonti esogene di H2S, in patologie neurodegenerative come Parkinson e Alzheimer (Fig.17 e 18) ( Lee et al

2009; Bhatia et al 2015).

H2S è anche responsabile dell' azione antiossidante protettiva, promossa dall'apertura dei

canali KATP (Kimura et al 2006; Kimura & Kimura 2004), in colture cellulari di neuroni

umani, in cui lo stress ossidativo era indotto dal trattamento con perossido nitrico. Questo apre una promettente prospettiva per il possibile ruolo di H2S nella protezione

dalle malattie neurodegenerative (Eto et al 2002; Kida et al 2011). Per quanto riguarda il ruolo di H2S nei confronti dei neurotrasmettitori, è stato osservato che H2S migliora il

danno ippocampale indotto da ricorrenti attacchi febbrili, contrastando la perdita dei recettori GABABR1 e GABABR2 (Han et al 2005; Han et al 2005). Inoltre H2S potrebbe

avere un impiego terapeutico in malattie di natura eccitatoria come l'epilessia, Figura 17. Pathaway coinvolti negli effetti

benefici di H2S, nel morbo di Parkinson.

Figura 18. Pathaway coinvolti negli

effetti benefici di H2S, nel morbo di

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ripristinando il bilancio eccitatorio/inibitorio che viene alterato (Han et al 2005; Han et al 2005; Kamat et al 2015). Per quanto riguarda le vie di neuro-trasmissione del glutammato, H2S sembra avere un effetto attivatore dei recettori NMDA del glutammato.

Infatti una progressiva esposizione delle cellule al glutammato, porta alti valori di H2S

nella cellula, causato da un sovraccarico di calcio, che porta di conseguenza alla morte neuronale (Gagliardi 2000; Garcia-Bereguiain et al 2008). Possibili effetti tossici di H2S sul

SNC sono stati osservati a concentrazioni sub-letali o letali, in quanto questo gas inibisce le MAO, con il risultato di provocare un forte aumento di adrenalina e noradrenalina nell'ippocampo, nel nucleo striato e nel tronco encefalico, ma non nella corteccia e nel cervelletto (Warenycia et al 1989).

1.5.5 Effetti biologici di H2S nel Cancro.

La scoperta dell'importanza di H2S, derivato dalla CBS, nella biologia del cancro è molto

recente. Infatti le informazioni attuali, supportate da molti dati sperimentali, dimostrano che la CBS è over espressa a livello delle cellule di vari tipi di cancro e questa up-regulation porta ad un incremento della produzione di H2S.

Questo a sua volta stimola la funzione mitocondriale e attiva la proliferazione cellulare; inoltre H2S agisce come antiossidante mitocondriale con azione citoprotettiva per la

cellula tumorale. H2S presenta anche un'attività paracrina, poichè diffonde attraverso le

membrane al di fuori della cellula cancerosa, nel microambiente tumorale dove stimola l'angiogenesi e la vasodilatazione locale che a sua volta fa si che il tumore riceva più ossigeno e nutrienti (Baskar and Brian 2011) (Fig.19).

Però H2S presenta un profilo biologico molto complesso, dovuto al fatto che esibisce un

effetto ormetico dove basse concentrazioni di H2S, causano un incremento della

proliferazione cellulare e un'attività positiva sulla vitalità cellulare; mentre la Figura 19. Effetti di H2S nei confronti delle cellule tumorali.

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somministrazione esogena di H2S attraverso H2S-donors e quindi l'aumento della sua

concentrazione intra-cellulare, stimola l'inibizione della proliferazione e l'apoptosi indotta da alte concentrazioni di H2S, che causano eventi citotossici per la cellula. Questo effetto

è particolarmente evidente nelle cellule tumorali (Fig.20) (Szabo et al 2016). Lo studio di Cai e colleghi ha indagato in quale range di concentrazioni, in cellule HCT116 e SW480, fosse evidente questo duplice effetto di H2S ed ha riportato che, in modo

concentrazione-dipendente, si ha una stimolazione della proliferazione cellulare a concentrazioni tra 10 e 50μM, un plateau a 200μM e una inibizione della proliferazione a 1000μM (Cai et al 2010). Un altro studio, concentrandosi sugli effetti degli H2S-donors sulle cellule tumorali,

ha evidenziato come anche la velocità del release di H2S, vada ad influenzare l'effetto

biologico del gas trasmettitore. In questo studio hanno valutato il tasso di proliferazione cellulare in cellule del cancro del colon HCT116, in presenza di diverse concentrazioni di NaHS ( un donatore rapido di H2S) e di GYY4137 (un donatore lento di H2S) con o senza il

pretrattamento con l'acido ammino-ossiacetico (AOAA) un inibitore dell'enzima CBS. È stato osservato che:

 in assenza di AOAA, basse concentrazioni (0.03-0.3μM) di NaHS stimolano la proliferazione cellulare, mentre alte concentrazioni

 (1-3mM) ne inibiscono la proliferazione.

 in presenza di AOAA, si ha uno spostamento a sinistra della curva dose-risposta, con un decremento della proliferazione basale e una limitazione della tossicità, che rimane invariata solo sulle cellule esposte a concentrazioni del 3mM.

 in assenza di AOAA tutte le concentrazioni di GYY4137 (0.03-3mM) stimolano la proliferazione cellulare, rispetto al tasso di crescita basale.

 in presenza di AOAA, solo la concentrazione più alta di GYY4137 (3mM) stimola la crescita cellulare.

Questi dati, dimostrano che la proliferazione cellulare di cellule del cancro del colon mostra una curva dose-risposta bifasica, detta a "campana", caratteristica dell'effetto ormetico di H2S. La proliferazione o l'apoptosi delle cellule è determinata dalla velocità

del rilascio di H2S (donatori "veloci" vs donatori "lenti"), ed anche dalla concentrazione

30

2015). Sono stati condotti molti studi sperimentali su vari tipi di cancro come il cancro del seno, renale, prostatico e in particolare, sul cancro colon-rettale e sul cancro ovarico. I risultati hanno mostrato molte analogie e anche dei promettenti dati preclinici (Szabo et al 2013; Bhattacharyya et al 2013; Zhang et al 2005; Guo et al 2012). In questi studi su cellule tumorali, è stato osservato un incremento dell'espressione dell'enzima CBS, correlato ad un aumento della produzione di H2S, ma l'espressione di altri enzimi

responsabili della produzione di H2S (CSE e 3MST) non è aumentata (Szabo et al 2013;

Bhattacharyya et al 2013). Il silenziamento del gene che codifica per l'enzima CBS, ha portato ad una significativa inibizione della proliferazione della linea cellulare di cancro epiteliale del colon (HCT116) e anche della linea di cancro ovarico A2870 (Szabo et al 2013; Bhattacharyya et al 2013). Inoltre sono stati osservati anche la riduzione del consumo basale di O2, il decremento del rapporto NAD/NADH, la soppressione dell'ATP e

anche un significativo decremento della vitalità cellulare (Szabo et al 2013; Bhattacharyya et al 2013). È stato anche osservato un notevole abbassamento della produzione di ROS, in linea con il ruolo antiossidante di H2S (Szabo et al 2013; Bhattacharyya et al 2013). La

soppressione della CBS ha ridotto significativamente anche la densità dei vasi sanguigni del tessuto tumorale, confermando l'ipotesi che H2S possa avere anche un ruolo nel micro

ambiente tumorale, andando a stimolare l'angiogenesi. Al contrario il silenziamento del gene che codifica per la CSE, non ha portato nessuno effetto significativo, né sulla proliferazione cellulare né sull'attività bioenergetica di cellule HCT116 e A2870 (Szabo et al 2013; Bhattacharyya et al 2013).

Figura 20. Effetto ormetico di H2S nei confronti delle

31

Molti studi hanno dimostrato un incremento dei livelli di H2S esalato, in pazienti affetti da

cancro, ma la causa di ciò non è ancora stata studiata (Altomare et al 2013; Huang et al 2010; Kumar et al 2012; Yamagishi et al 2012). Inoltre è stata trovata un elevata quantità di tiosolfato (il prodotto più stabile della degradazione di H2S) nelle urine di pazienti

affetti da cancro della prostata; i livelli di tiosolfato sono circa 50 volte più alti rispetto ad un gruppo di controllo e 5 volte più alti rispetto a pazienti con iperplasia prostatica benigna (Chwatko et al 2013). Di nuovo però, la causa di ciò, non è ancora stata definita. Da tutti questi dati sperimentali, emerge quanto H2S sia fondamentale per la

sopravvivenza cellulare di molti tipi di cellule, in particolare quelle tumorali.

1.5.6 Effetti di H2S nel sistema cardiovascolare.

H2S è presente in maniera pressoché ubiquitaria nell'organismo e svolge molti effetti

farmacologici. In particolare H2S è coinvolto nel controllo dell'omeostasi del sistema

cardiovascolare (Bucci and Cirino 2011; Yang and Wang 2015) (Fig.21).

32

A livello della muscolatura liscia dei vasi, H2S promuove un effetto vasorilasciante,

causato principalmente dall'attivazione dei canali del potassio, che portano ad una iperpolarizzazione della membrana (Liu et al 2012). Questo effetto è stato dimostrato da alte dosi di H2S, in aorta di ratto isolata; mentre la somministrazione in acuto di

glibenclamide (bloccante dei canali KATP), inibisce significativamente l'effetto rilasciante di

H2S (Zhao et al 2001). L'importanza biologica dell'interazione tra H2S e i canali KATP è

sottolineata dal fatto che, riducendo la sintesi endogena di H2S, si ha anche un

decremento dell'attività di questi canali (Tang et al 2005).

Oltre ai KATP, altri canali del potassio coinvolti nella regolazione del tono vascolare di H2S,

sono i canali Kv. Lo studio di Martelli e colleghi ha confermato l'esistenza di questi canali, focalizzando maggiormente l'attenzione sulla caratterizzazione di una specifica famiglia di canali KV, i canali KV7 e ha anche dimostrato il loro coinvolgimento nella risposta

vasorilasciante promossa da NaHS (Martelli et al 2013). Anche un terzo tipo di canali del potassio sembrano essere coinvolti nella risposta vasorilasciante di H2S in vasi di

resistenza; sono i canali del potassio calcio attivati KCa. Questi canali si dividono in base

all'intensità di conduttanza di ioni potassio in SKCa, IKCa, BKCa (Jackson-Weaver et al 2013)

ed in particolare i canali BK, presentano un importante ruolo biologico e sono coinvolti nella regolazione di molti meccanismi come il controllo del tono vascolare (Eichhorn and Dobrev 2007) e la regolazione della attività elettrica della cellula (Calderone 2002; Salkoff et al 2006). Oltre ai meccanismi vasorilascianti di H2S mediati dall'attivazione dei canali

del potassio, ne sono stati ipotizzati altri indipendenti da questi canali come l'inibizione della PDE5 da parte di H2S, che porta ad una riduzione del catabolismo del cGMP. Di

conseguenza l'aumento della concentrazione di cGMP può spiegare l'effetto vasorilasciante di H2S (Bucci et al 2010). Il cambiamento intracellulare dell'equilibrio

acido-base influenza l'attività delle cellule di muscolatura liscia vascolare. Generalmente, l'acidificazione porta ad un effetto vasorilasciante, mentre l'alcalinizzazione porta ad un effetto vasocontratturante. In base a queste considerazioni, è stato ipotizzato che H2S

possa indurre un cambiamento del pH intracellulare, portando all'attivazione dello scambiatore Cl-/HCO3-, inducendo così l'acidificazione della cellula. Questa via è stata

anche associata con la stimolazione dei canali KATP, portando così all'iperpolarizzazione di

membrana e al vasorilasciamento (Lee et al 2007). Gli effetti vasorilascianti di H2S e il

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questo gas trasmettitore, possa essere utilizzato per il trattamento di alcuni tipi di

ipertensione. Infatti è stato dimostrato che la somministrazione esogena di NaHS, così

come la somministrazione di GYY4137, un donatore lento di H2S, in ratti spontaneamente

ipertesi (SHR) induce una significativa diminuzione della pressione (Li et al 2008). Inoltre in questi ratti è stata osservata una significativa diminuzione dei livelli di H2S nel plasma,

data da un cambiamento nell'espressione del gene che codifica per l'enzima CSE. È comunque importante riportare che H2S non presenta solamente un effetto

vasorilasciante sulla muscolatura liscia vascolare, ma anche un effetto vasocontratturante, infatti il gas trasmettitore presenta un effetto bifasico, concentrazione dipendente. La somministrazione esogena di H2S, attraverso NaHS a

concentrazioni superiori al 100μM manifesta un effetto vasorilasciante su cellule di muscolatura liscia vascolare, mentre a concentrazioni di 30μM provoca un effetto vasocontratturante (Wang 2012).

Un'altra patologia in cui H2S sembra avere delle interessanti applicazioni, è l'aterosclerosi

(Fig. 22).

34

Lo sviluppo di questa patologia vede la presenza di molti fattori, come l'infiammazione a livello vascolare, la proliferazione e la migrazione delle cellule di muscolatura liscia vascolare (VSMC), la formazione di trombi e un'abnorme risposta immunitaria, caratterizzata dall'infiltrazione e differenziazione dei monociti e dalla trasformazione dei macrofaci in cellule schiumose a livello della lesione (Pan et al 2012). È stato dimostrato che la produzione di H2S e i suoi livelli nel plasma, sono diminuiti in topi Apo-E knockout

che manifestano placche aterosclerotiche nell'aorta. La somministrazione di H2S esogeno

diminuisce la dimensione della placca, mentre la somministrazione di PAG, riducendo i livelli di H2S nel plasma, ne incrementa la dimensione (Wang et al 2009). La disfunzione

endoteliale è considerata un evento precoce importante nello sviluppo dell'aterosclerosi. Questa è associata principalmente ad un incremento dello stress ossidativo, ad un aumento della sintesi di fattori pro-infiammatori e ad una aumentata sintesi di molecole di adesione (Mani et al 2014). Uno studio ha dimostrato che in topi Apo-E knockout con aterosclerosi, i livelli di molecole di adesione intracellulari di tipo 1 (ICAM-1) sono aumentati, insieme ad un aumento della dimensione della placca aterosclerotica; successivamente alla somministrazione di H2S esogeno, questi diminuiscono (Wang et al

2009). Il meccanismo con cui H2S inibisce la produzione di ICAM-1 sembra essere dovuto

all'inibizione di NF-KB e del TNF α che, a loro volta, porterebbero all'aumento delle ICAM-1 (Wang et al 2009). H2S presenta una forte azione antiossidante, In particolare agisce

come "scavenger" nei confronti dei ROS e incrementa la produzione degli enzimi antiossidanti (Shen et al 2015). Inoltre attiva l'Nrf2, un potente fattore di trascrizione antiossidante il quale causa una up-regulation dei geni che codificano per specifici fattori come la glutatione reduttasi, la glutatione-S-transferasi e la catalasi, aumentando le difese antiossidanti endogene (Calvert et al 2010). Anche i macrofagi sembrano avere un ruolo importante nella patogenesi dell'aterosclerosi, attraverso la produzione di cellule schiumose cariche di lipidi e alla secrezione di mediatori dell'infiammazione. L'assorbimento delle LDL ossidate (oxLDL) da parte dei macrofagi, contribuisce alla formazione delle cellule schiumose cariche di lipidi, che rappresentano il fattore primario nella formazione della placca aterosclerotica (Moore and Tabas 2011). Uno studio condotto in vitro, ha dimostrato che le oxLDL potrebbero down-regolare il patway di CSE/H2S, il quale esercita un effetto antinfiammatorio sui macrofagi stimolati da oxLDL,

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attraverso la soppressione del segnale JNK/NF-KB (Wang et al 2013). Inoltre H2S inibisce

significativamente l'accumulo dei macrofagi e riduce la lesione aterosclerotica nell'aorta nei topo Apo-E knockout. La somministrazione di PAG promuove un effetto opposto: aumenta la dimensione della placca e aumenta l'accumulo dei macrofagi nella lesione (Lin et al 2016).

H2S sembra avere anche un ruolo cardioprotettivo nei confronti dell'insufficienza

cardiaca (Fig.23), una patologia che consiste nell'incapacità del cuore di soddisfare i

bisogni metabolici dell'organismo. Questa può essere causata da molti diversi fattori come stati di prolungata condizione ipertensiva, presenza di placche aterosclerotiche, infarto del miocardio, ischemia associata a disfunzione coronarica e condizioni di diabete e obesità. Molti di questi fattori hanno alla base una condizione di infiammazione, che ritarda la fase di riparazione del danno (Swirski and Nahrendorf 2013).

È stato osservato in topi CSE knockout, i quali manifestano insufficienza cardiaca, che i livelli di H2S circolanti sono bassi e questa condizione è associata ad un peggioramento

della funzione miocardica, ad un allargamento dell'area infartuata ed ad una marcata riduzione dei microvasi (Kondo et al 2013; Papapetropulos et al 2009). La sovra-espressione della CSE, con l'incremento della produzione endogena di H2S, induce una

protezione dall'ischemia causata dall'insufficienza cardiaca (Calvert et al 2010). Nell'insufficienza cardiaca è stato osservato che i livelli di proteina c reattiva, un

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biomarker dell'infiammazione, citochine pro-infiammatorie come il TNF α e IL-6, aumentano sistematicamente (Shiranzi et al 2017). La somministrazione di H2S, attraverso

la sua azione anti-infiammatoria, inibisce marcatamente l'espressione delle citochine infiammatorie, in esperimenti condotti in vivo, su modelli di ratto con insufficienza cardiaca (Pan et al 2017). La somministrazione di H2S sembra essere capace di indurre il

fenomeno dell'angiogenesi e, di conseguenza, portare ad un miglioramento della funzione cardiaca (Polhemus et al 2013). Uno studio in vitro con matrigel, ha dimostrato che l'incubazione con concentrazioni di H2S nell'ordine del micromolare, causano un

incremento del numero delle cellule endoteliali, della migrazione cellulare e della formazione dei capillari (Szabo & Papapetropulos 2011). In modelli di insufficienza cardiaca causata da ipertensione, la somministrazione di H2S induce angiogenesi nel

miocardio e un rallentamento del rimodellamento del ventricolo sinistro (Polhemus et al 2013). I meccanismi con cui H2S sembra promuovere l'angiogenesi sono molti, tra cui

l'attivazione dei canali KATP. Infatti l'uso di bloccanti dei canali KATP, sembra inibire

l'angiogenesi indotta da H2S (Papapetropulos et al 2009). Il gas sembra anche limitare la

produzione di fattori anti-angiogenici e di incrementare la poduzione di fattori pro-angiogenici come il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), un fattore chiave nell'angiogenesi fisiologica, il quale è responsabile dell'angiogenesi nell'ischemia miocardica e nell'infarto del miocardio (Kai et al 2012). H2S esplica un ruolo

cardioprotettivo anche nei confronti del danno da ischemia/riperfusione (I/R) a livello del miocardio. Il danno da I/R è una della cause della distruzione tissutale e spesso può portare ad insufficienza cardiaca. Sebbene la riperfusione attenui l'ischemia, porta con se una serie di reazioni quali stess ossidativo e infiammazione, causando danno alla cellula (Dhalla et al 2000).

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In uno studio è stato osservato che un pre-condizionamento cardiaco con anidride solforosa (SO2), causa una significativa riduzione del danno da I/R nei confronti del

miocardio, con incremento della sua capacità antiossidante, probabilmente data dalla up-regulation del pathway H2S/CSE (Jin et al 2013). Inoltre H2S riduce la regione infartuata

del miocardio ed incrementa la funzione del ventricolo sinistro in un modello di I/R nel cuore del maiale, riducendo l'apoptosi dei cardiomiociti (Osipov et al 2009). In un altro studio è stato inoltre dimostrato che l'inibizione farmacologica della CSE, incrementa l'area infartuata in ratti con danno da I/R e che la somministrazione di H2S, causa una

protezione del miocardio (Elrod et al 2007). I mitocondri sono i principali attori nella produzione di ATP nella cellula, regolandone i processi di morte e di apoptosi (Murphy et al 2007). Durante un evento ischemico, la riduzione dei livelli di ossigeno provoca il blocco della respirazione mitocondriale e della fosforilazione ossidativa, con conseguente riduzione dei livelli intracellulari di ATP e compromissione della funzione mitocondriale (Halestrap et al 2010). Quando si verifica la riperfusione, si verificano diversi processi: l'ossigeno viene ripristinato, permettendo alla catena respiratoria di produrre di nuovo ATP insieme a ROS e radicali liberi, e i mitocondri captano il Ca2+citosolico che è stato accumulato nella cellula durante ischemia (Halestrap et al 2010). Entrambi questi eventi inducono l'apertura del poro transitorio di permeabilità della membrana mitocondriale (MPTP), portando alla morte delle cellule (Fig.24).

Figura 24. Processi cellulari che portano all'apertura del poro transitorio di permeabilità della