Protocolli sperimentali

Terminato l'allestimento dell'organo è seguito un periodo di stabilizzazione di 30 minuti durante il quale il cuore è stato perfuso solo da soluzione di Krebs. Quando il perfusato ha raggiunto un flusso costante, espresso il ml/min, si è proceduto con l'esperimento seguendo il protocollo di interesse. Le sostante studiate sono state somministrate in perfusione tramite medicazione della soluzione di Krebs. Durante tutto l'esperimento il perfusato è stato raccolto ogni 5 minuti, per un totale di 20 minuti di raccolta ed i valori dei parametri cardiaci, RPP% e dp/dt%, sono stati registrati ad ogni trattamento farmacologico. Quando la procedura lo richiedeva sono state realizzate delle curve concentrazione/risposta della sostanza in esame. Alla fine il cuore è stato accuratamente toelettato, asciugato e pesato.

60 3.3.6 Analisi dei dati

Il flusso coronarico (CF), calcolato come ml/min/mg, il prodotto tra HR e LVDP (RPP mmHg) e la performace cardiaca (dP/dt mmHg/s), registrati alla fine della stabilizzazione, sono stati presi come valori basali. Cambiamenti di questi parametri cardiaci in conseguenza del trattamento farmacologico, sono stati espressi in percentuale rispetto ai valori basali. I dati sono stati espressi come mean ± SEM. Le analisi statistiche sono state effettuate da t test Student. P˂0,05 è stato preso in considerazione come indicatore di differenza significativa.

61

4.Risultati e discussione

Il pathway di H2S è essenziale nella regolazione dell'omeostasi del sistema

cardiovascolare, infatti la diminuzione dei livelli di H2S nel sangue sono collegati a molte

patologie cardiovascolari come l'ipertensione, l'aterosclerosi e l'insufficienza cardiaca e anche a diverse coronaropatie come la cardiopatia ischemica e l'infarto del miocardio (Bucci and Cirino 2011; Yang and Wang 2015). Su queste basi si è concentrata la ricerca di molecole capaci di donare H2S, in modo da ripristinare i livelli fisiologici endogeni di

questo gas trasmettitore. NaHS è il sale che dona H2S più usato a scopi sperimentali, ma

non può essere utilizzato in clinica poiché si trasforma rapidamente in H2S raggiungendo

rapidamente alte concentrazioni di picco, che causano effetti avversi come l'abbassamento acuto ed eccessivo della pressione sanguigna. Inoltre presenta una bassissima emivita, dovuta alla rapida eliminazione del gas, che non permette di simulare le condizioni fisiologiche dell'organismo, in cui H2S è presente in concentrazioni

dell'ordine del micromolare pressoché costanti (Li et al 2009). In clinica i donatori ideali di H2S, sarebbero quelli che rilasciano il gas a concentrazioni basse, in modo lento e

continuo, simulando le condizioni fisiologiche (Caliendo et al 2010). A tal proposito, GYY4137 è un donatore di H2S di origine sintetica capace di rilasciare il gas in maniera

lenta e continua, evitando quindi picchi di concentrazioni elevate che causano molti effetti avversi, tipici dei sali come NaHS (Li et al 2008). Dunque questa tesi si è dedicata alla valutazione di nuove molecole, naturali e sintetiche, allo scopo di individuare composti interessanti da testare sul modello sperimentale di cuore isolato e perfuso secondo metodica Langendorff, in modo da valutarne gli effetti sulla funzionalità cardiaca complessiva ed, in particolare, sul flusso coronarico.

Nonostante NaHS non abbia i requisiti di un ideale H2S-donor, rappresenta il composto di

riferimento utilizzato nei vari studi presenti in letteratura ed è quello scelto da noi, come composto standard per trovare le condizioni sperimentali idonee. Sul flusso coronarico basale NaHS, somministrato in concentrazioni nel range di 1μM-100μM, è in grado di produrre una dilatazione coronarica crescente all'aumentare della e che noi registriamo come aumento del flusso coronarico.

62

In particolare la concentrazione 100μM produce un incremento significativo rispetto al valore basale (137±16 %).

Per quanto riguarda l'analisi dei parametri funzionali RPP, che indica la forza di contrazione miocardica, e dP/dt, indicatore della contrattilità cardiaca, il trattamento con NaHS determina un chiaro miglioramento, concentrazione-dipendente, di entrambi i parametri che probabilmente riflettono la dilatazione coronarica registrata con NaHS (Fig.35)

Un'altra condizione sperimentale valutata è l'effetto di NaHS su vasospasmo indotto dalla somministrazione di una concentrazione massimale di angiotensina II (Ang II) 0,1μM. In queste condizioni sperimentali la perfusione del cuore con Ang II produce, come riportato dalla letteratura, una significativa riduzione del flusso coronarico (82±7 %) rispetto al basale.

Figura 35. Il grafico mostra gli effetti di NaHS sui tre paramentri cardiaci CF, RPP, dP/dt. I valori sono

espressi in percentuale rispetto al basale. Il singolo asterisco indica *p<0,05 rispetto ai valori basali.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100±1 100±1 100±1 1μM 99±1 99±4 95±3 10μM 110±4 115±25 106±16 30μM 121±7 127±33 112±19 100μM 137±16 115±31 99±16

63

La somministrazione di NaHS nello stesso range di concentrazioni testate sul flusso coronarico basale, ha determinato un incremento concentrazione-dipendente del flusso coronarico più marcato, che ha raggiunto alla concentrazione di 100μM il valore di (165±38 %). Questi risultati sono perfettamente in linea con quelli precedentemente ottenuti in altri studi da Testai et al 2015. In dette condizioni sperimentali, NaHS produce un miglioramento concentrazione-dipendenza dei valori di RPP e dP/dt che, nell'insieme, sono sovrapponibili a quelli osservati con NaHS in condizioni basali (Fig36).

Figura 36. Il grafico mostra gli effetti di NaHS sui tre parametri cardiaci CF, RPP,dP/dt, somministrato su

vasospasmo da angiotensina. Il doppio asterisco indica un ** p<0,01, e il triplo asterisco indica un

***p<0,001 rispetto ai valori basali. il simbolo § indica un p<0,05, il simbolo §§ indica un p<0,01 e il simbolo §§§ indica un p<0,001, ripetto ai valori di angiotensina.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100±1 100±1 100±1 AngII 0,1μM 82±7 86±3 87±1 NaHS 1μM 78±6 85±2 80±4 NaHS 10μM 117±10 113±16 92±1 NaHS 30μM 126±12 121±22 97±3 NaHS 100μM 165±38 127±5 100±15

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Questi risultati confermano la validità del modello sperimentale per lo studio di donatori di H2S sul flusso coronarico; tuttavia visti i risultati ottenuti, sembra essere più opportuno

testare molecole H2S-donors sul modello di vasospasmo coronarico, in linea con quanto

riportato per altri modelli sperimentali vascolari.

Un nucleo originale interessante come donatore di H2S, è rappresentato dal nucleo

tioureidico; a nostra conoscenza, non sono presenti riferimenti in letteratura di donazione di H2S da parte di questo gruppo funzionale. Studi condotti con metodo amperometrico,

hanno permesso di osservare che sia il composto N-Feniltiourea che il composto N,N- Difeniltiourea, sono in grado di liberare H2S, in presenza ed in assenza di tioli organici (L-

Cisteina 4mM). Inoltre è possibile affermare che tra i due composti il derivato N-

Feniltioureidico, è in grado di rilasciare H2S in modo più significativo e marcato rispetto al

derivato N,N-Feniltioureidico (Fig.37).

Composti 1mM CmaxH2S(μM)+Cys 4mM CmaxH2S(μM) -Cys 4mM

N,N-Difeniltiourea 3,0 ± 0,3 2,6 ± 0,5

N-Feniltiourea 8,0 ± 1,0 6,2 ± 0,8

Figura 37. Il grafico mostra il rilascio di H2S da parte della N,N-difeniltiourea 1mM e della N-feniltiourea

1mM in assenza ed in presenza di cisteina. Il doppio asterisco ** indica un p<0,01 relativo ai valori di concentrazione massima di H2S rilasciata dalle due tiouree in presenza di cisteina.

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Questa differenza è probabilmente causata dal diverso bilancio idrofilo/lipofilo delle molecole. Infatti la N-Feniltiourea è più idrofila rispetto alla N,N'-Difeniltiourea e questo potrebbe facilitare il rilascio di H2S, in soluzione acquosa, della molecola più idrofila.

Questi due composti sono stati successivamente testati su cuori di ratto isolati e perfusi con metodica Langendorff ed è stato osservato che la N-Feniltiourea, somministrata nel range (1μM-100μM), non produce nessun effetto significativo sul flusso coronarico e questo dato si riflette anche sui parametri di funzionalità cardiaca (Fig.38).

Figura 38. Il grafico mostra gli effetti della N-Feniltiourea sui tre parametri cardiaci CF, RPP, dP/dt,

somministrata su vasospasmo da angiotensina II. Il singolo asterisco *p<0,05 rispetto ai valori basali.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basal 100,0 ± 1,0 100,0 ± 1,0 100,0 ± 1,0 AngII 0,1μM 80,0 ± 5,0 83,0 ± 7,0 85,0 ± 3,0 NPhTU 1μM 76,0 ± 7,0 77,0 ± 8,0 82,0 ± 3,0 NPhTU 10μM 72,0 ± 10,0 72,0 ± 10,0 79,0 ± 5,0 NPhTU 30μM 68,0 ± 18,0 72,0 ± 15,0 78,0 ± 5,0 NPhTU 100μM 78,0 ± 12,0 87,0 ± 10,0 92,0 ± 4,0

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Invece la N,N-Difeniltiourea, somministrata in perfusione nel range di 0,1μM-100μM, in cuori precedentemente trattati con AngII, è stata in grado di migliorare significativamente il flusso coronarico, riportandolo a valori basali alla concentrazione di 10μM e, con concentrazioni superiori, anche oltre. Tuttavia alla concentrazione di 100μM, probabilmente compaiono dei fenomeni di tossicità, evidenziati da una riduzione del flusso coronarico e sopratutto dei valori di RPP e dP/dt, i quali per concentrazioni inferiori a 100μM, rispecchiavano il miglioramento del flusso coronarico (Fig.39).

Figura 39. Il grafico mostra gli effetti di N,N'-Difeniltiourea sui tre parametri cardiaci CF, RPP,dP/dt

somministrata dopo vasospasmo con angiotensina II. Il doppio asterisco indica un **p<0,01 e il triplo asterisc *** indica un p<0,001, rispetto ai valori basali. Il simbolo § indica un p<0,05,il simbolo §§ indica un p<0,01 e il simbolo §§§ indica un èp<0,001 ripetto ai valori di angiotensina II.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100±1 100±1 100±1 AngII 0,1μM 79±3 85±4 82±4 NNDPhTU 0,1μM 75±4 84±2 79±6 NNDPhTU 1μM 83±5 93±7 87±7 NNDPhTU 3μM 82±5 94±5 86±11 NNDPhTU 10μM 108±9 114±2 102±11 NNDPhTU 30μM 113±11 117±11 103±11 NNDPhTU 100 μM 97±19 93±22 82±18

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Le informazioni attualmente disponibili non permettono di ipotizzare eventuali meccanismi di tossicità legati a questo composto, ma per lo stesso H2S è documentato un

comportamento "ormetico" ovvero, basse concentrazioni del gas-trasmettitore sono in grado di promuovere effetti citoprotettivi, mentre alte concentrazioni promuovono effetti citotossici. Interessante notare che i dati sul rilascio di H2S con metodo amperometrico

non riflettono i dati relativi al flusso coronarico, probabilmente a causa della diversa lipofilicità dei due composti. Infatti la N,N-difeniltiourea, presentando i due sostituenti fenilici ed essendo quindi più lipofila rispetto alla N-feniltiourea, probabilmente entra meglio nella cellula espletando un migliore effetto sul modello di valutazione del flusso coronarico.

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Un'altra classe di composti che potenzialmente possono donare H2S sono gli isotiocianati,

presenti abbondantemente nei vegetali appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae. Il nucleo isotiocianato non è un gruppo originale, in quanto precedenti pubblicazioni hanno già riportato caratteristiche di H2S-donors, da parte di molecole contenenti questo gruppo

funzionale (Citi et al 2014 ; Martelli et al 2014; Testai et al 2016; Di Cesare Mannelli et al 2017); tuttavia non sono presenti studi relativi all'efficacia sul circolo coronarico da parte di questi composti. Uno dei composti testati come donatori di H2S, contenente il gruppo

isotiocianato, è l'allilisotiocianato, presente in abbondanza nella senape nera (Brassica nigra, Brassicaceae). Questa sostanza presenta un profilo molto interessante in quanto, a differenza dei derivati tioureidici, il rilascio di avviene H2S esclusivamente in presenza di

tioli organici, producendo una concentrazione di H2S di 5,11 ± 1,0 μM (Fig.40).

Figura 40. Il grafico mostra il rilascio di H2S da parte di allilisotiocianato 1mM in presenza ed in assenza di

cisteina. Il triplo asterisco *** indica un p<0,001, rispetto ai valori di concentrazione massima rilasciata dal composto in presenza ed in assenza di cisteina.

Composto 1mM Cmax H2S (μM) + Cys 4mM Cmax H2S (μM) - Cys 4mM

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Sul circolo coronarico, sotto vasospasmo da AngII, la perfusione con allilisotiocianato nel range di 0,1μM-100μM, determina un miglioramento del flusso coronarico, riportandolo a valori basali già alla concentrazione di 30μM (102,0±4,0 %). Anche i parametri funzionali RPP e dP/dt migliorano, ed in particolare alla concentrazione di 30μM sia RPP che dP/dt risultano essere più elevati rispetto ai valori basali, rispettivamente (117±12 %) e (110±12 %) (Fig. 41).

Figura 41.Il grafico mostra gli effetti di allilisotiocianato sui tre parametri cardiaci CF, RPP, dP/dt,

somministrato dopo vasospasmo da angiotensina II. Il singolo asterisco indica un * p<0,05 il triplo aterisco *** indica un p<0,01 rispetto ai valori basali. Il simbolo § indica un p<0,05, il simbolo §§ indica un p<0,01 ripetto ai valori di angiotensina II.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100±1 100±1 100±1 AngII 0,1μM 69±3 87±4 87±4 Allil-NCS 1μM 71±2 90±8 88±6 Allil-NCS 3μM 81±9 118±20 107±11 Allil-NCS 10μM 90±6 112±17 107±13 Allil-NCS 30μM 102±4 117±12 110±12 Allil-NCS 100μM 100±6 89±9 85±10

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Tra le sostanze H2S-donors di origine naturale, erucina e sulforafano sono altri due

isotiocianati presenti in molte piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae, sottoforma rispettivamente di glucoerucina e glucorafanina. L'instituto CREA di Bologna ha fornito un estratto di Eruca Sativa Mill., ottenuto per macinazione di semi disoleati di Eruca Sativa Mill., costituito da entrambi i glucosinolati nel rapporto di 380±12 μmol/g di glucoerucina e 20±1 μmol/g di estratto di glucorafanina. Tale estratto è risultato capace di rilasciare concentrazioni apprezzabili di H2S, sia in presenza di cisteina 4mM (1,69± 0,41

μM) sia in assenza di cisteina (1,48±0,22μM) (Fig.42).

Figura 42. Il grafico mostra il rilascio di H2S da parte di Eruca Sativa Mill., in assenza ed in presenza di

cisteina.

Composti 0,4mM CmaxH2S(μm) + Cys 4mM

CmaxH2S(μM) – Cys

4mM

Eruca Sativa Mill. 1,7±0,4 1,5±0,2

Successivamente, è stato misurato il rilascio di H2S da glucoerucina, glucosinolato

caratterizzante l'estratto, fornita dall'istituto CREA di Bologna. Dall'analisi amperomentrica è emerso che il composto naturale in esame rilascia solfuro di idrogeno sia in presenza sia in assenza di cisteina, seppur raggiungendo concentrazioni di H2S

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Figura 43. Il grafico mostra il rilascio di H2S da parte della glucoerucina, in assenza ed in presenza di cisteina.

Un ulteriore approfondimento amperometrico è stato effettuato utilizzando l'isotiocianato erucina, corrispondente aglicone di glucoerucina. A differenza dell'estratto e di glucoerucina, i quali mostrano un profilo H2S donor cisteina-indipendente, erucina è

capace di rilasciare H2S in maniera solamente in presenza di cisteina (concentrazione H2S

raggiunta 2,02 ± 0,15μM), come già osservato per allilisotiocianato. Un tale profilo tiolo- dipendente, può essere vantaggioso per quanto riguarda la stabilità del composto, in quanto sarà capace di donare H2S solo in presenza di substrati organici (Fig.44).

Composti 1mM Cmax H2S (μM) + Cys 4mM Cmax H2S (μM) - Cys 4mM

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Figura 44. Il grafico mostra il rilascio di H2S da parte di Erucina , in assenza ed in presenza di cisteina. Il triplo

asterisco ***p<0,001 rispetto ai valori di concentrazione massima di H2S rilasciata dal composto in assenza

ed in presenza di cisteina.

Composto 1mM Cmax H2S (μM) + Cys 4mM Cmax H2S (μM) -Cys 4mM

Erucina 2,0±0,2 0,6±0,2

Erucina, somministrata in perfusione su cuori isolati e perfusi secondo metodica Langendorff nel range di 0,01μM-100μM, ha prodotto un incremento concentrazione- dipendente del flusso coronarico, riportandolo a valori basali alla concentrazione di 100μM (110 ± 15 %). Gli altri parametri funzionali riflettono gli effetti che si osservano per il flusso coronarico, ovvero un incremento concentrazione-dipendente sia della forza di contrazione che della performance cardiaca (Fig.45).

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Figura 45.Il grafico mostra gli effetti di Erucina sui tre parametri cardiaci CF, RPP, dP/dt, dopo vasospasmo da angiotensina. Il doppio asterisco indica un **p<0,01 rispetto ai valori basali. Il simbolo § indica un p<0,05 rispetto ai valori di angiotensina II.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100±1 100±1 100±1 AngII 0,1μM 82±3 98±5 90±4 Erucina 0,01μM 80±3 98±8 93±7 Erucina 0,1μM 77±4 102±9 97±9 Erucina 1μM 81±4 106±8 101±8 Erucina 10μM 90±7 111±15 105±13 Erucina 100μM 110±15 124±19 119±16

Per erucina, abbiamo voluto caratterizzare meglio gli effetti vasoattivi e valutare in modo particolare il contributo della funzione endoteliale. È infatti nota l'esistenza di uno stretto cross-talk vascolare tra i due principali gas-trasmettitori H2S e NO. Diversi studi hanno

dimostrato che H2S è in grado di regolare sia la produzione endogena che il catabolismo di

NO. La perfusione del cuore con L-NAME (inibitore della biosintesi di NO) ha prodotto un dimezzamento del flusso coronarico basale (64 ± 7%), come già atteso dai dati presenti in letteratura.

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La successiva somministrazione in perfusione di angiotensina II, riduce ulteriormente il flusso coronarico a valori di (57±4)% rispetto al basale. La successiva somministrazione di erucina (0,1μM-100μM), produce un significativo incremento concentrazione-dipendente dei valori del flusso coronarico, che alla concentrazione di 100μM arriva al valore di (82 ± 5 %); corrispondente ad un incremento di circa il 30%, rispetto al vasospasmo con Ang II (Fig.46).

Figura 46. Il grafico mostra gli effetti di Erucina sui tre parametri cardiaci CF, RPP,dP/dt, dopo

somministrazione di L-NAME e successivamente di angiotensina II. Il singolo asterisco *p<0,05 e il doppio asterisco **p<0,01 rispetto ai valori basali. Il simbolo § indica un p<0,05 rispetto ai valori di angiotensina II.

Composti CF% RPP% dP/dt% Basale 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 L-NAME 100μM 64,0 ± 7,0 70,0 ± 6,0 75,0 ± 1,0 AngII 0,1μM 57,0 ± 4,0 72,0 ± 6,0 72,0 ± 3,0 Erucina 0,1μM 54,0 ± 8,0 77,0 ± 9,0 75,0 ± 3,0 Erucina 1μM 53,0 ± 9,0 79,0 ± 13,0 77,0 ± 5,0 Erucina 10μM 62,0 ± 9,0 90,0 ± 14,0 83,0 ± 4,0 Erucina 100μM 82,0 ± 5,0 108,0 ± 3,0 96,0 ± 2,0

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Tale incremento è sovrapponibile a quello osservato in assenza del trattamento con L- NAME (Fig.45) e questo dato ottenuto suggerisce che gli effetti vasoattivi di erucina, in queste condizioni sperimentali, sono indipendenti dal reclutamento dell'NO endogeno. In conclusione questa tesi sperimentale ha contribuito alla caratterizzazione di quattro nuovi donatori di H2S, risultati attivi sul circolo coronarico e quindi potenzialmente interessanti

come coronarodilatatori. Studi futuri permetteranno di approfondire ulteriormente il loro meccanismo d'azione, per comprendere il reale valore traslazionale di queste molecole.

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