Screening fitochimico del Citrus medica L cv Diamante (Cedro)
4.6. Dosaggio quantitativo di principi attivi del Cedro 1 Dosaggio dei polifenoli total
Il contenuto in polifenoli totali degli estratti ottenuti dalle differenti porzioni (epicarpo, mesocarpo, endocarpo, fiori, foglie) dei frutti di Cedro maturi e immaturi è stato valutato utilizzando il metodo di Folin-Ciocalteau (Gao et al., 2000).
Il saggio consiste nell’aggiungere 200 µl del reattivo di Folin-Ciocalteau e 2 ml di acqua a 100 µl dell’estratto da analizzare. Dopo 8 min e 30 sec si aggiunge 1 ml di Na2CO3 al 15% e si misura l’assorbanza a 765 nm (spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 40 UV/VIS) dopo aver lasciato il campione per 2 ore a temperatura ambiente.
Nel saggio è stato utilizzato acido clorogenico come standard e i risultati sono stati determinati in triplicato.
Il contenuto in polifenoli totali è stato espresso alla fine come equivalenti di acido clorogenico in mg per 100 g di pianta fresca (FW).
4.6.2. Dosaggio dei flavonoidi totali
Il contenuto in flavonoidi totali è stato valutato usando un metodo basato sulla formazione di un complesso flavonoide-alluminio (Yoo et al., 2008).
115 Il test prevede l’addizione di un millilitro di estratto o delle soluzioni standard di quercetina in una provetta contenente 5 ml di acqua distillata. In seguito si aggiungono 0.3 ml di una soluzione al 5% (w/v) di nitrito di sodio. Dopo 5 min si aggiungono 0.6 ml di una soluzione al 10% (w/v) di AlCl3 e, dopo altri 6 min, 2 ml di idrossido di sodio 1 M e 2.1 ml di acqua distillata.
L’assorbanza è letta a 510 nm (spettrofotometro Perkin Elmer Lambda 40 UV/VIS). Nel saggio è stato utilizzato il flavonoide quercetina come standard e i risultati sono stati determinati in triplicato. I dati sono stati espressi come milligrammi di quercetina equivalenti (QE)/100 g di pianta fresca (FW).
4.6.3. Dosaggio quantitativo e caratterizzazione dei flavonoidi del Cedro
Il contenuto in principi attivi di una pianta, sia essa medicinale, officinale o destinata all’alimentazione, non è costante ma soggetto a continue variazioni in rapporto a molteplici fattori, sia ambientali sia propri dell’organismo produttore della droga. Tale variabilità costituisce un elemento fondamentale per la valutazione della capacità della pianta stessa di adattarsi all’ambiente naturale che la ospita.
Il presente lavoro di tesi ha inteso sottoporre a studio le differenti componenti dei frutti di Cedro (epicarpo, mesocarpo ed endocarpo), nonché fiori, foglie e semi, al fine di determinare la variabilità del contenuto fitochimico, in relazione alle altre parti del frutto e a eventuali processi biosintetici.
In particolare, l’obiettivo della prima parte del lavoro sperimentale è stato quello di raccogliere campioni di Cedro e mettere in relazione la variabilità quantitativa di alcuni costituenti dell’estratto, scelti da noi come markers fitochimici, con la differente influenza data alla composizione stessa dell’estratto dall’ambiente naturale di provenienza.
I markers fitochimici scelti sono: naringenina, naringina, esperetina, esperidina, rutina, nobiletina, tangeretina, quercetina, diosmina e apigenina (Fig. 4.4).
Questi appartengono alla classe chimica dei flavonoidi, metaboliti secondari da considerarsi tra i componenti più significativi per abbondanza ed attività di piante del genere Citrus, come il Cedro.
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Figura 4.4. Struttura chimica dei flavonoidi scelti come markers fitochimici.
La determinazione quantitativa dei suddetti flavonoidi negli estratti di Cedro è stata realizzata mediante HPLC con la tecnica dello standard esterno, previa purificazione di tutti gli estratti mediante estrazione in fase solida (SPE).
Tale estrazione ha previsto l’impiego di un “SPE 12-Position Vacuum Manifold Set”, con un vuoto di esercizio pari a 15 mmHg e fasi solide Phenomenex del tipo strata-X (33 µm) a fase inversa, con un gruppo funzionale del tipo riportato in Fig. 4.5.
O RO OH O R1 OR2 O HO OH O OH OH O RO OH O R Flavanoni Naringina: R= neoesperidosio, R1= R2= H
Esperidina: R= rutinosio, R1= OH, R2= Me
Naringenina: R= R1= R2= H Esperetina: R= H, R1= OH, R2= Me Flavoni Apigenina: R= R1= R2= H Diosmina: R= Rutinosio, R1= CH3, R2= OH Flavonoli Rutina: R= O-rutinosio Quercetina: R= OH O MeO OMe O R1 OMe MeO R2 R Flavoni polimetossilati Nobiletina: R=R1= OMe, R2= H Tangeretina: R= OMe, R1=R2= H R2 OR1
117 Il protocollo sperimentale sviluppato è il seguente:
1) “Condition”: 200 mg del campione sono pesati e portati a volume (12 ml) con acqua distillata;
2) “Equilibrate”: la SPE è lavata con 20 ml di metanolo e portata a condizioni ottimali facendo eluire una soluzione di metanolo al 5% per un volume totale di 24 ml; 3) “Load”: l’estratto è caricato e fatto eluire in modo completo sulla SPE;
4) “Wash”: la SPE è lavata con 20 ml di una soluzione di metanolo al 5% per un volume totale di 24 ml per eliminare le impurezze;
5) “Elute”: dopo un tempo di latenza di circa 3 minuti, 10 ml di metanolo sono fatti eluire attraverso la SPE per l’ottenimento della frazione contenente i principi attivi desiderati (flavonoidi).
Figura 4.5. SPE Phenomenex: strata-X.
Le frazioni purificate di ogni estratto di Cedro sono state, quindi, sottoposte ad analisi quantitativa mediante HPLC (High Performance Liquid Chromatography), modello HP 1100, equipaggiato con pompa quaternaria, rivelatore UV-visibile con lunghezza d’onda a 280 nm e colonna Phenomenex Luna 5 µm C18,250 x 4.60 mm. La fase mobile è costituita da una miscela di acqua/acido formico (0.1%) (A) e metanolo (B) con un flusso di 1 ml/min.
Le analisi sono realizzate con una programmata suddivisa in quattro “step”: 100% di A per 2 min; 80% di A per 8 min; 100% di B per 55 min; 100% di A per 65 min.
La colonna è mantenuta alla temperatura di 40 °C e l’eluente è monitorato con un detector UV alla lunghezza d’onda di 280 nm.
118 I flavonoidi sono identificati confrontando i loro tempi di ritenzione e i relativi spettri nell’ultravioletto con quelli di standards puri, acquistati dalla Sigma-Aldrich (Milano, Italia). Tutte le determinazioni sono realizzate in triplicato e sottoposte a media statistica.
4.6.4. Analisi quantitativa dell’olio essenziale di Cedro
La separazione dei composti attraverso la gas cromatografia (GC), oltre a fornire un ottimo materiale da sottoporre alla spettrometria di massa per l’identificazione dei composti, consente la determinazione quantitativa attraverso il confronto cromatografico con uno standard interno o esterno.
La determinazione quantitativa dei componenti dell’olio essenziale dell’epicarpo e delle foglie di Cedro è stata condotta utilizzando un gas cromatografo Shimazdu, modello GC 17, dotato di un detector FID ed una colonna capillare 30 m x 0.25 mm, controllata da uno specifico software (Borwin versione 1.22, JMBS Developments, Grenoble, Francia). Le analisi sono state realizzate con la seguente programmata di temperatura: isoterma a 50 °C per cinque minuti, aumento graduale della temperatura di 16 °C al minuto da 50 °C a 250 °C, infine isoterma a 250 °C per 10 minuti. Come gas di trasporto è stato utilizzato l’azoto. L’iniettore e il detector sono stati mantenuti rispettivamente a 250 °C e 280 °C. Le percentuali relative dei componenti l’olio essenziale sono state calcolate sulla base delle aree dei picchi in GC.
La gas cromatografia (GC) è una tecnica analitica che è stata intensamente studiata e impiegata da più di 40 anni per risolvere un’ampia varietà di problemi analitici. Come risultato, sono state trovate le condizioni per separare virtualmente tutte le classi di composti per le quali essa è adatta. Sulla base di questa conoscenza, gli sforzi per lo sviluppo della tecnica proseguono con lo scopo di ottimizzare analisi specifiche.
La cromatografia gas-liquido (GLC) è ritenuto il metodo migliore per analizzare in modo rapido una serie di composti che risultano essere molto volatili. Essa si basa sulla ripartizione dei componenti tra una fase mobile gassosa e una fase stazionaria liquida costituita da uno strato superficiale su un mezzo di supporto solido.
Per il normale lavoro analitico si adopera una colonna riempita con il supporto di fase stazionaria.
119 I componenti della miscela sono trasportati lungo la colonna, si separano in conformità al loro coefficiente di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria e fuoriescono dalla colonna per entrare in un sistema di rilevazione collegato all’uscita della colonna stessa. Il segnale del rivelatore è amplificato e inviato alla penna di un registratore (Vogel et al., 1988). La composizione qualitativa della miscela è determinata esaminando il grafico ottenuto con questa procedura. La temperatura della colonna deve essere sufficientemente alta, in modo che ogni soluto possieda una tensione di vapore abbastanza elevata e, quindi, venga fluito in un tempo ragionevole. Il rivelatore è mantenuto a una temperatura più alta rispetto a quella della colonna per garantire che ogni soluto si presenti in fase gassosa.
Nel caso di un liquido, le dimensioni del campione iniettato sono di 0.1-2 µl per una cromatografia analitica, ma possono raggiungere i 20-1000 µl in una cromatografia preparativa. Per campioni gassosi, i volumi dell’ordine di 0.5-10 ml vengono iniettati utilizzando una siringa a tenuta di gas o una valvola di campionamento.