Dopo 4 desaturazioni si forma il pigmento rosso licopene, mentre prima si formano fitofluene (incolore), ζ-carotene (giallo) e
1.4.5. Effetti della radiazione UV-B nelle piante La radiazione UV-B (280-320 nm), pur essendo una componente
minore dello spettro solare, attraverso un complesso sistema di trasduzione del segnale, è in grado di regolare diversi aspetti della fisiologia delle piante, controllare la foto morfogenesi e promuovere risposte di protezione all’UV-B stesso (Frohnmeyer e Staiger, 2003; Casati e Walbot, 2004; Ulm e Nagy, 2005; Jenkins e Brown, 2007; Brown et al., 2009; Favory et al., 2009; Gruber et al., 2010; Rizzini et al., 2011), tra cui la stimolazione dell’espressione di geni codificanti per enzimi coinvolti nella biosintesi di flavonoidi e di altri composti fenolici che, accumulandosi negli strati epidermici della pianta, la proteggono dagli effetti dannosi degli UV-B mediante l’assorbimento della radiazione stessa (Hahlbrock et al., 1989; Li et al., 1993; Jenkins et al., 2001; Calvenzani et al., 2010).
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Queste risposte sembrano essere collegate a diverse molecole segnale che modificano la loro concentrazione in seguito all’esposizione ai raggi UV-B. Questi composti comprendono le specie reattive dell’ossigeno (ROS), sistemi Ca2+/Calmodulina, ossidi nitrici, fosforilazioni reversibili di proteine e diversi ormoni vegetali (Frohnmeyer e Staiger, 2003; Brosché e Strid, 2003).
In letteratura scientifica vengono riportati molti studi sugli effetti dannosi dei raggi UV-B verso le cellule vegetali, infatti prolungate esposizioni a questo tipo di radiazioni portano a danni del DNA con la formazione di dimeri di pirimidina simili al ciclobutano (CPD) e il dimero pirimidina (6,4) piramidone; gli UV-B inducono legami tra DNA e proteine, rotture di filamenti di DNA, delezioni, inserzioni e replicazioni di paia di basi; tutti questi cambiamenti causano mutazioni dannose nella pianta (Liu et al., 2011).
La riduzione di alcuni fattori di trascrizione porta alla diminuzione della disponibilità di proteine per importanti processi biosintetici, come una diminuita trascrizione della subunità minore della Rubisco, con conseguente riduzione del potere carbossilante e successiva fotoinibizione dovuta all’eccesso di energia assorbita rispetto alla quantità di energia assimilata (Xue et al., 2005). E’ stata inoltre osservata un’inibizione del ciclo delle xantofille sia in cloroplasti isolati che in foglie integre irradiate con luce UV-B, con conseguente diminuzione della dissipazione termica dell’energia non utilizzata fotochimicamente (Santocono et al., 2006).
I danni alle membrane causati dagli UV-B si riflettono sul processo di trasporto degli elettroni nella catena fotosintetica, sulle ATP-Asi e sull’attività fotosintetica. I pigmenti fotosintetici possono infatti essere degradati dalla radiazione UV-B con perdita della loro capacità; le clorofille, ed in particolare la clorofilla b, sono i pigmenti maggiormente colpiti (Van Rensen J.J. et al., 2007).
Gli UV-B sembrano esercitare effetti anche sulla struttura delle membrane tilacoidali incrementandone la permeabilità ionica. Gli UV-B inducono anche una perdita di K+, responsabile della conduzione stomatica in piante irradiate. Le conseguenze degli UV- B sull’apparato fotosintetico comprendono effetti negativi a carico del PSII e, in misura minore, del PSI, una diminuzione dell’attività della Rubisco, una diminuzione nella capacità di fissazione della CO2, anche a causa dell’induzione della chiusura degli stomi, una riduzione del contenuto di amido e della biomassa (Kovács E. e Keresztes A., 2002).
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Gli UV-B sono in grado di inibire il ciclo di foto-fosforilazione mediato dal PSI ma esercitano il loro effetto negativo soprattutto a livello del PSII, in particolare delle proteine D1 e D2 (Viczián A. et al., 2000).
Come già accennato, l’attività della Rubisco può diminuire in presenza di alti livelli di radiazione UV-B. Tale disattivazione, che può essere dovuta alla modificazione della catena peptidica della proteina e/o ad una diminuita trascrizione del gene è causa a sua volta di una ridotta assimilazione della CO2 sia per un effetto diretto sia perchè la diminuzione dell’attività della Rubisco determina una diminuzione dell’attività degli enzimi del ciclo di Calvin (He J.M. et al., 2004).
Le radiazioni di UV-B non sono solo sinonimo di danni cellulari, studi recenti dimostrano che la sua azione è dose-dipendente, ovvero in elevate quantità apportano alterazioni negative a livello cellulare ma in quantità moderate e ben calibrate posso apportare effetti positivi sia a livello fisiologico che di stimolazione del metabolismo secondario (Jansen et al., 2008; Schreiner et al., 2009).
Comunque la dose che viene percepita realmente dipende da una serie di fattori fra cui determinante è la struttura anatomica dell’organo della pianta colpita dalla radiazione. Infatti per indurre cambiamenti metabolici, è richiesta un’applicazione di UV-B a dosi più elevate (20-40 kJ m-2 d-1) (Schreiner et al., 2009) in quegli organi caratterizzati dalla forma sferica con una piccola superficie paragonata al volume, tipica della maggior parte dei frutti, come dimostrato in pomodoro (Liu et al., 2011) e in limone (Interdonato et al., 2010), rispetto ad organi caratterizzati da una superficie estesa, quali le infiorescenze dei broccoli (Huyskens-Keil et al., 2010) e le foglie e le infiorescenze del nasturzio, per i quali l’incremento di metaboliti secondari è già ottenuto a basse dosi di UV-B (0,54 kJ m-2 d-1) (Schreiner et al., 2009).
Un altro fattore importante da cui dipende la risposta alla radiazione è lo stadio di sviluppo. Gli organi giovani reagiscono infatti in maniera differente rispetto a quelli pienamente sviluppati, con la sensibilità alla radiazione che sembra aumentare al progredire dello sviluppo fisiologico (Schreiner et al., 2009; Huyskens-Keil et al., 2010).
Le diverse classi di composti fenolici presentano peculiari caratteristiche di assorbimento nella regione UV. Per esempio, i
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derivati degli acidi idrossicinnamici assorbono nella regione 290- 330 nm, i flavoni e flavonoli presentano un picco di assorbimento a 250 e 350 nm, i calconi e gli auroni a 350 nm e un minore assorbimento a 250 nm, gli acidi fenolici a 250-290 nm, mentre le antocianine oltre all’assorbimento nel visibile presentano un piccolo assorbimento a circa 270-275 nm (Lattanzio et al., 2008). In virtù delle caratteristiche mostrate da molti dei flavonoidi caratterizzati dall’assorbimento nella regione dell’UV-B, si è ritenuto che questa classe di pigmenti potesse svolgere il compito, tra gli altri, di schermatura UV-B (Li et al., 1993; Jin et al., 2000; Winkel-Shirley, 2001) e, pertanto, che a loro volta fossero indotti nella propria biosintesi da questa radiazione. Differenti autori hanno infatti riportato che la radiazione UV-B sia in grado di stimolare la biosintesi dei fenilpropanoidi attraverso il controllo esercitato su alcuni enzimi chiave quali PAL, CHS, CHI, F3H e DFR (Wade et al., 2001; Brosché e Strid, 2003; Ulm e Nagy, 2005; Park et al., 2007). Inoltre è stato riportato che la radiazione UV-B sia capace di determinare, in piante di lattuga, la sovraespressione dei geni che codificano enzimi della sintesi delle antocianine inducendo nelle foglie una colorazione rossa (Park et al., 2007).
In frutti di pomodoro la radiazione UV-B può rappresentare un importante fattore di regolazione per l’accumulo di flavonoidi (Giuntini et al., 2008; Calvenzani et al., 2010). Quindi la stimolazione sotto UV-B dei metaboliti secondari ed in particolare dei composti fenolici risulta dose e struttura chimica dipendente come riportato sia da Schmidt et al. (2011), che hanno messo in evidenza un accumulo di differenti flavonoli glucosidici e acidi idrossicinnammici in cavolo sotto dosi moderate di tali radiazioni, sia da Neugart et al. (2012), che hanno trovato una risposta agli UV-B dipendente dal tipo di acido idrossicinnamico che acilava il glucoside flavonolico. Anche Harborne e Williams (2000) hanno riportato che il rapporto quercitina/canferolo era più alto in piante esposte all’UV-B coerentemente con l’ipotesi che il flavonolo quercitina presenti una migliore abilità nel contrastare i radicali liberi rispetto al canferolo. In un altro studio eseguito in condizioni di schermatura degli UV-B la concentrazione totale degli acidi idrossicinnamici: caffeico, p-cumarico, e ferulico di frutti di pomodoro era approssimativamente il 20% più bassa quando le piante erano fatte crescere sotto completa esclusione delle radiazioni (Luthria et al., 2006).
Nel nostro laboratorio, già da molti anni, vengono studiati gli effetti della radiazione UV-B sulla sintesi dei flavonoidi durante la
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maturazione di frutti in pre- o in post-raccolta, sia attraverso l’uso di filtri schermanti sia mediante trattamenti di illuminazione specifica con UV-B. La deprivazione degli UV-B veniva realizzata utilizzando tunnel ricoperti da un telo plastico di polietilene stabilizzato con benzofenone, molecola capace di assorbire i raggi UV-B (condizioni di trattamento), mentre le condizioni di controllo erano assicurate da un telo trasparente a tutte le lunghezze d’onda della luce solare. All’interno di tali tunnel sono state fatte crescere piante di varie tipologie di mutanti di pomodoro, fra cui il mutante
hp-1 e i relativi wild type. E varie cultivars commerciali
caratterizzate da bassi e alti livelli di licopene nei frutti (Giuntini et al., 2005, 2008; Calvenzani et al., 2010). Il mutante hp-1 è caratterizzato da una mutazione nelle proteine DDB1a (Liu et al., 2004) e mostra una più elevata pigmentazione rispetto al wild type per quanto riguarda sia l’accumulo dei carotenoidi che dei flavonoidi. Inoltre il fenotipo di questo mutante è risultato praticamente analogo a quello ottenuto mediante sovraespressione del gene del fitocromo A (Boylan e Quail, 1989). La presenza di UV- B nello spettro della luce solare incidente determina una forte stimolazione del processo di accumulo dei flavonoidi nelle bacche del wild type Money maker strettamente dipendente dallo stadio maturativo del frutto.
Lo stadio di bacca verde risulta quello maggiormente sensibile a questa radiazione dal punto di vista della trascrizione genica (Calvenzani et al., 2010) e ciò, nella buccia, si riflette nel maggior contenuto in flavonoidi negli stadi maturativi successivi sia nel
wild type che in hp-1, come anche già osservato in due varietà
ibride commerciali (Giuntini et al., 2008). D’altra parte la riattivazione dei geni strutturali (Calvenzani et al., 2010) che si manifesta all’invaiatura nella buccia del wild type e nei due tessuti di hp-1, in assenza di UV-B, potrebbe essere dovuta ad altri meccanismi regolatori aggiuntivi. A questo riguardo Alba et al. (2000) riportano che l’espressione del gene del fitocromo A (phya) comincia ad essere visibile solo a partire dall’invaiatura facendoci supporre un coinvolgimento di tale fitocromo nella regolazione della via biosintetica dei flavonoidi.
L’influenza della radiazione UV-B sul contenuto di acidi idrossicinnamici, similmente a quanto già riportato per i flavonoidi, risultava essere genotipo-dipendente, con un effetto della schermatura UV-B generalmente negativo nella cultivars Money maker, mentre nel mutante hp-1 si osservavano effetti differenti nei due tessuti esaminati: un aumento nella polpa e variazioni di
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segno positivo o negativo, a seconda dello stadio maturativo considerato, nella buccia (Castagna et al., 2012).
1.4.5.1. Effetti del trattamento con radiazioni UV-B
in post-raccolta sul profilo polifenolico
La radiazione UV, già usata come alternativa alla sterilizzazione chimica al fine di ridurre il numero di microrganismi negli alimenti (Bintsis et al., 2000), è anche in grado di indurre stress nei tessuti e di attivare una serie di meccanismi di difesa che terminano con la produzione di fitoalessine, sostanze di neoformazione prodotte solitamente in risposta ad attacchi di patogeni ed insetti (Kato et al., 1994). L’accumulo di questi composti può essere accompagnato da altre forme inducibili di difesa come la modificazione della parete cellulare e la sintesi di enzimi permettendo un rallentamento del softening della polpa dei frutti (Lamikanra et al., 2005).
Un esperimento di somministrazione giornaliera di radiazione UV-B (1 h al giorno, 6,08 kJ m-2 g-1) a frutti di pomodoro raccolti allo stadio verde o invaiato, protratta fino alla maturazione completa, ha permesso di realizzare, in aggiunta ad un incremento di carotenoidi e acido ascorbico in buccia e polpa della cultivars Money maker (Castagna et al., 2013), una stimolazione dell’accumulo di composti fenolici da parte di queste radiazioni sia nella buccia del mutante hp-1 che della cv Money maker. Tale aumento dipendeva dallo stadio di raccolta del frutto, essendo evidente soltanto nei frutti prelevati allo stadio verde, probabilmente a causa del maggiore periodo di esposizione e, quindi, della maggiore dose di UV-B assorbita, rispetto ai frutti raccolti allo stadio di invaiatura. La dipendenza del trattamento dallo stadio di prelievo, nella buccia di hp-1, si verificava anche nel caso di flavonoidi e flavonoli, mentre i frutti della cultivars Money maker rispondevano positivamente al trattamento con radiazione UV-B anche quando raccolti allo stadio di invaiatura. Un risultato piuttosto interessante è stato l’incremento indotto dal trattamento UV-B nei livelli di flavonoidi e flavonoli in Money maker, e dei soli flavonoli in hp-1, anche a livello di polpa, indipendentemente dallo stadio di raccolta dei frutti. Infatti, sebbene la concentrazione di composti fenolici, similmente a quella dei carotenoidi, risulti
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generalmente superiore nella buccia rispetto alla polpa, considerando il peso relativo dei due comparti ed il fatto che spesso la buccia non viene consumata, l’apporto di composti bioprotettivi da parte della polpa risulta fondamentale. Risultati simili sono stati ottenuti da Liu et al. (2011) esponendo frutti di pomodoro verdi (cultivars Zhenfen 202) ad un trattamento acuto con radiazione UV-B (dosi comprese tra 10 e 80 kJ/m2) e lasciandoli poi maturare al buio. Nonostante il diverso approccio utilizzato, anche questi autori hanno evidenziato un effetto positivo della radiazione UV-B (somministrata alla dose di 20 o 40 kJ/m2) sul contenuto di composti fenolici e flavonoidi, a conferma dell’efficacia di tali radiazioni nel mantenere, o persino nell’aumentare, il potenziale nutraceutico dei frutti di pomodoro durante la conservazione.