Effetti sull’espressione dell’HSP90

Gli studi d’espressione genica tramite ISH sono stati condotti sull’encefalo di Carassius

carassius e Thalassoma pavo con l’intento di valutare le risposte trascrizionali dell’HSP90,

innescate dall’esposizione al metallo ed eventualmente correlabili con le alterazioni comportamentali e con gli effetti neurodegenerativi osservati. A tal fine, ci siamo avvalsi di probes oligonucleotidici opportunamente disegnati sulla base dei partial cds dell’HSP90 disponibili in banca dati per ciascun teleosteo, come descritto nella sezione Materiali e Metodi. Prima, però, di valutare gli effetti trascrizionali indotti dal CuCl2 è stata innanzitutto analizzata, tramite ISH, la distribuzione del trascritto per l’HSP90 nelle

diverse aree encefaliche degli esemplari di Carassius carassius e Thalassoma pavo non sottoposti a trattamento (ctrl). I risultati di tale analisi hanno evidenziato un’espressione eterogenea dell’mRNA per l’HSP90 come è possibile osservare dalle sezioni rappresentative dell’encefalo medio-posteriore di Carassius carassius ibridate con la sonda

antisense (Fig. IV.7A) rispetto al suo sense (Fig. IV.7B). Nell’encefalo di questo teleosteo

sono stati infatti rinvenuti livelli elevati (≥0.5 O.D.) di trascritto in NPGl e nel TLo (Fig. IV.7C). Livelli intermedi di espressione (≤0.50≥0.25 O.D.) caratterizzavano le aree telencefaliche Dm, Dl, Vv, Vl, Vd. Mentre bassi livelli sono stati rilevati in Dd (≤ 0.25 O.D.). Livelli trascrizionali intermedi sono stati inoltre riscontrati in NPGm ed in aree diencefaliche, come NRL, oltre che in OT e nel CCe e VCe.

Fig. IV.7 Distribuzione del trascritto dell’HSP90 in alcune aree encefaliche di Carassius

carassius. Le sezioni trasversali rappresentative dell’encefalo medio-posteriore sono state

sottoposte ad ISH con sonda antisense (A) e sense (B). Scale bar: 0.68 mm. I livelli di trascritto (C) sono stati riportati come valori medi di densità ottica (O.D. ± s.e.m.) nelle diverse aree encefaliche dei pesci ctrl di 5 esperimenti indipendenti. Abbreviazioni: CCe= corpo del cervelletto; CM= corpo mammillare; Dd= nucleo dorsale del telencefalo dorsale; Dl= nucleo laterale del telencefalo; Dm= nucleo mediale del telencefalo dorsale;dorsale; mediale; NDLI= nucleo diffuso del lobo inferiore; NG= nucleo glomeruloso; NPGl= nucleo preglomeruloso laterale; NPGm= nucleo preglomeruloso mediale; OT= tetto ottico; TLo= tori longitudinali; VCe= valvola del cervelletto; Vl= nucleo laterale del telencefalo ventrale; Vv= nucleo ventrale del telencefalo ventrale.

Una distribuzione eterogenea del trascritto è stata rinvenuta anche nell’encefalo di

Thalassoma pavo (Fig. IV.8). Più precisamente, livelli intermedi di espressione

caratterizzavano diversi nuclei come NG, mentre bassi livelli trascrizionali sono stati riportati in Dl.

Fig. IV.8 Distribuzione del trascritto dell’HSP90 nei principali nuclei encefalici di

Thalassoma pavo. Le sezioni trasversali rappresentative dell’encefalo medio-posteriore

sono state sottoposte ad ISH con sonda antisense (A) e sense (B). Scale bar: 0.77 mm. I livelli di trascritto (C) sono stati riportati come valori medi di densità ottica (O.D. ± s.e.m.) nelle diverse aree encefaliche dei pesci ctrl di 5 esperimenti indipendenti. Abbreviazioni: CCe= corpo del cervelletto; CM= corpo mammillare; Dd= nucleo dorsale del telencefalo dorsale; Dl= nucleo laterale del telencefalo; Dm= nucleo mediale del telencefalo dorsale;dorsale; mediale; NDLI= nucleo diffuso del lobo inferiore; NG= nucleo glomeruloso; NPGl= nucleo preglomeruloso laterale; NPGm= nucleo preglomeruloso mediale; OT= tetto ottico; TLo= tori longitudinali; VCe= valvola del cervelletto; Vl= nucleo laterale del telencefalo ventrale; Vv= nucleo ventrale del telencefalo ventrale.

Una volta stabilita la distribuzione eterogenea del trascritto nell’encefalo dei due teleostei, lo studio degli effetti del metallo è proseguito valutando eventuali variazioni nel

concentrazioni di CuCl2. In Carassius carassius la più alta concentrazione di CuCl2, ovvero 1.45 mg/L, è stata responsabile solo di una moderata up-regulation dell’HSP90 in VCe (+31%), mentre moderate riduzioni dell’espressione si sono osservate a livello di alcune aree telencefaliche considerate quali Dm (-52%), Dl (-34%) e Vl (-41%) (Fig. IV.9). Differentemente, la più bassa concentrazione di CuCl2, ovvero 0.30 mg/L, ha promosso un moderato incremento dei livelli di trascritto, a livello del solo nucleo diencefalico NPGm (+34%). Nel resto dei nuclei presi in esame, non sono state apprezzate variazioni trascrizionali significative rispetto ai pesci ctrl.

Fig. IV.9 Espressione dell’HSP90 nelle diverse aree encefaliche di Carassius carassius in seguito a 48h di trattamento con CuCl2. I dati sono riportati come variazione (%) dei livelli di espressione dell’HSP90 dei pesci esposti alle concentrazioni 1.45 mg/L e 0.30 mg/L di metallo, rispetto ai ctrl (*). Analisi statistica: ANOVA seguita dal Newman-Keul’s test quando p<0.05; *p<0.05. Abbreviazioni: CCe: corpo del cervelletto; Dm= nucleo mediale del telencefalo dorsale; Dl= nucleo laterale del telencefalo dorsale; Vl= nucleo laterale del telencefalo ventrale; NDLI= nucleo diffuso del lobo inferiore; NPGm= nucleo preglomeruloso mediale; OT= tetto ottico; TLo: tori longitudinali; VCe= valvola del cervelletto.

Nel caso di Thalassoma pavo è stato possibile, invece, dimostrare che la più alta concentrazione di CuCl2, ovvero 1.07 mg/L, promuoveva un’up-regulation del trascritto a

livello di diversi siti encefalici ed in particolare in Dl (+87%) dove è stato registrato un elevato incremento dei livelli di mRNA dell’HSP90 (Fig. IV.10). A seguito del trattamento con questa concentrazione di contaminante, si è potuto osservare inoltre una moderata up-

regulation in un’altra area telencefalica quale Dm (+56%), a livello mesencefalico in TLo

(+32%) e a livello cerebellare in VCe (+30%) e CCe (+57%). Al contrario, nell’OT (-30%) è stata riportata una moderata riduzione dei livelli di trascritto rispetto ai ctrl.

A livello telencefalico la più bassa concentrazione di CuCl2 ha causato un’up-regulation dell’HSP90, che era elevata in Dm (+68%) e moderata in Dl (+35%), mentre a livello diencefalico ha fatto registrare un moderato incremento trascrizionale in NPGm (+30%). Molto interessante risulta l’effetto in TLo (+72%), più pronunciato rispetto a quello rinvenuto con il trattamento con la più alta concentrazione di Cu2+, durante il quale è stato osservato un elevato incremento della quantità di mRNA rispetto ai ctrl.

Fig. IV.10 Espressione dell’HSP90 nelle diverse aree encefaliche di Thalassoma pavo in seguito a 48h di trattamento con CuCl2. I dati sono riportati come variazione (%) dei livelli di espressione dell’HSP90 dei pesci esposti alle concentrazioni 1.07 mg/L e 0.25 mg/L di metallo, rispetto ai ctrl (*). Analisi statistica: ANOVA seguita dal Newman-Keul’s test quando p<0.05; *p<0.05; **p<0.01. Abbreviazioni: CCe: corpo del cervelletto; Dm= nucleo mediale del telencefalo dorsale; Dl= nucleo laterale del telencefalo dorsale; Vl= nucleo laterale del telencefalo ventrale; NDLI= nucleo diffuso del lobo inferiore; NPGm= nucleo preglomeruloso mediale; OT= tetto ottico; TLo: tori longitudinali; VCe= valvola del cervelletto.