Effetti sulla biosintesi e sull'attività di NO

L'ossido di azoto o ossido nitrico (NO) è una molecola segnale cellulare formata dall'amminoacido L-Arginina, attraverso l'azione di tre differenti isoforme dell'enzima NO- sintetasi (NOS), che funziona sia a livello intracellulare che extracellulare (Figura 12). Per funzionare, questo enzima richiede di cinque cofattori: FMNH2 (mononucleotide flavina ridotta), NADPH, calmodulina, tetraidrobiopterina e due ioni (calcio e ferro dell'eme).

36 Figura 12 - Biosintesi di NO.

Finora sono state identificate tre diverse forme di questo enzima: neuronale (nNOS), inducibile (iNOS) e endoteliale (eNOS) ed altre varianti di queste isoforme. A seconda del tipo di NOS che produce NO, quest'ultimo svolge diverse funzioni nell'organismo: NO derivante da nNOS è prodotto nel sistema nervoso centrale dove gioca il ruolo di immagazzinamento delle informazioni associato con l'apprendimento e la memoria; NO prodotto da iNOS nelle cellule infiammatorie partecipa alle attività antimicrobiche, alla citotossicità e alla risposta infiammatoria; NO prodotto da eNOS nelle cellule endoteliali e nei globuli rossi circolanti è responsabile della regolazione della pressione sanguigna, dell'inibizione piastrinica e degli effetti antiproliferativi sulle cellule muscolari lisce (Reichenbach et al., 2005). Molte cellule e tessuti posseggono una o più isoforme di NOS. I NOS endoteliale e neuronale sono isoforme costitutive e la loro attività è regolata principalmente dal Ca++ e dalla calmodulina, mentre l'isoforma inducibile (iNOS) viene principalmente espressa dopo l'esposizione della cellula alle endotossine batteriche e a molte citochine infiammatorie. NO è un gas altamente lipofilico e diffusibile e per questo permea molto bene nelle membrane biologiche, raggiungendo anche bersagli molecolari al di fuori della cellula e al di fuori dal compartimento dove è stato prodotto, fra cui la guanilciclasi solubile (sGC). Infatti, molti degli effetti fisiologici di NO sono dovuti alla sua abilità di attivare sGC, un enzima citosolico eterodimerico che converte la guanosina trifosfato (GTP) nel secondo messaggero 3',5'-GMP ciclico (cGMP). L'aumento intracellulare di cGMP induce l'attivazione della proteina chinasi G (PKG) che produce la fosforilazione di alcune proteine e conseguentemente molti processi biologici, come ad esempio la regolazione del tono delle cellule muscolari lisce, l'omeostasi di elettroliti e fluidi, l'attivazione di effettori a valle, come ad esempio la PKG e le fosfodiesterasi regolate dal cGMP. Il cGMP è velocemente rimosso dall'azione della fosfodiesterasi 5A (Koesling, 1998). Tuttavia, molti degli effetti citotossici ed infiammatori di NO sono

37 indipendenti dal cGMP e potrebbero risultare dalla sua interazione con ioni metallici, gruppi tiolici ed altri radicali liberi, che mutano il DNA e inibiscono enzimi chiave coinvolti nel metabolismo energetico (Brune et al., 1998). Il NO esercita importanti effetti biologici sulle piastrine, inibendo un ampio range di risposte piastriniche agli stimoli e modulando così la trombosi in vivo. NO inibisce infatti l'attivazione della chinasi fosfoinositide-3 che risulta essere un evento base nel segnale di trasduzione dell'attivazione piastrinica (Pigazzi et al., 1999). Inoltre inibisce l'espressione della proteina attivata IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) sulle membrane piastriniche, rompendo i legami del fibrinogeno, che forma i ponti che permettono l'aggregazione piastrinica (Keh et al., 1996). NO inibisce inoltre la prima fase di attivazione delle piastrine prevenendo l'adesione e la diffusione delle piastrine mediate dal fattore di von Willebrand, attraverso la regolazione di GPIIb/IIIa e l'attivazione della catena leggera della miosina (Roberts et al., 2009). NO ricopre molti altri ruoli e svolge diverse attività nel sistema cardiocircolatorio. Fin dalla scoperta del fattore di rilassamento mediato dall'endotelio (EDRF), successivamente identificato come NO, è divenuto chiaro che NO gioca un ruolo importante nella regolazione del tono vascolare. Inoltre ricopre un ruolo nella prevenzione dell'aterogenesi poiché inibisce l'espressione dipendente dal fattore nucleare kB (NF-kB) di varie molecole chemiotattiche e di adesione che mediano il reclutamento di leucociti nell'endotelio (evento iniziale dello sviluppo delle placche aterosclerotiche). In aggiunta, NO diminuisce l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDL) e l'espressione del fattore tissutale per monociti e macrofagi. Sopprime inoltre la proliferazione abnorme delle cellule muscolari lisce vascolari, un processo che contribuisce al restringimento del lume nelle pareti aterosclerotiche (restenosi). Una diminuzione della disponibilità di NO a livello vascolare potrebbe quindi significare la progressione delle patologie vascolari. I fattori di rischio per le malattie cardiovascolari hanno un ruolo preminente nella produzione di radicali liberi e possono causare una rottura nel bilanciamento fra NO e ROS, provocando la diminuzione della biodisponibilità di NO. Questo porta ad una disfunzione nelle cellule muscolari lisce vascolari ed endoteliali, creando così le condizioni protrombotiche e proinfiammatorie che inducono la formazione, la progressione ed infine la destabilizzazione delle placche aterosclerotiche provocando infarti miocardici, ictus e morte dovuta ad incidenti cardiovascolari. Molti dati suggeriscono che il resveratrolo incrementi la produzione di NO e lo protegga dalla inattivazione, favorendo le sue attività biologiche. E' stato dimostrato che il resveratrolo aumenta l'espressione di eNOS nell'aorta di topi (Wallerath et al., 2002) e riduce l'espressione di NADPH ossidasi (Spanier et al., 2009), un enzima coinvolto nella

38 produzione di ROS, suggerendo che il miglioramento delle funzioni vascolari generate dal resveratrolo siano dovute sia all'incremento di NO che alla riduzione di ROS. Il resveratrolo aumenta l’attività del NO endoteliale attraverso molti meccanismi diversi. Per prima cosa il resveratrolo aumenta l’espressione della eNOS nelle cellule endoteliali attraverso la stimolazione della trascrizione genica ed aumentando la stabilità dell’mRNA che codifica per eNOS (Wallerath et al., 2002). Recenti studi hanno indicato che la up- regulation di eNOS è, almeno in parte, mediata dalla SIRT 1 ( sirtuina 1, proteina deacetilasi degli istoni ) la cui sovra espressione endotelio-specifica conduce ad un aumento dell’espressione di eNOS nei topi (Zhang et al., 2008). Il resveratrolo aumenta l'attività di eNOS stimolando la fosforilazione dello stesso, sul residuo 1177 di serina. Questo effetto è stato dimostrato essere mediato dal recettore estrogenico ERα e da una via di segnalazione che coinvolge la subunità α della proteina G (Gα), la caveolina 1 (Cav-1), la tirosina chinasi Src e la MAPK ERK1/2 (Klinge et al., 2005; Klinge et al., 2008). Il resveratrolo aumenta l'attività di eNOS inducendo la deacetilazione SIRT-1 mediata della lisina 496 e 506 nel dominio di eNOS legante la calmodulina (Mattagajasingh et al., 2007). L'estratto di fumo di sigaretta o la riduzione dell'espressione e dell'attività di eNOS indotta da perossido di idrogeno e l'incremento dell'acetilazione di eNOS possono essere ostacolate con il pretrattamento con resveratrolo (Arunachalam et al., 2010). Il resveratrolo aumenta l'attività di eNOS attraverso la diminuzione dei livelli intracellulari di dimetilarginina asimmetrica (ADMA), inibitore endogeno di eNOS (Frombaum et al., 2011; Yuan et al., 2010). Inoltre decresce i livelli di Cav-1 e l'interazione fra la stessa ed eNOS (Klinge et al., 2008) e previene il disaccoppiamento di eNOS, incrementando i livelli intracellulari del cofattore di eNOS, tetraidrobiopterina (BH4), aumentandone la

biosintesi mediando la upregulation di GTP cicloidrolasi 1 (GCH1) e prevenendo l'ossidazione di BH4, riducendo lo stress ossidativo (Xia et al., 2010). Il resveratrolo

incrementa la bioattività di NO inibendo la sua inattivazione mediata dall'anione superossido (Schmitt et al., 2009). Gli effetti del resveratrolo sulla funzione cardiovascolare sono stati dimostrati in numerosi modelli sperimentali, su tessuti/cellule umani ed animali, come schematizzato nella seguente tabella 1.

39 L'aumentata produzione di NO endoteliale indotta dal resveratrolo protegge il sistema vascolare attraverso le sue proprietà antipertensive (dovuta alla vasodilatazione), antitrombotiche (dovuta all'inibizione dell'aggregazione piastrinica) e antiaterosclerotiche (dovuta alla prevenzione dell'adesione dei leucociti all'endotelio vascolare, alla riduzione dell'ossidazione delle LDL e all'inibizione della proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari). L'incubazione con resveratrolo ha dimostrato che questo stilbene incrementa la produzione di NO dalle piastrine umane, attraverso la fosforilazione di AKT (conosciuta anche con il nome di proteina chinasi B: PKB) PI3K-dipendente (fosfoinositide 3-chinasi) e la conseguente fosforilazione ed attivazione di eNOS. Il NO così prodotto induce a sua volta tutti gli effetti cGMP dipendenti, come ad esempio la fosforilazione della

40 fosfoproteina "vasodilator-stimulated" (VASP) e l'inibizione della fosforilazione di p38MAPK con la conseguente inibizione dell'aggregazione piastrinica e della produzione di ROS. Gli effetti ottenuti con le concentrazioni utilizzate in vitro sono molto simili a quelli ottenibili dopo l'ingestione di moderate quantità di vino rosso (Gresele et al., 2008). Inoltre, l'attivazione di PKG cGMP-mediata promuove il recupero di Ca++ all'interno dei depositi nelle piastrine, diminuendo così i livelli intercitoplasmatici di Ca++. cGMP inibisce inoltre il rilascio di Ca++ stimolato dall'inositolo-1,4,5-trifosfato, dal reticolo sarcoplasmatico, contribuendo ulteriormente alla diminuzione del Ca++ citoplasmatico (Trepakova et al., 1999; Schlossmann et al., 2000). In aggiunta, il cGMP incrementa i livelli di cAMP attraverso l'inibizione della fosfodiesterasi di tipo 3 e in questo modo cGMP e cAMP possono sinergicamente inibire l'attivazione piastrinica (Maurice e Haslam, 1990). Colture HUVEC incubate con resveratrolo e quercitina mostrano un incremento dell'espressione di mRNA per eNOS e VEGF (vascular endothelial growth factor) e una minore secrezione di endotelina, effetti che ci saremmo aspettati come risultato della vasodilatazione e della regolazione della pressione sanguigna (Nicholson, 2009). Sempre in vitro, in colture di SMCs (cellule muscolari lisce) umane, il resveratrolo aumenta marcatamente la formazione di cGMP e stimola l'attività della chinasi G. La formazione di cGMP indotta dal resveratrolo era inoltre significativamente attenuata usando dei bloccanti dei recettori degli estrogeni. Inoltre, nell'aorta di ratti senza endotelio, l'afflusso e l'incremento di Ca++ intracellulare, aumentato dal resveratrolo potrebbe innescare la sintesi di NO dalle cellule endoteliali (Buluc e Demirel-Yilmaz, 2006). Il resveratrolo inoltre può incrementare le EPC (endothelial progenitor cells) circolanti e le loro funzioni attraverso un aumento della biodisponibilità di NO. Il resveratrolo in vitro attenua la senescenza di EPC indotta dal TNFα modificando alcune funzioni delle EPC, inclusa la promozione dell'adesione delle EPC e la migrazione. Questi dati suggeriscono che il resveratrolo può alterare la biologia delle EPC e questo può contribuire ai suoi effetti protettivi cardiovascolari (Huang et al., 2010). Il miglioramento delle funzioni endoteliali come conseguenza del trattamento con resveratrolo è stato dimostrato in molti studi su modelli animali con aterosclerosi e malattie metaboliche e in molti casi si è verificata una diminuzione della produzione di anione superossido. In un modello di sindrome metabolica, nei ratti obesi Zucker, l'assunzione cronica di resveratrolo ha aumentato l'espressione di eNOS e ha diminuito quella di iNOS nel tessuto adiposo viscerale e nell'aorta. Inoltre, la dislipidemia, l'ipertensione e l'iperinsulinemia sono migliorate dal consumo cronico di quercitina e resveratrolo, producendo effetti antiinfiammatori ed una

41 riduzione del peso corporeo (Rivera et al., 2009). In modelli di ipercolesterolemia in conigli, la somministrazione di vino rosso, vino rosso senza alcool o resveratrolo ha ridotto i livelli plasmatici di endotelina 1 (ET-1), un vasocostrittore endogeno, parallelamente ad un aumento dei livelli di NO, migliorando così le funzioni endoteliali (Zou et al., 2003). Questi dati indicano che il resveratrolo e gli altri polifenoli del vino rosso esercitano un effetto protettivo sulle funzioni vascolari attraverso il ripristino di NO. La disfunzione endoteliale è l'evento iniziale dello sviluppo dell'aterosclerosi ed è presente molto prima dei cambiamenti strutturali nella vascolarizzazione. In individui sani sottoposti a una dieta ricca di grassi saturi, il consumo giornaliero di 240 ml di vino rosso ha effettivamente contrastato le disfunzioni endoteliali indotte da quel tipo di dieta (Wagner e Frenette, 2008). Inoltre, la somministrazione di polifenoli estratti dal succo d'uva aumenta acutamente le funzioni endoteliali in pazienti con malattie alle arterie coronariche (Palabrica et al., 1992). In altri studi si è visto che l'aggiunta alla dieta di succo d'uva rossa, ricco di flavonoidi, ha diminuito l'aggregazione piastrinica, ha incrementato il rilascio di NO derivato dalle piastrine e diminuito la produzione di anione superossido nei soggetti in salute (Maugeri et al., 2006). Un ulteriore studio è stato condotto su volontari sani, dimostrando che un consumo moderato di vino rosso (300ml/giorno per due settimane) poteva incrementare il rilascio di nitriti e nitrati, metaboliti di NO dalle piastrine (Gresele et al., 2008).