7.1 PRECONDIZIONAMENTO ISCHEMICO CON RESVERATROLO
Il precondizionamento descrive lo sviluppo di resistenze al danno al cuore causato da una prolungata ischemia susseguita da riperfusione. I meccanismi fisiologici comprendono brevi periodi di ischemia seguiti da riperfusione, ma il potenziale terapeutico risiede nella possibilità che agenti farmacologici possano selettivamente indurre il precondizionamento. Il resveratrolo può mimare questo processo di precondizionamento fornendo uno stimolo farmacologico per ridurre i danni al cuore dovuti all'ischemia (Das e Maulik, 2006). Nei ratti, il miglioramento delle funzioni ventricolari post-ischemiche a seguito della somministrazione di resveratrolo fino a circa 10 mg/kg è ben definito; a dosi più alte il recupero è minore e peggiorato (Dudleyn et al., 2009). Il precondizionamento del resveratrolo non è limitato al cuore infatti, usando culture organotipiche di ippocampo come modello in vitro di ischemia cerebrale, il resveratrolo ha imitato il precondizionamento ischemico attraverso l'attivazione delle SIRT1 (Raval et al., 2006). Molti meccanismi potrebbero essere coinvolti nella cardioprotezione mediata dal resveratrolo nei cuori di ratto, inclusa la riduzione delle specie reattive dell'ossigeno, la vasodilatazione e conseguente riduzione della pressione sanguigna, l'inibizione della perossidazione lipidica, la prevenzione di infiammazione e apoptosi e la prevenzione dell'aggregazione piastrinica (Das e Maulik, 2006). I recettori A1 e A3 per l'adenosina sono
coinvolti nei processi di protezione delle cellule dall'apoptosi se attivati, attivando segnali di sopravvivenza quali Bad/Bcl-2. I recettori A1 dell'adenosina in particolare sono coinvolti
nel precondizionamento nei cuori di ratto poiché la loro attivazione comporta la trasmissione di una via di sopravvivenza attraverso la trasmissione del segnale PI3-chinasi- Akt-Bcl-2. Negli esperimenti effettuati da Das e collaboratori, si vedeva che il recettore A3
dell'adenosina induceva il precondizionamento mediato dal resveratrolo, attraverso l'attivazione della fosforilazione delle CREB (cAMP response element-binding protein) (Das et al., 2005). Il ruolo dell'eme ossigenasi-1 nel precondizionamento indotto dal
47 resveratrolo nel cuore di ratto è stato esaminato dal momento che il resveratrolo incrementa la produzione di NO il quale può indurre un aumento dell'espressione dell'eme ossigenasi-1 (Das et al., 2005). L'inibizione dell'eme ossigenasi-1 con protoporfirina coniugata a stagno ha inibito sia la fosforilazione di p38MAP chinasi b e Akt indotta dal resveratrolo, sia la p38MAP chinasi a. Così, l'eme ossigenasi-1 ha generato un segnale di sopravvivenza dalla sovraespressione di p38MAP chinasi b, sebbene inducesse una downregulation della p38MAP chinasi a, incrementando simultaneamente la fosforilazione di Akt (Das et al., 2006). Meccanismi simili hanno indotto cardioprotezione nei ratti con diabete indotto da streptozocina, suggerendo che l'attenuazione dello stress ossidativo indotta dal resveratrolo durante l'ischemia e la successiva riperfusione nei cuori di soggetti diabetici era mediata dall'induzione dell'azione di NO attraverso il sistema tioredoxina-1/eme ossigenasi-1/VEGF e da un incremento significativo di un enzima con un forte potere antiossidante: MnSOD (Thirunavukkarasu et al., 2007). In un modello di ratti con diabete di tipo 2 (fructose-fed), il resveratrolo ha prevenuto l'incremento della pressione sanguigna e l'ipertrofia cardiaca mediante il ripristino dell'attività di eNOS a livello mesenterico e cardiaco e riducendo lo stress ossidativo (Miatello et al., 2005). Nei ratti obesi Zucker, un altro modello genetico di diabete di tipo 2, il resveratrolo ha incrementato l'espressione di GLUT-4 e ha ridotto l'espressione di endotelina e l'apoptosi nei cuori che avevano subito riperfusione dopo ischemia.
7.2 RIMODELLAMENTO CARDIACO
Il cuore risponde con un rimodellamento durante patologie croniche cardiovascolari quali l'ipertensione, l'infarto del miocardio e l'insufficienza cardiaca. Il processo di rimodellamento implica l'ipertrofia dei miociti, l'iperplasia dei fibroblasti e delle cellule muscolari lisce vascolari, la deposizione eccessiva di collagene e anomalie di conduzione. Il resveratrolo inibisce la proliferazione delle cellule muscolari lisce delle coronarie umane attraverso l'attivazione del sistema chinasi-G per contrastare l'attivazione di ERK1/2 (El- Mowafy et al., 2008). L'ipertrofia ventricolare che si verifica nei ratti indotta dal "banding" aortico, con riduzione del NOS sia endoteliale che inducibile e del fattore riducente-1; questi cambiamenti possono essere prevenuti con il trattamento con resveratrolo (Juric et al., 2007). Tuttavia, il trattamento con resveratrolo a dosi intorno a 17 mg/kg/die nelle arterie coronariche dei ratti non ha migliorato il rimodellamento cardiaco o le funzioni
48 emodinamiche globali, ma ha preservato le riserve contrattili (Burstein et al., 2007). Il resveratrolo ha inibito la proliferazione dei fibroblasti cardiaci e la differenziazione del fenotipo ipersecretorio miofibroblastico nelle culture di fibroblasti cardiaci di ratto; questi sono due passaggi fondamentali nella deposizione di collagene a livello cardiaco (Olson et al., 2005). In aggiunta, il resveratrolo, in concentrazioni comprese fra 25 e 100 µM, ha inibito la proliferazione di fibroblasti cardiaci di ratto in cultura, probabilmente attraverso l'attivazione della via di segnale del NO-cGMP, ma la fibrosi perivascolare indotta nelle femmine di ratto da una dieta ad alto contenuto di grassi si è dimostrata inalterata dal trattamento con resveratrolo (Aubin et al., 2008). Un altro meccanismo che può contribuire ai cambiamenti indotti dal resveratrolo nel rimodellamento cardiaco potrebbe essere dovuto alle sue proprietà antiinfiammatorie, dal momento che l'infiammazione è un iniziatore chiave della fibrosi. Questi meccanismi antiinfiammatori sono legati alla capacità di inibire il rilascio di fattori e mediatori proinfiammatori (come le cellule immunitarie e le cicloossigenasi), delle molecole di adesione (come le ICAM-1, le VCAM- 1 e le sE selettine), ma anche alla capacità di inibire l'attivazione del NFkB negli adipociti che riduce l'espressione delle citochine al fine di controllare le proprietà infiammatorie del tessuto adiposo (Gonzales e Orlando, 2008).
Le aritmie cardiache sono spesso associate al rimodellamento cardiaco e quindi è rilevante determinare se il resveratrolo alteri la conduzione cardiaca. Questo stilbene, alla concentrazione relativamente alta di 100 µmol/l prolunga il periodo refrattario effettivo nel cuore di ratto attraverso l'inibizione dei canali al Na+ in entrata così come le correnti di K+ in entrata e in uscita (Chen et al., 2007). Trattando alcuni ratti con resveratrolo alle dosi di 5 mg/kg/die per 4 settimane si è notata una soppressione dell'incidenza della tachicardia ventricolare e della fibrillazione ventricolare, riducendo così la percentuale di infarti e la mortalità. La conclusione di questi studi è che il resveratrolo inibisca le aritmie attraverso l'inibizione dei canali al Ca++ ad apertura lenta ed un miglioramento selettivo dei canali al K+ ATP-dipendenti (Chen et al., 2008).
7.3 RIMODELLAMENTO VASCOLARE
Così come avviene nel cuore, il resveratrolo può avviare una serie di azioni a livello vascolare che portano al rimodellamento dello stesso sistema, attraverso l'attivazione delle SIRT 1, un gruppo di proteine che svolgono funzioni chiave per quanto riguarda l'omeostasi vascolare endoteliale, attraverso il controllo dell'angiogenesi, del tono
49 muscolare e delle disfunzioni endoteliali. Sia una sovraespressione di SIRT 1 che il trattamento con resveratrolo infatti diminuisce l'espressione dei recettori AT 1 (recettore per l'angiotensina II accoppiato a proteina G) nelle cellule muscolari lisce vascolari di ratto in coltura; inoltre il resveratrolo sopprime l'espressione dei recettori AT 1 nell'aorta di topo e riduce l'ipertensione indotta dall'angiotensina II (Miyazaki et al., 2008). Il trattamento con resveratrolo a concentrazioni di 0.1 µmol/l ha avviato cambiamenti in molti tipi di cellule del sistema vascolare, dovuti principalmente ad un incremento di NO, mediatore chiave, (grazie all'incremento dell'espressione di eNOS) e ad una diminuzione dell'endotelina-1, nelle cellule endoteliali della vena ombellicale umana in coltura (Nicholson e Tucker, 2008). Inotre, a concentrazioni sottomicromolari, il resveratrolo ha inibito l'attivazione del NFkB indotto dal TNF-α, l'espressione dei geni di molecole proinfiammatorie e l'adesione dei monociti alle cellule endoteliali delle arterie coronariche umane: queste azioni antiinfiammatorie sulle cellule endoteliali potrebbero indurre la cardioprotezione (Csiszar et al., 2006). Le cellule endoteliali sono sensibili all'aumento delle specie reattive dell'ossigeno nel sangue ed ai prodotti del NADPH ossidasi. La stimolazione di questo enzima da parte delle LDL ossidate è inibita dal resveratrolo nelle cellule endoteliali vascolari ombellicali umane (Chow et al., 2007). Inoltre, dal momento che il resveratrolo aumenta l'espressione della glutatione perossidasi, della catalasi e dell'eme ossigenasi 1, nelle arterie di ratto in coltura, si ha una prevenzione della morte delle cellule endoteliali indotta dallo stress ossidativo, rivelando quindi un probabile meccanismo di protezione cardiaca e vascolare (Ungvari et al., 2007). Le risposte del sistema vascolare al resveratrolo possono essere aumentate dal rilassamento che questa molecola provoca attraverso effetti diretti sulle cellule muscolari lisce vascolari ed endoteliali. Una dieta ricca di grassi nei ratti femmina induce un incremento della pressione sanguigna e una riduzione del rilassamento indotto dall'acetilcolina. La somministrazione di resveratrolo (0.1 µM) ha ripristinato le risposte indotte dall'acetilcolina e inoltre se assunto nella dieta (20 mg/kg/die per 8 settimane) ha prevenuto l'incremento della pressione sanguigna e preservato il rilassamento indotto dall'acetilcolina (Aubin et al., 2008). Secondo altri studi, i canali al potassio sensibili all'aminopiridina e alla margarotoxina nelle cellule muscolari lisce mediano il rilassamento dell'aorta di ratto senza endotelio grazie all'azione del resveratrolo (Novakovic et al., 2006), il quale, inoltre, in un ulteriore studio condotto da Calderone et al., 2007, ha aperto i canali del K+ a larga conduttanza attivati dal Ca++ nelle cellule muscolari lisce aortiche di ratto, provocando un incremento del rilascio di NO dalle cellule endoteliali e il conseguente rilassamento. Nelle
50 cellule lisce vascolari embrioniche di aorta di ratto il resveratrolo riduce l'incremento di Ca++ intracellulare indotto da agonisti e dal K+. Questo è stato ottenuto attraverso l'inibizione diretta dei canali al Ca++ o promuovendo soltanto un incremento lento della concentrazione intracellulare di questo ione attraverso la deplezione delle sue riserve intracellulari (Campos-Toimil et al., 2007). Inoltre il resveratrolo ha incrementato il rilascio di Ca++ intracellulare indotto dagli agonisti nelle cellule endoteliali che potrebbe innescare la sintesi ed il rilascio di NO, oltre a diminuire la sensibilità al Ca++ nelle cellule muscolari lisce aortiche di ratto (Buluc et al., 2006). Per concludere, il vasorilassamento indotto dal resveratrolo potrebbe essere dovuto sia ad una aumentata espressione del NO sintetasi che all'attivazione di una particolare guanilciclasi che produce cGMP provocando rilassamento vascolare, come si è visto ad esempio nelle arterie coronariche di pecora (El- Mowafy et al., 2008).