EFFETTI DEL TIROSOLO

L’effetto del tirosolo, per quanto riguarda l’attività antinfiammatoria, è stato valutato in cellule mononucleate umane isolate da sangue periferico ed incubate con LPS, che determina sintesi intercellulare di tumor necrosis factor α (TNFα) e di interleuchina-1β (IL-1 β) ed il rilascio quasi totale di interleuchina-6 (IL-6).

Il tirosolo alla concentrazione di 200 nM si è dimostrato capace di ridurre parzialmente, anche se in maniera non significativa, la produzione di TNFα, mentre solo a dosaggi piuttosto elevati (dell’ordine del micromolare) determinava una riduzione della produzione di IL-1 β e di IL-6.

Inoltre, il tirosolo a concentrazioni da 40 a 200 µM si è mostrato capace di inibire la 5- lipossigenasi nei leucociti, riducendo la produzione dei leucotrieni [180]. E’ stato anche valutato che l’idrossitirosolo può ridurre l’aggregazione piastrinica indotta da ADP o da collagene con una potenza simile a quella dell’aspirina ed inoltre protegge dalla disfunzione endoteliale dovuta a diminuzione di ossido nitrico (NO), oltre ad inibire la vasocostrizione associata agli effetti dello stress ossidativo, impedendo che si abbia un aumento della pressione del sangue [191].

Il tirosolo si è mostrato efficace in un modello sperimentale in vivo di ischemia miocardica acuta, dove il trattamento endovenoso 10 minuti prima dell’occlusione coronarica ha significativamente ridotto l'attività aritmica che si verifica durante ischemia e riperfusione miocardica [185].

In merito alla protezione da ischemia e riperfusione miocardia, diversi studi sperimentali condotti su un cuore isolato e perfuso hanno dimostrato che il tirosolo ed il vino bianco (in cui il tirosolo è particolarmente abbondante) proteggono il cuore dal danno da ischemia/riperfusione, riducendo la formazione di radicali tossici dell’ossigeno, l’apoptosi dei cardiomiociti e le dimensioni dell’infarto e migliorando il recupero ventricolare post- ischemico [192;193].

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8 SCOPO

Le nuove conoscenze sui meccanismi che portano al processo di trasformazione e progressione tumorale e il riconoscimento delle proteine coinvolte nella regolazione di questi fenomeni hanno aperto una nuova prospettiva nella formulazione e nella valutazione clinica di nuovi farmaci, portando allo sviluppo delle cosiddette terapie mirate. Le proteine che regolano la proliferazione, la differenziazione, l’apoptosi e l’invasività cellulare sono alla base della trasformazione neoplastica e sono il bersaglio di questo nuovo approccio terapeutico. Lo studio di alcuni aspetti della biologia molecolare, come fattori di crescita, molecole coinvolte nella trasduzione del segnale, nell’angiogenesi, nell’apoptosi, nell’invasività e nel ciclo cellulare ha consentito di identificare nuovi bersagli farmacologici in grado di interferire con eventi chiave della trasformazione della cellula in senso neoplastico e della sua proliferazione. Le cellule tumorali, come quelle normali, utilizzano molteplici vie di segnalazione intracellulare al fine di assicurare il mantenimento e l’attività di funzioni critiche per la loro sopravvivenza. A questo proposito, molti studi hanno confermato che il sistema sirtuinico e il pathway di mTOR sono entrambi implicati nel processo di tumorigenesi e ciò è avvalorato anche dalla relazione di reciproca inibizione esistente tra queste due proteine. Per questo negli ultimi anni si è avuto un grande incremento degli studi volti alla ricerca di meccanismi o sostanze che fossero in grado di potenziare l’attivazione di SIRT1 e parallelamente di inibire mTOR.

La disregolazione del segnale di mTOR (e in particolare di mTORC1) altera il metabolismo corporeo, causando malattie correlate all’età e altri disordini, tra i quali si hanno forme tumorali in cui la proteina è iper-regolata. Inoltre, un’espressione non regolata e/o un’aumentata fosforilazione di S6K1 e di 4E-BP1 in cellule tumorali sono correlate ad esiti infruttuosi nei pazienti. Pertanto, il signaling di mTOR costituisce, oggi, un importante target terapeutico, soprattutto nei tumori maligni: in questo contesto, infatti, gli inibitori di questa via di trasduzione risultano essere terapie potenzialmente efficaci.

Studi precedenti hanno analizzato il ruolo di alcuni modulatori nutraceutici di SIRT1 sul pathway di mTOR, dimostrando che le sostanze testate sono in grado non solo di stimolare SIRT1, ma anche di inibire mTOR.

Sulla base di tali premesse, questa tesi sperimentale si pone come scopo generale la valutazione dell’effetto di diverse sostanze naturali attivanti SIRT1 sull’asse

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mTOR/S6K1/4E-BP1. Più in dettaglio, si è voluto verificare se le sostanze testate (quercetina, berberina, tirosolo ed acido ferulico) determinano una stimolazione dell’espressione di SIRT1 e un’inibizione di mTOR, S6K1 e 4E-BP1.

9 MATERIALI E METODI

9.1 COLTURE CELLULARI

Le linee cellulari utilizzate sono state le HeLa (Fig.37). Le HeLa sono una linea cellulare tumorale umana isolata da un cancro della cervice uterina; si tratta di cellule immortalizzate, altamente stabilizzate e molto più resistenti delle altre cellule tumorali. Queste sono state coltivate in un terreno di coltura completo, composto da DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium-Sigma), al quale è stato aggiunto siero fetale bovino al 10% (Sigma), antibiotici all’1% (penicillina-streptomicina-Sigma) e L-glutammina all’1% (Sigma). Le colture cellulari sono state seminate in fiasche di plastica e mantenute in incubatore a 37°C, in presenza di anidride carbonica (5%) per mantenere il pH a un valore di 7.4.

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Le cellule sono state fatte crescere fino a una confluenza dell’80%, dopodiché sono state tripsinizzate per essere splittate a una confluenza minore.

Il giorno della semina in piastre le HeLa sono state sottoposte ad alcuni lavaggi con PBS, successivamente tripsinizzate e poi centrifugate. Il pellet cellulare, derivante dalla centrifugazione, è stato risospeso in medium fresco e ne è stata prelevata una piccola aliquota, su cui è stata effettuata la conta cellulare con la Camera di Burker. A questo punto, un’aliquota di queste cellule è stata conservata in congelatore alla temperatura di -80°C con DMSO (dimetilsolfossido) al 7%, un’aliquota è stata rimessa in fiasche con medium fresco e un’ultima aliquota è stata piastrata (100000 cellule/pozzetto). Le 4 sostanze per il trattamento delle cellule (berberina, quercetina, tirosolo e acido ferulico) sono state preparate mediante opportuna solubilizzazione con DMSO, preparando, così, soluzioni stock per ciascuna sostanza. Questo passaggio è fondamentale per ottenere la giusta concentrazione delle sostanze di interesse, una volta diluite nel medium all’interno del pozzetto.

Il giorno dell’esperimento, le cellule in coltura sono state trattate con: 1) Berberina, alle concentrazioni di 5µM e 10µM;

2) Quercetina, alle concentrazioni di 10µM e 25µM; 3) Tirosolo, alle concentrazioni di 10µM e 20µM; 4) Acido Ferulico, alle concentrazioni di 25µM e 50µM.

I tempi di incubazione sono stati di 3, 6 e 24 ore. Al termine della fase di incubazione, dopo aver aspirato il medium dai pozzetti e dopo un lavaggio con PBS (pH 7.4), all’interno di ciacun pozzetto sono stati aggiunti 120 µl di buffer di lisi, costituito da una soluzione di RIPA buffer (Tris HCl a pH 8.0, NaCl, EDTA e SDS) a cui è stato aggiunto un cocktail di inibitori delle proteasi (Pepstatina, Leucopeptina, Aprotinina, PMSF) e delle fostatasi (Sodio ortovanadato 1 µM, Sodio pirofosfato 10 µM, Sodio fluoruro 20 µM). Dopo aver proceduto con lo screpaggio, i campioni sono stati raccolti in ghiaccio, sottoposti a tre cicli di congelamento/sconglamento, centrifugati ed infine da essi è stato prelevato il sovranatante, contenente le proteine di interesse.

Una parte del lisato è stata trasferita in una eppendorf e il suo contenuto proteico è stato quantificato allo spettrofotometro, utilizzando un kit commerciale basato sulla metodica di Bradford. Per valutare la concentrazione proteica incognita nei campioni è stata costruita una curva di taratura, utilizzando concentrazioni crescenti note di albumina di siero bovino

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(BSA), sciolta in acqua distillata. Tutte le prove, comprese quelle relative alla curva di taratura, sono state allestite in duplicato e le concentrazioni finali sono state espresse in µg/µl. Il metodo di Bradford è basato sul legame del colorante Blue di Coomassie alle proteine. Il colore di questa sostanza, infatti, vira dal marrone al blu in seguito al legame con arginine ed altri amminoacidi.

L’espressione di SIRT1 e il grado di fosforilazione di mTOR, S6K1 e 4E-BP1 sono stati valutati tramite Western Blot.

9.2 WESTERN BLOT

Il western blot (o immunofissazione) è una tecnica biochimica che permette di identificare una specifica proteina (per riconoscimento da parte di anticorpi specifici), dopo aver ottenuto la separazione delle proteine presenti in un campione, in base alla loro carica e al loro peso molecolare (PM), mediante una SDS PAGE (elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato). In questo tipo di elettroforesi le molecole di grandi dimensioni migrano, in genere, più lentamente di quelle piccole: ciò permette la separazione delle diverse proteine all’interno del gel, appunto, in base al loro PM.

Al campione (in cui si ha una concentrazione proteica pari a 30 µg/µl), derivante dal lisato delle cellule trattate con le sostanze in esame, prima del caricamento su gel, è stato aggiunto il Laemmli Buffer (Tris HCl 0.5 M pH 6.8, SDS 20%, glicerolo, 2-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0.2%). Questo tampone ha il compito di conferire un elevato peso molecolare al campione (grazie alla presenza di glicerolo) e una colorazione blu intensa (data dal colorante blu di bromofenolo), in modo da agevolare le operazioni di caricamento del campione stesso sul gel di elettroforesi; la presenza di SDS (sodio dodecil solfato), sostanza che denatura le proteine, conferisce loro una carica negativa, cosicché, durante la relativa fase di elettroforesi, le proteine si separeranno solo in base al loro peso molecolare e non in base alla propria carica.

Il tutto è stato fatto bollire per 5 minuti, per completare la denaturazione già avviata dall’SDS.

Per la separazione elettroforetica delle proteine è stato utilizzato un gel di poliacrilammide, che è composto da due porzioni: una inferiore, denominata gel di corsa (running gel), contenente acrilammide (ammide dell’acido acrilico) al 12% (acrilammide/bis-acrilammide 30%), in cui avviene la separazione delle proteine, e una porzione superiore, chiamata gel di impaccamento (stacking gel), contenente acrilammide al 10%, dove sono stati costruiti i

69 pozzetti per il caricamento del campione.

Per l’allestimento del running gel è stata preparata una soluzione composta da acqua distillata, Acrilammide 30% (Sigma Aldrich), Tris-base HCl a pH 8.8 (Sigma), SDS 10% (Sigma), TEMED (N,N,N’,N’-tetrametietilendiammina); APS (ammonio persolfato) 10%. Dopo circa 30 minuti, il tempo necessario a far avvenire la polimerizzazione dell’acrilammide ad opera dei catalizzatori TEMED e APS, si è proceduto alla preparazione della soluzione per lo stacking gel, composta da acqua distillata, Acrilammide 30% (Sigma), Tris-base HCl a pH 6.8 (Sigma), SDS 10%, TEMED, APS 10% (Sigma). Anche per questa reazione di polimerizzazione occorrono circa 30 minuti, dopodiché i vetrini contenenti i gel polimerizzati sono stati trasferiti nella camera per l’elettroforesi, contenente un tampone di corsa elettroforetica, il running buffer, la cui composizione è data da Tris-base (Sigma), glicina (Sigma), SDS 1% (Sigma) e acqua distillata.

I pozzetti, situati al margine superiore dello stacking gel, sono stati riempiti con i vari campioni (30 µg di ciascun campione proteico), nella cosiddetta fase di caricamento. La corsa è stata eseguita a temperatura ambiente, facendo passare nella camera per l’elettroforesi una corrente a 200 V per circa un’ora, o comunque fino a quando il fronte di migrazione (visibile grazie alla presenza del blu di bromofenolo nel Laemmli buffer) non ha raggiunto il fondo del gel.

Una volta terminata la corsa, è stato eseguito il trasferimento delle proteine dal gel a una membrana di Polivinildenfluoruro (PVDF). Il tutto è stato riposto in una seconda camera per l’elettroforesi, che è stata riempita di transfer buffer, un tampone costituito da Tris-base e da glicina, fino a completa sommersione del “sandwich”. Il trasferimento è stato condotto a

70 una temperatura di 4°C.

L’alimentatore è stato programmato in modo tale da fornire alla camera di trasferimento un voltaggio pari a 100 V per un’ora.

Dopo il trasferimento la membrana è stata posta in una soluzione di bloccaggio (per prevenire le interazioni aspecifiche tra anticorpo e membrana nella fase successiva di rilevamento delle proteine di interesse), per un’ora in agitatore e a temperatura ambiente. Tale soluzione è composta da latte magro in polvere al 5% diluito in TBS (Tris-buffered saline) Tween 1X (TBS 1x, Tween20 0.1%, il tampone è chiamato T-TBS), per la rilevazione di SIRT1, mTOR totale, S6K1 totale e 4E-BP1 totale e da albumina (BSA, albumina di siero bovino) al 5% diluita in T-TBS per la rilevazione delle forme fosforilate di mTOR, S6K1 e 4E-BP1. Dopo la fase di bloccaggio la membrana è stata sottoposta ad alcuni lavaggi rapidi con T-TBS.

L’attivazione/inibizione delle proteine in esame è stata analizzata incubando le membrane con gli specifici anticorpi primari e successivamente con i relativi anticorpi secondari coniugati con la perossidasi di rafano (HRP, Horseradish peroxidase).

Per la rilevazione di SIRT1 si è proceduto all’incubazione con l’anticorpo primario (AbI°) anti-SIRT1, rabbit, alla diluizione di 1:1000 in T-TBS + BSA al 5% per tutta la notte a 4°C. Il giorno seguente sono stati eseguiti 5 lavaggi con T-TBS per rimuovere l’anticorpo primario non legato e in seguito la membrana è stata incubata con l’anticorpo secondario (AbII°) goat anti-rabbit diluito 1:10000 in T-TBS + BSA al 5% per un’ora in agitazione. Per ottenere un’accurata valutazione quantitativa dell’espressione di SIRT1, questa proteina è stata

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normalizzata con un housekeeping, la β-actina (AbI° anti-β-actina, mouse, alla diluizione di 1:1000 in T-TBS + BSA al 5%; AbII° goat anti-mouse diluito 1:10000 in T-TBS + BSA al 5%).

Per la determinazione di mTOR, S6K1 e 4E-BP1 è stato necessario utilizzare due tipi di anticorpi primari per ciascuna delle proteine: uno per la rilevazione delle forme fosforilate e uno per la determinazione delle proteine totali; infatti la valutazione quantitativa della forma fosforilata di ciascuna proteina richiede il confronto con la corrispondente proteina totale. L’incubazione con gli anticorpi primari è avvenuta, anche in questi casi, per tutta la notte a 4°C e alle seguenti concentrazioni: anti-fosfo-mTOR, rabbit, 1:1000; anti-mTOR-totale, rabbit, 1:1000; anti-fosfo-S6K1, rabbit, 1:1000; anti-S6K1-totale, rabbit, 1:1000; anti-fosfo- 4E-BP1, rabbit, 1:1000; anti-4E-BP1-totale, rabbit, 1:1000; tutti i suddetti anticorpi primari si intendono diluiti in T-TBS + BSA al 5%. Il giorno seguente, dopo i lavaggi con T-TBS, si è proceduto all’incubazione dell’anticorpo secondario goat, anti-rabbit, diluito 1:10000 in T- TBS + BSA al 5%, per un’ora in agitazione a temperatura ambiente.

Durante questa fase l’anticorpo secondario, coniugato alla perossidasi di rafano, si lega in maniera specie-specifica all’anticorpo primario. Nel passaggio successivo, l’enzima perossidasi legherà un substrato specifico (il luminolo), per la reazione di chemiluminescenza, in cui l’enzima catalizza l’ossidazione del luminolo, che viene, perciò, a trovarsi in uno stato eccitato e dal quale decade mediante emissione di luce. Dopo l’incubazione con l’anticorpo secondario sono stati effettuati una serie di lavaggi con T-TBS in agitazione, allo scopo di rimuovere tutto l’anticorpo secondario non legato.

Infine, la membrana è stata incubata in soluzione di sviluppo Chemiluminescence Luminata Crescendo Western HRP (Millipore Corporation) al buio per circa tre minuti in agitazione a temperatura ambiente e lo sviluppo è stato realizzato mediante lo strumento Kodak Image Station 440 CF. Sulla base delle bande ottenute, l’espressione di tutte le proteine analizzate è stata quantificata mediante il software di analisi delle immagini Kodak 1D.

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9.3 ANALISI STATISTICA

L’analisi statistica è stata condotta tramite il pacchetto statistico Statview, versione 5.0.1 (SAS Institute, Concetto Abacus, Inc., Berkeley, California), il programma di calcolo Microsoft Excel 2010 ed il pacchetto statistico GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California). In dettaglio, la significatività statistica è stata valutata applicando nelle l’analisi della varianza (ANOVA) a due vie per misure ripetute e, come post hoc, il Tukey’s Multiple Comparison test. Sono stati considerati statisticamente significativi valori di p<0.05 rispetto al controllo. I dati sono espressi come Media ± ES (errore standard).

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10 RISULTATI

10.1 ESPRESSIONE DI SIRT1

Di seguito sono riportati i risultati dell’analisi dell’espressione di SIRT1, mediante la tecnica del Western Blot. Si può osservare come l’espressione di questa proteina sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali, rispetto al gruppo di controllo.

BERBERINA

La berberina è stata testata alle concentrazioni di 5 µM e 10 µM. In entrambi i casi si osserva un incremento statisticamente significativo dell’espressione di SIRT1 rispetto al controllo. Alla concentrazione di 5 µM si osserva, infatti, un incremento rispetto al controllo di 63.09

± 8.19% dopo un’incubazione di 3h, di 65.5 ± 10.98% dopo 6h e di 75.5 ± 10.01% dopo

24h (***p<0.001). A 10 µM si osserva un incremento statisticamente significativo, rispetto al controllo, di 65.09 ± 5.17% dopo 3h, di 64.2 ± 3.65% dopo 6h e di 75.5% ± 10.03% dopo 24h (***p<0.001).

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Figura 41. Espressione di SIRT1. ***p<0.001 vs controllo

QUERCETINA

La quercetina è stata testata alle concentrazioni di 10 µM e 25 µM. A 10 µM si osserva un incremento statisticamente significativo dell’espressione di SIRT1, rispetto al controllo, di

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21.50 ± 2.91% a 3h, di 22.00 ± 2.58% a 6h e di 29.50 ± 7.5% a 24h (***p<0.001). A 25

µM si osserva un incremento statisticamente significativo, rispetto al controllo, di 27.00 ±

3.08% a 3h, di 27.5 ± 1.96% a 6h e di 54.5 ± 8.1% a 24h (***p<0.001).

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TIROSOLO

Il tirosolo è stato testato alle concentrazioni di 10 µM e 20 µM. A 10 µM si osserva un incremento statisticamente significativo dell’espressione di SIRT1, rispetto al controllo, di

52.89 ± 9.32% a 3h, di 62 ± 1.43% a 6h e di 68.4 ± 3.90% a 24h (***p<0.001).

A 20 µM si osserva un incremento statisticamente significativo, rispetto al controllo, di 76.53

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Figura 43. Espressione di SIRT1. ***p<0.001 vs controllo

ACIDO FERULICO

L’acido ferulico è stato testato alle concentrazioni di 25 µM e 50 µM.

A 25 µM si osserva un incremento statisticamente significativo dell’espressione di SIRT1, rispetto al controllo, di 43.55 ± 3.58% a 3h, di 44.02 ± 3.50% a 6h e di 66.50 ± 1.5% a 24h (***p<0.001).

A 50 µM si osserva un incremento statisticamente significativo, rispetto al controllo, di 57.31

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Figura 44. Espressione di SIRT1. ***p<0.001 vs controllo

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10.2 INIBIZIONE DI mTOR

Di seguito sono riportati i risultati dell’analisi dell’espressione di mTOR, mediante la tecnica del Western Blot. Si può osservare come il grado di attivazione di questa proteina sia significativamente diminuito in tutti i gruppi sperimentali, rispetto al gruppo di controllo.

BERBERINA

La berberina è stata testata alle concentrazioni di 5 µM e 10 µM. Alla concentrazione di 5 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa del grado di attivazione di mTOR, rispetto al controllo, di 7 ± 1.01%, dopo un’incubazione di 3h (*p<0.05), di 29 ±

1.21% dopo 6h e di 35 ± 2.20%, dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 10 µM si

osserva un decremento statisticamente significativo, rispetto al controllo, di 10 ± 2.03% dopo 3h di incubazione (*p<0.05), di 32 ± 3.25% dopo 6h e di 38 ± 4.04% dopo 24h (***p<0,001).

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QUERCETINA

La quercetina è stata testata alle concentrazioni di 10 µM e 25 µM. Alla concentrazione di 10 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione di mTOR, rispetto al controllo, di 1 ± 1.25% dopo 3h di incubazione, di 12 ± 2.25% dopo 6h (*p<0.05) e di 16 ± 2.18% dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 25 µM si osserva un decremento statisticamente significativo dell’attivazione di mTOR rispetto al controllo di 18

± 3.23% dopo 3h (***p<0.001), di 25 ± 2.04% dopo 6h (*p<0.05) e di 29 ± 4.01% dopo

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Figura 46. Inibizione di mTOR. *p<0.05, ***p<0.001 vs controllo.

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TIROSOLO

Il tirosolo è stato testato alle concentrazioni di 10 µM e 20 µM. Alla concentrazione di 10 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione di mTOR, rispetto al controllo, di 3 ± 3.01% dopo 3h di incubazione, di 19 ± 3.23% dopo 6h e di 23 ±

2.56% dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 20 µM si osserva un decremento

statisticamente significativo dell’attivazione di mTOR rispetto al controllo di 9 ± 1.23% dopo 3h, di 23 ± 2.25% dopo 6h e di 40 ± 3.26% dopo 24h (***p<0.001).

Figura 47. Inibizione di mTOR. ***p<0.001 vs controllo.

83

ACIDO FERULICO

L’acido ferulico è stato testato alle concentrazioni di 25 µM e 50 µM. Alla concentrazione di 25 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione di mTOR, rispetto al controllo, di 16 ± 2.35% dopo 3h di incubazione (**p<0.05), di 28 ± 2.15% dopo 6h e di 28 ± 1.03% dopo 24 h (***p<0.001). Alla concentrazione di 50 µM si osserva un decremento dell’attivazione di mTOR rispetto al controllo di 20 ± 1.05% dopo 3h, di 30 ±

1.01% dopo 6h e di 33 ± 3.02% dopo 24h (***p<0.001).

Figura 48. Inibizione di mTOR. *p<0.05, ***p<0.001 vs controllo.

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10.3 INIBIZIONE DI S6K1

Di seguito sono riportati i risultati dell’analisi dell’espressione di S6K1, mediante la tecnica del Western Blot. Si può osservare come il grado di attivazione (dato dalla fosforilazione) di questa proteina sia significativamente diminuito in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo di controllo.

BERBERINA

La berberina è stata testata alle concentrazioni di 5 µM e 10 µM. Alla concentrazione di 5 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa del grado di attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 15 ± 1.04%, dopo un’incubazione di 3h, di 25 ± 2.4% dopo 6h e di 36 ± 2.15%, dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 10 µM si osserva un decremento statisticamente significativo dell’attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 20

± 2.04% dopo 3h di incubazione, di 33 ± 3.23% dopo 6h e di 37 ± 1.19% dopo 24h

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Figura 49. Inibizione di S6K1. ***p<0,001 vs controllo.

QUERCETINA

La quercetina è stata testata alle concentrazioni di 10 µM e 25 µM. Alla concentrazione di 10 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 20 ± 3.43% dopo 3h di incubazione, di 26 ± 4.12% dopo 6h e di 36

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± 1.25% dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 25 µM si osserva un decremento

statisticamente significativo dell’attivazione di S6K1 rispetto al controllo di 24 ± 3.14% dopo 3h, di 34 ± 2.13% dopo 6h e di 39 ± 1.52% dopo 24h (***p<0.001).

TIROSOLO

Il tirosolo è stato testato alle concentrazioni di 10 µM e 20 µM. Alla concentrazione di 10 Figura 50. Inibizione di S6K1. ***p<0,001 vs controllo.

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µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 24 ± 2.02% dopo 3h di incubazione, di 31 ± 1.31% dopo 6h e di 37

± 4.3% dopo 24h (***p<0.001). Alla concentrazione di 20 µM si osserva un decremento

statisticamente significativo dell’attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 26 ± 2.03% dopo 3h, di 34 ± 1.05% dopo 6h e di 40 ± 3.63% dopo 24h (***p<0.001).

Figura 51. Inibizione di S6K1. ***p<0,001 vs controllo.

ACIDO FERULICO

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di 25 µM si osserva una diminuzione statisticamente significativa dell’attivazione do S6K1, rispetto al controllo, di 18 ± 3.08% dopo 3h di incubazione, di 24 ± 1.75% dopo 6h e di 33

± 2.01% dopo 24 h (***p<0.001). Alla concentrazione di 50 µM si osserva un decremento

dell’attivazione di S6K1, rispetto al controllo, di 27 ± 2.72% dopo 3h, di 33 ± 3.12% dopo 6h e di 38 ± 4.01% dopo 24h (***p<0.001).

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10.4 ATTIVAZIONE DI 4E-BP1

Di seguito sono riportati i risultati dell’analisi dell’espressione di 4E-BP1, mediante la tecnica del Western Blot. Si può osservare come il grado di fosforilazione di questa proteina

Nel documento SIGNALING DI mTOR COME POSSIBILE NUOVO TARGET NELLA TERAPIA ONCOLOGICA: IMPORTANZA DELL'INIBIZIONE DELL'ASSE mTOR/S6K1/4E-BP1 DA PARTE DI SOSTANZE ATTIVANTI SIRT1 IN CELLULE HELA (pagine 71-119)