CELLULARE
Le Sirtuine dipendono, per la loro attività, dal cofattore NAD+ e quindi la disponibilità di questo composto costituisce un altro elemento importante per la loro regolazione.
Il Nicotinammide Adenina Dinucleotide (NAD+) è un coenzima classico che, insieme alla sua forma ridotta (NADH), media il trasferimento degli ioni idruro in molte reazioni redox metaboliche e che gioca un ruolo chiave anche nella regolazione degli enzimi che lo consumano, tra cui le Sirtuine. La biosintesi del NAD+, mediata in particolare dalla nicotinammide fosforibosiltrasferasi (NAMPT), opera insieme a SIRT1 per regolare il metabolismo e il ritmo circadiano. I livelli di NAD+ diminuiscono durante il processo di invecchiamento, provocando difetti nelle funzioni nucleari e mitocondriali, che portano a diverse patologie associate all’età. Il ripristino di questo coenzima, tramite l’integrazione degli intermedi del NAD+, combinato all’attivazione delle Sirtuine, può migliorare drasticamente questi difetti funzionali associati all’età, contrastando molte malattie dell’invecchiamento [91;92;93;94;95].
Per generare il NAD+, i Mammiferi utilizzano quattro differenti precursori: il triptofano, la nicotinammide, l’acido nicotinico e il riboside della nicotinammide (NR). E’ noto che la via di sintesi del NAD+ predominante nei Mammiferi è costituita dalla via di recupero che inizia dalla nicotinammide, durante la quale il NAMPT produce il nicotinammide mononucleotide (NMN) a partire dalla nicotinammide e dal 5’-fosforibosil-1-pirofosfato; l’NMN, insieme all’ATP, è poi convertito in NAD+. E’ stato dimostrato che il NAMPT è una fosforibosiltrasferasi dimerica di tipo II, che funziona come enzima limitante della velocità di sintesi del NAD+ nei Mammiferi e che regola direttamente l’attività di SIRT1 [96]. Il NAD+ è composto da due mononucleotidi legati covalentemente, la nicotinammide mononucleotide, o NMN, e l’adenosinmonofosfato, o AMP e in tutte le reazioni in cui funziona da cosubstrato per altri enzimi, viene tagliato a livello del legame glicosidico tra la nicotinammide e l’ADP ribosio. In particolare, nella reazione catalizzata dalle Sirtuine, il taglio del NAD+ favorisce la rimozione del gruppo acetilico dalle lisine delle proteine substrato o degli istoni e il suo trasferimento sull’ADP ribosio, dando come prodotti i
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substrati proteici o gli istoni deacetilati, la molecola di 2’-O-acetil-ADP-ribosio e la nicotinammide (NAM) (Fig.3) [95].
Figura 12. Principali vie coinvolte nella regolazione di SIRT1.
Il NAD+ e il NAM costituiscono due elementi chiave nella regolazione di SIRT1. Il NAM, prodotto dalle Sirtuine stesse durante la reazione di deacetilazione, è un inibitore di SIRT1, mentre il NAD+ è il cofattore essenziale per la reazione enzimatica da essa catalizzata. Un altro elemento chiave, in questo contesto, è il NAMPT, che ha il compito di convertire il NAM in NAD+: esso, infatti, aumentando i livelli di NAD+, regola positivamente SIRT1. Inoltre, la deplezione nutrizionale e l’esercizio fisico portano ad un’aumentata produzione di NAMPT e si pensa che la stimolazione della sintesi delle Sirtuine che si osserva in seguito al verificarsi di tali condizioni, possa avvenire proprio tramite questa regolazione [97].
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Per quanto riguarda l’esercizio fisico, è importante sottolineare che quando si ha una riduzione dello stato energetico della cellula conseguente ad uno sforzo fisico, si ha una variazione nella concentrazione dell’adenosina trifosfato (ATP): più precisamente, si osserva un innalzamento dei livelli di adenosina monofosfato (AMP) e un abbassamento dei livelli di ATP. Ciò comporta un aumento nel rapporto tra i due ribonucleosidi, AMP/ATP, che viene percepito dall’enzima AMPK (protein chinasi attivata dall’AMP). Questo è un sensore metabolico che si attiva durante l’esercizio fisico o in condizioni di richiesta energetica ed è coinvolto anche nella regolazione delle Sirtuine. In queste condizioni metaboliche l’attivazione dell’AMPK ripristina l’equilibrio energetico stimolando i processi catabolici che generano ATP (come, ad esempio, l’ossidazione degli acidi grassi) e inibendo quelli anabolici che consumano ATP, ma che non sono fondamentali per la sopravvivenza (come la sintesi dei trigliceridi e delle proteine o la proliferazione cellulare), con lo scopo di ripristinare la riserva di ATP [98].
AMPK e SIRT1 presentano delle analogie nella loro regolazione e nella loro azione su diversi processi, quali il metabolismo cellulare, l’infiammazione e le funzioni mitocondriali e si è visto che queste analogie si verificano, almeno in parte, perché queste due proteine si regolano a vicenda e condividono molte molecole target comuni.
L’AMPK è un eterotrimero costituito da una subunità α, catalitica, e due subunità regolatorie, β e γ; tutte e tre sono richieste per l’attività della proteina. Sulla subunità α sono presenti i siti di fosforilazione, mentre la subunità γ contiene diversi domini che, in condizioni di base, legano l’ATP. Quando una cellula è in deficit energetico e il rapporto AMP/ATP aumenta, l’AMP rimpiazza l’ATP nei legami della subunità γ e ciò causa un cambiamento conformazionale che porta ad un modesto aumento dell’attività di AMPK e alla fosforilazione sulla subunità α, che risulta in un’attivazione molto più consistente dell’enzima stesso, che, a questo punto, può fosforilare svariate molecole (enzimi, attivatori e co-attivatori trascrizionali), con il risultato finale di un ripristino dello stato energetico della cellula. Ci sono due protein chinasi che agiscono a monte di AMPK, fosforilandola: LKB1 (Liver Kinase B1, una serina-treonina chinasi) e CaMKKβ (Calcium/calmoduline kinase kinase- β). LKB1 è la principale chinasi che fosforila AMPK, attivandola, in risposta ad una diminuzione dello stato energetico della cellula, come quella causata dalla privazione di nutrienti o dall’aumento del dispendio energetico (dovuto, ad esempio, all’esercizio fisico). CaMKKβ, invece, fosforila e attiva AMPK in risposta ad un aumento della concentrazione di Ca2+ intracellulare ed espleta la sua azione anche in assenza di LKB1. Una volta attivata,
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AMPK mette in moto un’ampia varietà di eventi che, in misure diverse, portano ad un innalzamento dei livelli di ATP [99;100;101;102].
Tra SIRT1 e AMPK vi è una regolazione reciproca, infatti AMPK può funzionare da attivatore di SIRT1, come dimostrato in alcuni esperimenti in cui si osserva un aumento nell’attività della deacetilasi in seguito all’attivazione di AMPK e ciò può avvenire o tramite la stimolazione del NAMPT o perché l’AMPK può alterare il rapporto tra NAD+ e NADH e così stimolare SIRT1 indipendentemente dal NAMPT. Inoltre, in seguito alla riduzione del rapporto tra NAD+ e NADH si verifica una diminuzione dell’attività sia di SIRT1 sia di AMPK e questo collegamento sembra essere mediato da LKB1. Infatti, in studi condotti su cellule di rene embrionale umano, una sovraespressione di SIRT1 determina una diminuzione nell’acetilazione di alcune lisine su LKB1, permettendo la sua traslocazione dal nucleo al citoplasma, dove la chinasi può associarsi ad altre proteine ed è in grado di fosforilare AMPK, attivandola. Un’altra evidenza di una correlazione tra il meccanismo di segnalazione di SIRT1/LKB1/AMPK si ha dalla dimostrazione che, affinché i polifenoli (come il resveratrolo) possano attivare l’AMPK, è necessaria la presenza sia di SIRT1 sia di LKB1 [103].
Come conseguenza di questo feedback positivo, SIRT1 e AMPK hanno molte funzioni simili nella regolazione del metabolismo energetico: ad esempio sono entrambi sensori primari della carenza di energia e possono, pertanto, stimolare adattamenti metabolici in maniera interdipendente [65].
29 Figura 13. Regolazione dell'AMPK e principali funzioni.
L’AMPK è una proteina importante non solo per la sua azione stimolatrice sulle Sirtuine, ma anche per la sua azione inibitoria su mTOR.
La mTOR (mammalian target of rapamycin) è una serin/treonin-protein chinasi citoplasmatica, che espleta la sua azione lungo la via di trasduzione del segnale PI3K/AKT/mTOR (una via di segnalazione intracellulare importante nella regolazione del ciclo cellulare) e che rappresenta un regolatore centrale della crescita, della proliferazione, della motilità e della sopravvivenza delle cellule, della sintesi proteica, della trascrizione, dell’apoptosi, dell’autofagia e dell’angiogenesi. In associazione con altre proteine, forma i complessi mTORC1 e mTORC2. Le attuali conoscenze indicano che questa chinasi agisce come un interruttore principale nei processi anabolici e catabolici cellulari, regolando il tasso di crescita e la proliferazione cellulare. La disregolazione del segnale di mTORC1 altera il metabolismo corporeo ed è causa di affezioni correlate all’età, diabete, invecchiamento per
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inibizione dell’autofagia (processo necessario al prolungamento della vita che tende a ridursi con il procedere dell’età) e affezioni tumorali in cui la proteina è iper-regolata. Nei tumori maligni la network TOR rappresenta, di conseguenza, un importante target terapeutico. La rapamicina (un antibiotico immunosoppressore) è il primo inibitore selettivo di mTORC1, tuttavia, nel corso degli anni, sono stati scoperti altri inibitori di entrambi i complessi e della via del segnale PI3K/AKT/mTOR, che possono migliorare la risposta biologica, unitamente ad una più completa attività antitumorale.
La via del segnale di mTOR è attivata da nutrienti (glucosio, amminoacidi, acidi grassi), insulina e altri ormoni, fattori di crescita, citochine, mitogeni; altri fattori importanti nell’attivazione di mTOR sono NAM, AKT (o protein chinasi B, PKB) e ERK (extracellular signal-regulated kinase, una MAP chinasi). Al contrario, tale via risulta regolata negativamente dalla ridotta disponibilità di energia (restrizione calorica) che, a sua volta, determina l’attivazione di AMPK e di SIRT1: queste due proteine riducono l’attivazione di mTOR [104;105;106].
Figura 14. Inibizione di mTOR da parte di AMPK.
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a) preserva la funzione delle cellule staminali in numerosi tessuti migliorandone la capacità riparativa e, in ultima analisi, rallentando la progressione di affezioni età-correlate e prolungando la sopravvivenza;
b) previene la moltiplicazione di cellule aberranti.
5 mTOR
La proteina mTOR (mammalian target of rapamycin, bersaglio della rapamicina nei Mammiferi), è una grande serina/treonina protein chinasi che nell’Uomo è codificata dal gene MTOR e che regola la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza delle cellule, la sintesi proteica, l’autofagia e la trascrizione. mTOR è un membro della famiglia delle protein chinasi imparentate alla fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e guida e controlla la transizione delle cellule dallo stato anabolico a quello catabolico.
Questa chinasi integra lo stimolo proveniente da percorsi superiori, inclusi insulina, fattori di crescita e mitogeni e percepisce i nutrienti cellulari, i livelli di energia e lo stato redox. La rapamicina è un immunosoppressore che può inibire la mTOR, associandosi con il suo recettore intracellulare. Il pathway di mTOR appare sregolato in diverse patologie umane, specialmente in alcuni tipi di cancro e infatti questa proteina è oggetto di diversi studi di laboratorio, poiché la sua inibizione farmacologica è risultata essere un potente mezzo per sopprimere la crescita di molti tipi di tumori, come la leucemia, le mielodisplasie, il glioblastoma, il carcinoma mammario, epatico e pancreatico. Oltre alla rapamicina, infatti, sono già stati elaborati alcuni farmaci sperimentali specifici per la mTOR.
mTOR si lega ad altre proteine e funziona come componente principale di due distinti complessi proteici, che regolano diversi processi cellulari. In particolare, in entrambi i complessi mTOR agisce come una serina/treonina protein chinasi e inoltre in uno dei due questa proteina ha anche la funzione di tirosin chinasi e promuove l’attivazione dei recettori dell’insulina e dell’IGF1 (insulin-like growth factor 1) ed è implicata nel controllo e nel mantenimento del citoscheletro di actina [107;108].
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5.1 STORIA
mTOR è il target di una molecola chiamata rapamicina o sirolimus, che è un antibiotico macrolide scoperto come prodotto del batterio Streptomyces Hygroscopicus in un campione di terreno proveniente da Rapa Nui (Isola di Pasqua, da cui il nome rapamicina) e che ha guadagnato attenzione in primo luogo per le sue spiccate proprietà antiproliferative. Nei primi anni Novanta, grazie ad analisi genetiche nel lievito Saccaromyces Cerevisiae, furono identificati i geni TOR1 e TOR2 quali mediatori degli effetti tossici della rapamicina sul lievito. Poco dopo, approcci biochimici nei Mammiferi portarono alla purificazione di mTOR e alla sua scoperta come bersaglio fisico della rapamicina [109]. Questa tossina batterica agisce formando un complesso inibitorio con il proprio recettore intracellulare, la proteina FKBP12 (FK506 binding protein), che si lega a una regione presente all’estremità C-terminale delle proteine TOR, denominata FRB (regione che lega il complesso FKBP12- rapamicina, FKBP12- rapamycin binding), inibendo, così, l’attività di TOR. I genomi dei Mammiferi, così come quelli degli altri Metazoi, codificano per una singola proteina TOR, con struttura simile e che presenta circa il 42% di identità di sequenza amminoacidica con le proteine TOR di lievito [110].
5.2 PROPRIETA’ BIOCHIMICHE
Le proteine TOR sono caratterizzate da un elevato peso molecolare e contengono diversi domini strutturali distinti e conservati. mTOR è costituita da 2549 amminoacidi e anch’essa comprende una serie di domini strutturali conservati.
Figura 15. La struttura primaria di mTOR.
All’estremità N-terminale sono presenti 20 ripetizioni HEAT (dai nomi delle proteine in cui è presente questo dominio: Huntingtina, EF3-elongation factor3, subunità A della proteina fosfatasi2-PP2A, TOR1) in tandem. Ognuna di queste ripetizioni HEAT è formata da due α
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eliche di circa 40 amminoacidi, ciascuna con un pattern specifico di amminoacidi idrofobici e idrofilici; le ripetizioni HEAT in tandem sono presenti in molte proteine e sono responsabili delle interazioni proteina-proteina. La metà C-terminale di mTOR contiene il dominio chinasico, che ha un’omologia di sequenza con il dominio catalitico della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K). Tuttavia, non ci sono evidenze sperimentali che mostrino una sua attività come chinasi lipidica e, anzi, essa è analoga ad altre protein chinasi che possiedono un dominio strutturale di tipo PIK e appartengono ad una famiglia di chinasi dette PIKK (PI3K- related Kinase). Immediatamente a monte del dominio catalitico, si trova il dominio FRB, su cui si va a legare il complesso inibitorio FKBP12-rapamicina; infatti, l’inibizione di mTOR da parte dell’antibiotico macrolide non è diretta, bensì la rapamicina forma prima un complesso con la peptidil prolil isomerasi FKBP12 ed è questo complesso che si lega poi alla chinasi inibendola. Inoltre, mTOR contiene un dominio FAT (da FRAP, ATM, TRAP) relativamente grande, che si trova anche in altre proteine della famiglia PIKK. L’estremità C-terminale presenta un altro dominio FAT, detto FATC, che è assolutamente necessario per l’attività di mTOR: infatti la delezione di anche un singolo amminoacido da questo dominio sopprime l’attività della proteina. Sembrerebbe che i due domini FAT e FATC interagiscano in modo da produrre una configurazione che espone il dominio catalitico. mTOR, infine, contiene un presunto dominio di regolazione negativa (NRD), posto tra il dominio catalitico e il FATC.
Analisi dell’attività di mTOR in vivo e in vitro, hanno rivelato che essa può autofosforilarsi grazie alla sua attività di serin/treonin chinasi intrinseca [104;110].
mTOR, che viene attivata dal pathway della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), si trova al centro delle vie di regolazione della crescita cellulare in tutti gli eucarioti. Attiva nelle cellule diverse molecole bersaglio che stimolano i processi metabolici ed incrementano la sintesi proteica. Regola quest’ultima attraverso la fosforilazione e l’inattivazione del repressore della traduzione dell’mRNA, 4E-BP1 (eukaryotic initiation factor 4E-binding protein, proteina legante il fattore di inizio eucariotico 4E), attivando indirettamente il fattore di inizio della traduzione eIF4E e attivando direttamente delle proteine regolatrici che promuovono l’espressione di geni codificanti subunità ribosomiali. Un altro ruolo di mTOR nella regolazione della sintesi proteica si espleta attraverso la fosforilazione e l’attivazione della chinasi S6 (S6K1), che a sua volta fosforila la proteina ribosomiale S6, accrescendo l’abilità dei ribosomi di tradurre un sottoinsieme di mRNA, la maggior parte dei quali codificanti per componenti ribosomiali [105;111;112]. La fosforilazione di questi due
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effettori a valle è inibita dalla rapamicina in vivo. Inoltre, degli studi hanno messo in evidenza che la sostituzione di un singolo amminoacido nel dominio catalitico di mTOR è sufficiente, in vivo e in vitro, per inibire la sua attività chinasica nei confronti sia di S6K1 sia di 4E-BP1. Perciò, il grado di fosforilazione di queste due proteine è spesso utilizzato come indicazione dell’attività di mTOR in vivo.
Il grado di attivazione delle due proteine TOR di lievito è regolato dai nutrienti. Nei Metazoi, i fattori di crescita e le citochine controllano le vie metaboliche intracellulari: per esempio, nelle cellule dei Mammiferi, i fattori di crescita e le citochine, oltre a regolare l’assorbimento dei nutrienti, stimolano anche vie di segnalazione che agiscono in parallelo o di concerto con i nutrienti e la regolazione di mTOR è probabilmente uno dei migliori esempi di regolazione mediata dai nutrienti evolutivamente conservata [109;110;113;114].
mTOR è una serin/treonin protein chinasi atipica, che appartiene alla famiglia delle chinasi PIKK e interagisce con diverse proteine per formare due distinti complessi, detti mTORC1 (mTOR complex 1) e mTORC2 (mTOR complex2), che hanno sensibilità differenti alla rapamicina e rispondono a diversi stimoli a monte, producendo effetti diversi a valle.
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Entrambi i complessi sono grandi: mTORC1 è costituito da sei e mTORC2 da sette proteine componenti note. Le proteine comuni ai due complessi sono: la subunità catalitica mTOR, mLST8 (mammalian lethal with sec-13 protein 8, conosciuta anche come GβL, proteina simile alla subunità β delle proteine G), DEPTOR (DEP domain containing mTOR- interacting protein) e il complesso Tti1/Tel2. Invece, raptor (regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin) e PRAS40 (proline-rich AKT substrate 40 kDa) sono caratteristiche di mTORC1, mentre rictor (rapamycin-insensitive companion of mTOR), mSin1 (mammalian stress-activated map kinase-interacting protein1) e protor1/2 (protein observed with rictor 1 and 2) si ritrovano solo in mTORC2. Entrambi i complessi sono caratterizzati dall’interazione tra mTOR e le rispettive proteine regolatorie associate, che ne regolano la funzione creando come un’impalcatura per reclutare i substrati dei complessi stessi.
Anche gli effetti della rapamicina su mTORC1 e mTORC2 sono differenti, infatti il complesso (che, nello specifico, è un complesso con guadagno di funzione) che questo antibiotico forma con la proteina FKBP12 interagisce direttamente e inibisce la subunità mTOR solo quando questa si trova all’interno di mTORC1, mentre non ha nessun effetto quando essa fa parte di mTORC2. Inoltre, molte funzioni di mTORC1 sono altamente sensibili alla rapamicina, ma ancora non è chiaro precisamente in che modo il legame di FKBP12-rapamicina inibisca questa attività; la rapamicina potrebbe compromettere l’integrità strutturale di mTORC1 oppure potrebbe ridurre allostericamente la specifica attività del suo dominio chinasico [109;115;116;120].
Figura 17. I diversi segnali a monte e i processi a valle regolati da mTORC1 e
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5.2.1 mTORC1
Tra i due complessi formati da mTOR, mTORC1 è quello meglio caratterizzato e un aspetto notevole di questa porzione del pathway di mTOR è costituito dal numero e dalla diversità dei segnali a monte che tale complesso percepisce.
La via di segnalazione mTORC1 (che fa parte della cascata di trasduzione che coinvolge PI3K/AKT) integra stimoli provenienti da almeno cinque principali fattori intracellulari ed extracellulari, come fattori di crescita, stress, stato energetico, ossigeno e amminoacidi, per controllare molti processi importanti, inclusi la sintesi delle proteine e dei lipidi e l’autofagia. Questo complesso risponde agli amminoacidi, allo stress, all’ossigeno, all’energia e ai fattori di crescita ed è intensamente sensibile alla rapamicina. Promuove la crescita cellulare inducendo ed inibendo i processi catabolici ed anabolici, rispettivamente, e favorisce anche la progressione del ciclo cellulare [117;118;119].
L’eterodimero costituito da TSC1 (tuberous sclerosis 1, anche nota come amartina) e TSC2 (tuberous sclerosis 2 o tuberina) è un regolatore chiave a monte di mTORC1 e funziona come una proteina attivante le GTPasi (GAP) per la GTPasi Rheb (Ras homolog enriched in brain). La forma di Rheb legata al GTP, infatti, interagisce direttamente con mTORC1, stimolando fortemente la sua attività chinasica e, dal momento che TSC1/2 ha la funzione di GAP per Rheb, questo eterodimero regola negativamente mTORC1, convertendo Rheb nella sua forma inattiva legata al GDP. TSC1/2 trasmette molti dei segnali a monte che influenzano mTORC1, inclusi fattori di crescita, come l’insulina e il fattore di crescita insulino-simile 1 IGF1, che stimolano le vie di trasduzione del segnale di PI3K e di Ras (entrambi oncogeni) (Fig.18). Le protein chinasi effettrici di questi pathways, la protein-chinasi B (AKT/PKB), ERK 1/2 (extracellular-signal-regulated kinase 1/2) e la chinasi ribosomiale S6 (RSK1) fosforilano direttamente il complesso TSC1/TSC2, per inattivarlo e attivare, perciò, mTORC1. AKT è anche in grado di modulare mTORC1 in maniera indipendente da TSC1/2, fosforilando PRAS40, un inibitore di mTORC1, e causandone la dissociazione da raptor. Le citochine proinfiammatorie, come TNFα (tumor necrosis factor α), attivano mTORC1 attraverso un meccanismo concettualmente simile ai fattori di crescita: la chinasi IKKβ fosforila TSC1 causando l’inibizione del complesso TSC1/2. Infine, anche il pathway canonico di Wnt, un importante regolatore della crescita cellulare, della proliferazione, della polarità, del differenziamento e dello sviluppo, attiva mTORC1 attraverso TSC1/2; precisamente, la via di segnalazione di Wnt inibisce la glicogeno sintasi chinasi 3β (GSK3-
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β), che normalmente fosforila e promuove l’attività di TSC2 [121;122].
Figura 18. Regolazione a monte di mTORC1 e di mTORC2 e modulazione di vari processi a valle.
Così come gli stimoli derivanti dai fattori di crescita, anche molti tipi di stress agiscono su mTORC1 almeno in parte tramite TSC1/2; tra questi, quelli maggiormente caratterizzati sono i bassi livelli di energia e di ossigeno e il danno al DNA.
L’AMPK, in risposta a ipossia o a uno stato di bassa energia, fosforila TSC2 e fa aumentare