UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Magistrale in
Biologia Molecolare e Cellulare
TESI DI LAUREA
“SIGNALING DI mTOR COME POSSIBILE NUOVO
TAR-GET NELLA TERAPIA ONCOLOGICA: IMPORTANZA
DELL’INIBIZIONE DELL’ASSE mTOR/S6K1/4E-BP1 DA
PARTE DI SOSTANZE ATTIVANTI SIRT1 IN CELLULE
HeLa.”
Relatore:
Candidato:
Prof. Luca Giovannini
Annalisa Picerni
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Indice
1 INTRODUZIONE ... 1
2 SIRTUINE (SIRTs) ... 2
2.1 Storia ... 2
2.2 Proprietà biochimiche e funzioni ... 4
3 SIRTUINA 1 (SIRT1) ... 7 3.1 SIRT1 e p53 ... 10 3.2 SIRT1 e FOXO ... 12 3.3 SIRT1 e Ku70 ... 15 3.4 SIRT1 e NF-κB ... 16 3.5 SIRT1 e TELOMERI ... 18 4 REGOLAZIONE DI SIRT1 ... 20
4.1 REGOLAZIONE ATTRAVERSO L’ESPRESSIONE ... 21
4.2 REGOLAZIONE ATTRAVERSO MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI 22 4.3 REGOLAZIONE ATTRAVERSO LA FORMAZIONE DI COMPLESSI PROTEICI ... 23
4.4 COMPOSTI CHE REGOLANO L’ATTIVITA’ DELLE SIRTUINE ... 24
4.5 REGOLAZIONE ATTRAVERSO IL NAD+ E LO STATO ENERGETICO CELLULARE ... 25 5 mTOR ... 31 5.1 STORIA ... 32 5.2 PROPRIETA’ BIOCHIMICHE ... 32 5.2.1 mTORC1 ... 36 5.2.2 mTORC2 ... 42
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5.3 SIRT1 E mTOR: RECIPROCA INIBIZIONE ... 44
6 SIRT1, mTOR E PATOLOGIA NEOPLASTICA ... 47
6.1 SIRT1 E PATOLOGIA NEOPLASTICA ... 49
6.1.1 SIRT1 COME SOPPRESSORE TUMORALE ... 49
6.2 mTOR COME BERSAGLIO NELLA PATOLOGIA NEOPLASTICA ... 51
7 POLIFENOLI ... 54
7.1 ATTIVITA’ DEI COMPOSTI FENOLICI ... 54
7.2 BERBERINA ... 56 7.2.1 CINETICA ... 58 7.3 QUERCETINA ... 59 7.4 ACIDO FERULICO ... 61 7.4.1 CINETICA ... 62 7.5 TIROSOLO ... 63
7.5.1 EFFETTI DEL TIROSOLO ... 64
8 SCOPO ... 65 9 MATERIALI E METODI ... 66 9.1 COLTURE CELLULARI ... 66 9.2 WESTERN BLOT ... 68 9.3 ANALISI STATISTICA ... 72 10 RISULTATI ... 73 10.1 ESPRESSIONE DI SIRT1 ... 73 10.2 INIBIZIONE DI mTOR ... 79 10.3 INIBIZIONE DI S6K1 ... 84 10.4 ATTIVAZIONE DI 4E-BP1 ... 89 11 DISCUSSIONE ... 94 12 CONCLUSIONI ... 96 13 BIBLIOGRAFIA ... 97
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RIASSUNTO
INTRODUZIONE: Le nuove conoscenze sui meccanismi coinvolti nel processo di
trasformazione e progressione tumorale ed il riconoscimento delle proteine coinvolte nella regolazione di questi processi, hanno aperto una nuova era nella formulazione e nella valutazione clinica di nuovi farmaci, le cosiddette terapie mirate. Le proteine che regolano la proliferazione, la differenziazione, l’apoptosi e l’invasività cellulare sono alla base della trasformazione neoplastica e sono il bersaglio di questo nuovo approccio terapeutico. Tra queste vi è la via di trasduzione del segnale PI3K/AKT/mTOR sulla quale attualmente si sta concentrando l’attenzione del mondo scientifico con particolar interesse per la chinasi mTOR. mTOR regola i processi di traduzione proteica in risposta a fattori di crescita e nutrienti fosforilando componenti di macchinari traduzionali come p70S6K e il repressore traduzionale 4E-BP1. Le attuali conoscenze indicano che la disregolazione del segnale mTORC1 altera il metabolismo corporeo ed è causa di affezioni età correlate, diabete, invecchiamento e affezioni tumorali in cui la proteina è iper-regolata. Nei tumori maligni il network TOR rappresenta, di conseguenza, un importante target terapeutico. D’altra parte, nel corso degli anni, molti altri studi si sono concentrati sulla relazione tra sirtuine e cancro, rivelando come anche queste proteine hanno un ruolo importante nelle affezioni tumorali. SIRT1, infatti, è in grado di migliorare la stabilità genetica e portare alla soppressione tumorale soprattutto grazie alla sua interazione con fattori oncogeni come mTOR.
SCOPO: Molti studi hanno confermato che il sistema sirtuinico e il pathway di mTOR sono
implicati entrambi nel processo di tumorigenesi, ruolo avvalorato dalla relazione di reciproca inibizione esistente tra queste due proteine. Per questo negli ultimi anni si è assistito ad un grande incremento degli studi volti alla ricerca di meccanismi o sostanze che fossero in grado di potenziare l’attivazione di SIRT1 e parallelamente di inibire mTOR. Sulla base di queste premesse, questa tesi sperimentale si pone come scopo generale la valutazione dell’effetto di diverse sostanze naturali attivanti SIRT1 sull’ASSE mTOR/S6K1/4E-BP1.
MATERIALI E METODI: Le linee cellulari utilizzate in questo lavoro sperimentale sono
le HeLa, cellule tumorali immortalizzate, isolate da un cancro della cervice uterina, altamente stabilizzate e molto più resistenti delle altre cellule tumorali. Le sostanze utilizzate per i trattamenti sono la Berberina (5-10 μM), l’Acido Ferulico (25-50 μM), il Tirosolo (10-20 μM) e la Quercetina (10-25 μM). Le cellule sono state seminate in piastre da 12 well (100.000 cell/well) e trattate con le sostanze sopra citate, a due diverse concentrazioni. Il
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loro effetto potenzialmente attivante o inibente è stato valutato a tre diversi tempi sperimentali, dopo 3, 6 e 24 ore di stimolazione. L’espressione di SIRT1 e l’inibizione di mTOR, S6K1 e 4E-BP1 sono state valutate mediante tecnica del Western Blot.
RISULTATI: I risultati dei nostri esperimenti mettono in evidenza che tutte le 4 diverse
sostanze testate sono in grado di stimolare l’espressione di SIRT1. Più precisamente, si può osservare come l’espressione di SIRT1 sia significativamente aumentata in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo controllo (p≤0,001). Inoltre, tutte le 4 sostanze testate determinano un decremento statisticamente significativo (p≤0,001) di mTOR, di S6K1 e di 4EB-P1 a tutti i tempi sperimentali considerati.
CONCLUSIONI: I risultati del presente lavoro di tesi evidenziano che le sostanze testate
non solo sono in grado di attivare SIRT1, ma soprattutto sono in grado di inibire l’asse mTOR/S6K1/4E-BP1, importante target nella terapia oncologica. L’importanza di questi risultati è avvalorata dal ruolo di queste proteine nelle affezioni tumorali, suggerendo come in futuro potrebbe risultare fondamentale l’applicazione farmacologica preventiva o curativa delle suddette sostanze in tali disordini.
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1 INTRODUZIONE
Le nuove conoscenze sui meccanismi coinvolti nel processo di trasformazione e progressione tumorale ed il riconoscimento delle proteine coinvolte nella regolazione di questi processi hanno aperto una nuova era nella formulazione e nella valutazione clinica di nuovi farmaci, le cosiddette terapie mirate. Le proteine che regolano la proliferazione, la differenziazione, l’apoptosi e l’invasività cellulare sono alla base della trasformazione neoplastica e sono il bersaglio di questo nuovo approccio terapeutico. I maggiori sforzi si sono concentrati nel trattamento delle neoplasie più frequenti, quali il tumore della mammella, del colon-retto e del polmone, ma anche nel trattamento di tumori meno frequenti, come il carcinoma del rene. Alcuni di questi farmaci innovativi sono oggi comunemente utilizzati nel trattamento delle leucemie come la leucemia mieloide cronica. Lo studio di alcuni aspetti della biologia molecolare, come fattori di crescita, molecole coinvolte nella trasduzione del segnale, angiogenesi, apoptosi, invasività e ciclo cellulare ha consentito di identificare nuovi bersagli farmacologici in grado di interferire con eventi chiave della trasformazione e della proliferazione della cellula neoplastica. Come le cellule normali, la maggior parte delle cellule neoplastiche utilizza molteplici vie di segnalazione intracellulare al fine di assicurare il mantenimento e l’attività di funzioni critiche per la loro sopravvivenza. Le proteine che, quindi, preservano la funzione, la sopravvivenza, la proliferazione ed i recettori espressi sulla superficie cellulare possono costituire il bersaglio di nuove forme di terapia mirata. Le nuove linee di ricerca farmacologica si sono quindi rivolte all’identificazione di agenti (terapia target) in grado di interferire in maniera selettiva contro bersagli molecolari specifici, al fine di aumentare la selettività del bersaglio e di ridurne gli effetti collaterali sistemici. Tra le nuove vie bersaglio prese in considerazione vi è la via di trasduzione del segnale PI3K/AKT/mTOR sulla quale attualmente si sta concentrando l’attenzione del mondo scientifico con particolar interesse per la chinasi mTOR. mTOR regola i processi di traduzione proteica in risposta a fattori di crescita e nutrienti fosforilando componenti di macchinari traduzionali come p70S6K e il repressore traduzionale 4E-BP1. Le attuali conoscenze indicano che la disregolazione del segnale mTORC1 altera il metabolismo corporeo ed è causa di affezioni età correlate, diabete, invecchiamento e affezioni tumorali in cui la proteina è iper-regolata. Nei tumori maligni il
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network TOR rappresenta, di conseguenza, un importante target terapeutico. D’altra parte, nel corso degli anni molti altri studi si sono concentrati sulla relazione tra sirtuine e cancro, rivelando come anche queste proteine hanno un ruolo importante nelle affezioni tumorali. SIRT1, infatti, è in grado di migliorare la stabilità genetica e portare alla soppressione tumorale, soprattutto grazie alla sua interazione con fattori oncogeni come mTOR.
2 SIRTUINE (SIRTs)
2.1 StoriaLe Sirtuine (SIRTs) costituiscono una famiglia di proteine ad attività deacetilasica NAD+ -dipendenti in grado di deacetilare proteine istoniche e diversi fattori trascrizionali. Originariamente vennero identificate come appartenenti al gruppo di proteine MAR1 (Mating-Type Regulator 1) capaci di agire sulla repressione e/o attivazione genica; Klar e colleghi [1] scoprirono MAR1 in virtù di una mutazione spontanea che causava sterilità in Saccharomyces Cerevisiae. Successivamente venne conferito alle sirtuine un importante ruolo biochimico e molecolare nel lievito Saccharomyces Cerevisiae da cui derivò il nome di SIR2 (Silent Information Regulator 2) [2]. Gottlieb e Esposito [3] dimostrarono, dieci anni dopo questa iniziale scoperta, che Sir2 era l’unico gene SIR richiesto per sopprimere la ricombinazione tra le 100-200 copie di geni codificanti RNA ribosomale ripetuti in tandem sul cromosoma XII. Dal 1991, grazie soprattutto al lavoro di Gottschling e colleghi [4], era anche noto che Sir2 era in grado di silenziare alcuni geni posti in prossimità dei telomeri. Due anni più tardi, Braunstein et al. dimostrarono che regioni silenti poste al livello dei telomeri e loci mating-type risultavano associate a istoni relativamente ipoacetilati al livello del gruppo ε-amino di residui di lisina N-terminali [5]. Una overespressione di Sir2 causava una notevole deacetilazione degli istoni, una caratteristica in più che distingueva Sir2 dagli altri geni SIR. Nel 1995, Brachman et al. [6] e Derbyshire et al. [7] individuarono in S.Cerevisiae la presenza di altri quattro geni omologhi a SIR2 che chiamarono HST 1-4 (homologues of Sir2). Successivamente Sir2 venne identificata nel moscerino della frutta (Drosophila Melanogaster) e nel verme Caenorhabditis Elegans. In questi organismi Sir2 è coinvolta nella regolazione di vari pathway metabolici inclusi quelli riguardanti l’invecchiamento e la longevità. Le SIRTs hanno guadagnato nel tempo una notevole attenzione in campo medico grazie al loro ruolo di sensori metabolici e di mediatori della
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sopravvivenza cellulare in condizioni di stress, quali ad esempio la restrizione calorica e l’esercizio fisico, nelle quali la loro trascrizione risulta attivata.
Questi enzimi, infatti, hanno un ruolo chiave nella regolazione di molti aspetti del metabolismo cellulare, da quello energetico a quello di sintesi, modulano la trascrivibilità genica della cromatina e regolano l’attività di diversi fattori trascrizionali. Le Sirtuine sono coinvolte nei processi metabolici che ritardano l’invecchiamento e aumentano la durata della vita, nella regolazione del ciclo cellulare, nell’inibizione dell’apoptosi, nell’omeostasi del glucosio e nella secrezione dell’insulina. Come conseguenza di ciò, la caratterizzazione dei meccanismi molecolari, biochimici e fisiologici coinvolti negli effetti delle Sirtuine è importante non solo per meglio definire il loro ruolo fisiologico e/o patologico ma anche per l’identificazione di nuovi potenziali target farmacologici nei disordini metabolici, nel diabete, nell’obesità, nelle patologie cardiovascolari ed in quelle neoplastiche. A questo proposito, oggi molti studi si stanno concentrando sulla ricerca di meccanismi o sostanze in grado di potenziare l’attivazione di queste proteine [3;4;5;6;7].
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2.2 Proprietà biochimiche e funzioni
Le Sirtuine sono presenti sia negli Eucarioti che nei Procarioti. Negli Eucarioti la famiglia delle Sirtuine è costituita da sette proteine (SIRT1–SIRT7). Le analisi filogenetiche classificano le SIRTs in base alla sequenza amminoacidica: quattro classi per gli Eucarioti (I-IV), più la classe U dei Procarioti.
In particolare, per gli Eucarioti la prima classe comprende SIRT1-SIRT3, la seconda classe SIRT4, la terza classe SIRT5 e la quarta classe SIRT6 e SIRT7 [8;9;10;11;12].
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Negli Eucarioti un’ulteriore classificazione viene fatta in base alla localizzazione cellulare ed alla loro funzione.
A questo proposito, SIRT1 è localizzata nel nucleo ma sotto particolari stimoli può essere traslocata nel citoplasma mentre SIRT2, sebbene sia considerata una proteina citoplasmatica, in alcune fasi del ciclo cellulare può avere una localizzazione nucleare. A loro volta SIRT4, SIRT5 e SIRT3 si trovano nei mitocondri, SIRT6 nel nucleo mentre SIRT7 nel nucleolo. Per quanto riguarda la funzione tutte hanno un’attività deacetilasica ad eccezione di SIRT4, la quale ha esclusivamente un’attività monoribosiltransferasica, e di SIRT6 che può svolgere entrambe le attività enzimatiche [13;14;15].
Le SIRTs costituiscono una famiglia di proteine deacetilasiche NAD+- dipendenti, ovvero enzimi che rimuovono il gruppo acetilico da residui di lisina di substrati proteici o di istoni in presenza del cofattore NAD+ (nicotinammide adenindinucleotide). I prodotti di questa reazione sono la nicotinammide (NAM), il substrato proteico o istonico deacetilato sui residui lisinici, e la molecola 2’-O-acetil-ADP-ribosio, in grado di acetilare proteine istoniche e diversi fattori trascrizionali [16;17;18].
Figura 3. Reazione di deacetilazione catalizzata dalle Sirtuine
E’ stato dimostrato che questi enzimi sono anche in grado di agire come delle mono ADP- ribosiltrasferasi NAD+-dipendenti e ciò lega inevitabilmente la loro attività al metabolismo cellulare. Per quanto riguarda il meccanismo di reazione, la deacetilazione e la ADP-ribosilazione operate dalle sirtuine sono simili, in quanto esse tagliano il NAD+ ad ogni ciclo di reazione, producendo il 2’-O-acetil-ADP-ribosio, che può svolgere un ruolo di
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regolazione importante in altri processi fisiologici. Ad oggi sono noti più di una dozzina di substrati di deacetilazione non istonici.
Figura 4. Deacetilazione e ADP-ribosilazione mediate dalle Sirtuine.
Dal momento che nella catalisi operata dalle sirtuine la deacetilazione di un residuo di lisina è accompagnata dall'idrolisi di una molecola di NAD+, in una reazione che, pertanto, è dipendente da tale coenzima ossidoriduttivo e, poiché il rapporto tra la forma ossidata (NAD+) e la forma ridotta (NADH) del cofattore è determinato dallo stato nutrizionale della cellula, questi enzimi collegano direttamente il signaling metabolico cellulare allo stato di modificazioni post-traduzionali delle proteine. In più, oltre ad influenzare il rapporto NAD+/NADH, la reazione catalizzata dalle sirtuine è anche regolata da uno dei suoi prodotti, la nicotinammide, che è un inibitore non competitivo delle sirtuine stesse. L'altro prodotto della reazione, il 2'-O-acetil-ADP-ribosio, sembra invece facilitare la formazione e il silenziamento dell'eterocromatina, regolare i canali ionici e modulare lo stato redox della cellula.
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3 SIRTUINA 1 (SIRT1)
Tra tutte le Sirtuine quella che ha ricevuto la maggior attenzione e su cui si è focalizzata la maggior parte delle ricerche è la Sirtuina 1 (SIRT1) [19;20;21;22].
SIRT1 è localizzata prevalentemente nel nucleo ma, in risposta a particolari stimoli o condizioni fisiologiche, può essere traslocata nel citoplasma grazie ad un segnale di esportazione nucleare (NES) e ritornare nuovamente nel nucleo attraverso un segnale di localizzazione nucleare (NLS). Dal punto di vista strutturale, la SIRT1 umana contiene il dominio catalitico altamente conservato delle sirtuine e entrambe le estensioni N- e C- terminali che si estendono per circa 240 amminoacidi. Queste estensioni fungono da piattaforme per l’interazione con proteine regolatorie e vari substrati. In totale, la SIRT1 umana è costituita da 747 amminoacidi (Fig.5) e contiene al suo interno due segnali di localizzazione nucleare (NLS) e due segnali di esportazione nucleare (NES) [12]. La funzionalità bilanciata di questi segnali determina la presenza di SIRT1 sia nel compartimento nucleare che in quello citoplasmatico.
8 Tabella1. Riassunto dei vari domini della SIRT1 umana
Regioni/Amminoacidi Funzioni
Dominio di omologia sirtui-nico aa 244-498 Attività enzimatica Segnale di Localizzazione Nucleare NLS1 (aa 34-44) NLS2 (aa 232-239) Importazione nucleare
Segnale di Esportazione Nu-cleare NES1 (aa 146-?) NES2 (aa 435-443) Esportazione nucleare Fosforilazione (mediata da JNK1) Ser27, Ser47, Thr530 (mediata da Ciclina/cdk1) Thr530, Ser540
Specifica attivazione verso H3, ma non p53
Aumenta l’attività deaceti-lasica
Sumoilazione Lys734 Aumenta l’attività deaceti-lasica
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SIRT1 è implicata in molti processi cellulari come il metabolismo lipidico e glucidico, la biogenesi mitocondriale, l’infiammazione, l’autofagia, il ritmo circadiano, la resistenza allo stress e il silenziamento cromatinico [23;24;25;26;27].
La sua prima funzione ad essere scoperta fu quella di istone deacetilasi, ma successivamente a questa si affiancò anche la capacità di deacetilare altre proteine target, in particolare fattori di trascrizione, con conseguente azione sull’espressione genica [28;29;30].
Nella maggior parte dei casi questi fattori regolano l’espressione di geni legati al ciclo cellulare, alla crescita, all’apoptosi e al metabolismo energetico. Alcuni possono essere regolati positivamente dall’azione di SIRT1 altri, invece, negativamente.
Esempi di target di SIRT1 sono p53, FOXO, PPARγ, HSF1, Ku70, PGC-1α e NF-KB [31;32].
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3.1 SIRT1 e p53
Uno dei target non istonici più importanti che sono stati descritti per la SIRT1 umana e murina è la proteina tumorale p53, un fattore di trascrizione che regola il ciclo cellulare e ricopre la funzione di oncosoppressore. Quest'ultimo ha una funzione particolarmente importante nel sopprimere i tumori nascenti negli organismi pluricellulari, agendo come effettore del danno al DNA: lo rileva e può arrestare la progressione del ciclo cellulare nelle fasi G1 o G2, finché il danno non sia stato riparato; se ciò non è possibile, p53 induce la cellula ad uccidere se stessa. Questa proteina è definita “guardiano del genoma”, proprio per il suo ruolo di preservatore della stabilità genomica attraverso la prevenzione delle mutazioni. In condizioni normali p53 è solitamente inattiva, grazie al legame con la proteina con funzione di ubiquitina ligasi MDM2, che la inibisce e ne promuove la degradazione ad opera del proteasoma. Ciò fa sì che nelle cellule normali i livelli di p53 siano molto bassi, proprio a causa dell'instabilità della proteina [33;34;35].
p53 è un fattore di trascrizione che regola l’espressione di un gran numero di geni ed è fondamentale, dal momento che, in caso di danno al DNA, deve bloccare la cellula: ha infatti un ruolo importante non solo nel mediare l’arresto del ciclo cellulare, ma anche nel favorire il riparo del DNA, la senescenza e l’apoptosi ed è estremamente sensibile a stress genotossici. Tuttavia, molti altri segnali possono attivare tale oncosoppressore, come una impropria proliferazione cellulare indotta da attivazione di oncogeni, l’erosione dei telomeri, la deprivazione di nutrienti e l’ipossia. Tutti questi segnali conducono ad una stabilizzazione di p53, che, pertanto, viene rapidamente accumulata ed attivata [36;37]. Gli eventi regolatori che influenzano la stabilità, l'attività e il grado di attivazione del “guardiano del genoma”, pur essendo diversi a seconda del tipo di danno, derivano in parte da modifiche post-traduzionali, quali la fosforilazione, l'ubiquitinazione e l'acetilazione. Per esempio, è proprio la fosforilazione nel dominio di legame con MDM2 a determinare la perdita di affinità di p53 per l'ubiquitina ligasi, e quindi la sua stabilizzazione, in caso di danno al DNA; inoltre, l'acetilazione a livello del dominio di tetramerizzazione fa sì che l'oncosoppressore possa attivarsi come fattore trascrizionale. Ciò porta all'attivazione di geni che bloccano il ciclo cellulare, geni del riparo del DNA o geni che mandano la cellula in apoptosi. Se qualcosa non funziona durante tali processi, il materiale genetico danneggiato si replica comunque, producendo mutazioni che trasformano una cellula normale in una cellula tumorale, ma l'oncosoppressore p53 ha un ruolo fondamentale nell'evitarlo [38;39].
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Figura 7. Inibizione di p53 mediante formazione
di un complesso con MDM2.
Molti tipi di stress, quindi, possono promuovere l'acetilazione di p53, che può avvenire ad opera di un gran numero di fattori, tra cui CBP/p300 e PCAF (fattore associato a CBP/p300); inoltre è proprio l'acetilazione di p53 a favorirne il legame al DNA, la sua attività trascrizionale e l'induzione dell'arresto del ciclo cellulare. In aggiunta, i danni al DNA potenziano l'acetilazione di p53 sul residuo di lisina in posizione 120 (Lys120), tappa essenziale per l'avvio dell'apoptosi attraverso l'attivazione della via BAX e PUMA. La reversione dell'acetilazione, mediante deacetilazione, può anch'essa modulare la funzione di p53, indebolendone gli effetti biologici. Infatti, questa proteina possiede nella regione C-terminale vari potenziali siti di acetilazione, su residui di lisina, dove SIRT1 può espletare la sua attività catalitica. La p53 acetilata attiva il programma trascrizionale con aumento della proliferazione cellulare e dell'apoptosi. Nelle cellule tumorali e cancerogene, infatti, questo fattore di trascrizione è iperacetilato [40;41;42].
Un altro processo regolatorio in cui si è osservato che p53 e SIRT1 agiscono di concerto è quello che vede coinvolto anche il repressore trascrizionale HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1): SIRT1 e HIC1 formano un complesso che comporta una riduzione dell'espressione di SIRT1 ed attenua le risposte apoptotiche dipendenti da p53. D'altra parte,
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p53 è in grado di transattivare la trascrizione di HIC1 e quindi le tre proteine agiscono in un complesso ciclo a feedback. In normali condizioni fisiologiche HIC1 reprime SIRT1, promuovendo l'attività di p53 e l'apoptosi in caso di stress. Tuttavia, in cellule che hanno subìto un danno al DNA p53 non attiva HIC1, il che induce la trascrizione di SIRT1 e promuove la sopravvivenza cellulare. E' stato ipotizzato, inoltre, che l'ipermetilazione di HIC1 osservata durante l'invecchiamento può portare ad un incremento dell'espressione di SIRT1, che può deacetilare p53 ed aumentare il rischio cellulare di trasformazioni neoplastiche e tumorigenesi [30].
SIRT1 e p53 sono, pertanto, intimamente legate: non solo si associano fisicamente, ma ciascuna regola anche l'attività dell'altra. E' stato infatti dimostrato che SIRT1 è in grado di deacetilare molteplici residui di lisina su p53, sia in topo sia nell'uomo e anche questa deacetilazione dipendente da SIRT1 inibisce l'attività di transattivazione di p53 e sopprime l'apoptosi in risposta allo stress ossidativo e al danno al DNA [30]. In vitro e in vivo, in modelli animali, l'iperespressione di SIRT1 rallenta, infatti, la proliferazione cellulare e inibisce l'apoptosi mediante la deacetilazione di p53 (ma potrebbero essere coinvolti anche altri meccanismi di regolazione di p53 da parte di SIRT1, oltre alla deacetilazione), indicando SIRT1 come un potenziale bersaglio di farmaci antitumorali [43;44;45].
3.2 SIRT1 e FOXO
Un'altra classe di interattori attraverso cui SIRT1 sembra controllare la risposta cellulare allo stress è costituita dai fattori di trascrizione FOXO (Forkead box class O), una famiglia di proteine che funzionano come sensori della via di segnalazione dell’insulina e come regolatori della longevità dell’organismo [46] e che sono coinvolte, ad esempio, in un pathway alternativo tramite cui SIRT1 incrementa la sopravvivenza cellulare [30]. Questi fattori trascrizionali appartengono alla grande famiglia chiamata Forkhead (FOX) e hanno un ruolo importante nel regolare l'espressione dei geni coinvolti nella crescita cellulare, nella proliferazione, nel differenziamento e nella durata della vita. Il tratto caratteristico che definisce le proteine FOX è una sequenza conservata che va da 80 a 100 amminoacidi, che costituisce la regione del dominio di legame al DNA e che ha una peculiare forma ad “ali di farfalla” [47;48;49].
Alcuni geni FOX fungono da target a valle della via di segnalazione di hedgehog, che ha un ruolo nello sviluppo dei carcinomi delle cellule basali.
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La grande famiglia Forkhead è suddivisa in sottogruppi, la cui classificazione viene fatta su base alfabetica. I membri del sottogruppo regolato dalla via del segnale di AKT vengono denominati FOXO, in quanto appartenenti al sottogruppo “O”; queste proteine regolano il metabolismo, la proliferazione cellulare, la tolleranza allo stress e probabilmente la durata della vita. L'attività delle proteine FOXO è regolata dalle modificazioni post-traduzionali, incluse la fosforilazione, l'acetilazione e l'ubiquitinazione.
Si distinguono quattro proteine appartenenti alla classe FOXO (FOXO1, 3, 4 e 6) coinvolte in varie funzioni cellulari, quali la risposta allo stress ossidativo, la regolazione del ciclo cellulare, la riparazione dei danni al DNA, il metabolismo del glucosio, la risposta all’insulina e la morte cellulare programmata (apoptosi). Le regolazioni post-traduzionali delle proteine FOXO insieme a diverse interazioni proteina-proteina ne modulano l’attività trascrizionale e la localizzazione nella cellula. Nel nucleo FOXO controlla in senso attivatorio o inibitorio l’espressione di diversi geni, mentre nel citoplasma è inattivo e va incontro a degradazione ad opera del sistema ubiquitina-proteasoma. Ognuna delle sue funzioni specifiche è attivata in risposta a stimoli che inducono un’appropriata modificazione post-traduzionale, in conseguenza di precisi segnali extracellulari oppure in base allo stato energetico/nutrizionale della cellula [50;51].
Il principale meccanismo di regolazione di FOXO è la fosforilazione; in condizioni Figura 8.Meccanismo di regolazione di FOXO tramite AKT.
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fisiologiche questa proteina si trova nel citoplasma, dove è inattiva, mentre la sua presenza all’interno del nucleo in forma attiva sarebbe favorita dall’assenza di segnali di crescita. La traslocazione dal nucleo al citoplasma comporta la fosforilazione del fattore di trascrizione, che avviene in seguito all’attivazione di PI3K. Tale evento causa la fosforilazione di AKT e la sua traslocazione all’interno del nucleo, dove questa chinasi è in grado di fosforilare a sua volta, inattivandole, le proteine FOXO ivi presenti.
L’attività di FOXO può essere ulteriormente modulata mediante rilocalizzazione sia nel citoplasma sia nel nucleo, regolandone la capacità di legare il DNA. Esiste, infatti, oltre alla fosforilazione, un secondo livello di regolazione nucleare basato sull’acetilazione di specifici residui di lisina, che va a modificare le proprietà di legame della proteina al DNA. L’aggiunta di gruppi acetile avviene ad opera delle acetil-transferasi HAT (Hystone Acetyl-Transferase), tra cui svolgono un ruolo predominante CBP (CREB Binding Protein) e p300; la deacetilazione, invece, viene svolta dalle deacetilasi HDAC (Hystone Deacetylase) e da SIRT1. In seguito ad uno stress cellulare, infatti, l’aumento di espressione di SIRT1 provoca la deacetilazione del fattore di trascrizione FOXO e quindi la sua attivazione, con conseguente incremento nell’espressione di geni coinvolti nella resistenza allo stress, nel rallentamento del ciclo cellulare e nell’inibizione dell’apoptosi (Fig.8) [52;53].
Inoltre, il motivo di legame dell’isoforma FOXO1 a SIRT1 sembra essere indispensabile per la sua stessa regolazione trascrizionale. Diversi studi hanno evidenziato che SIRT1 influenza le funzioni di FOXO3 nelle cellule di Mammifero, tra cui neuroni e fibroblasti, riducendo l’apoptosi in seguito a stimoli di stress, ma aumentando l’espressione di geni necessari per la riparazione del DNA e per i checkpoint del ciclo cellulare. Ancora, si è osservato che il trattamento con perossido di idrogeno induce l’acetilazione di FOXO4, riducendo il suo potenziale di transattivazione, ma questa soppressione regredisce in seguito all’interazione con SIRT1, che pertanto migliora le difese cellulari contro lo stress ossidativo, tramite l’espressione delle proteine che portano all’arresto della crescita cellulare e al riparo del DNA. Oltre a ciò, è stato dimostrato che SIRT1, tramite la sua interazione con FOXO4, sopprime la funzione delle proteasi pro-apoptotiche caspasi-3 e caspasi-7 in cellule epiteliali trasformate, ma non in quelle non trasformate [30].
L’isoforma FOXO1 è coinvolta nel meccanismo di trasduzione intracellulare dell’insulina. L’insulina, tramite l’enzima AKT, regola l’espressione di diversi enzimi gluconeogenici e lipogenici, mediante il controllo dell’attività di FOXO1, che si trova soprattutto nei tessuti responsivi all’insulina, quali il fegato, il tessuto adiposo e le β-cellule pancreatiche.
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L’acetilazione di FOXO1 a livello di residui lisinici induce la sua traslocazione dal nucleo al citoplasma, inibendo l’attivazione degli enzimi gluconeogenici e favorendo l’attivazione dei geni coinvolti nella glicolisi. In condizioni di digiuno prolungato o di restrizione calorica, la sovraespressione e l’attivazione di SIRT1 inducono, invece, la deacetilazione di FOXO1, che ritorna nel nucleo e favorisce la gluconeogenesi, inibendo la glicolisi.
Pertanto, è fondamentale il ruolo di SIRT1 anche nella regolazione del metabolismo energetico cellulare [54;55;56].
3.3 SIRT1 e Ku70
Come già detto, nell’ambito dei processi che si attivano in risposta a un danno al DNA, SIRT1 deacetila la proteina p53 e ne attenua l’abilità come fattore di trascrizione, riducendo la risposta cellulare apoptotica. Di conseguenza, la sovraespressione di SIRT1 incrementa la sopravvivenza cellulare in condizioni che inducono danno al DNA. Tutto ciò suggerisce la possibilità che i segnali generati durante la riparazione del DNA siano guidati da SIRT1 che agisce sulla p53 acetilata. Degli studi, infatti, hanno messo in luce un’evidenza funzionale del coinvolgimento di SIRT1 nella riparazione del DNA in risposta alle radiazioni e hanno portato ad individuare il substrato di SIRT1, ovvero la proteina ingaggiata dalla deacetilasi durante questo processo. La modulazione dell’attività di riparazione del DNA da parte di SIRT1 sembra essere connessa alla deacetilazione delle proteine Ku70.
Ku70, insieme ad un’altra proteina (Ku80) costituisce un eterodimero e in questa forma si lega alle estremità delle rotture di DNA a doppio filamento e svolge un ruolo fondamentale nel pathway di riparazione del DNA del tipo NHEJ (Non Homologous End Joining). Inoltre, è richiesta per il mantenimento della lunghezza telomerica e per il silenziamento dei geni subtelomerici [57].
In diversi esperimenti si è osservato che Ku70 co-localizza con SIRT1 a livello del DNA ripetuto alle estremità telomeriche, viene reclutato con SIRT1 sui siti di rottura dei cromosomi e che queste due proteine interagiscono tra loro formando un complesso, nel quale SIRT1 deacetila Ku70. Tutto ciò, unito all’evidenza che l’acetilazione di Ku70 accelera la morte cellulare in condizioni di esposizione ad agenti genotossici, suggerisce che SIRT1 possa incrementare la capacità di riparazione del DNA proprio tramite la deacetilazione della proteina Ku70. Infatti, un modello per la modulazione funzionale di Ku70 ad opera di SIRT1 prevede che lo stato di acetilazione di Ku70 possa influenzare il
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destino della cellula in condizioni che inducono danno al DNA: l’acetilazione di Ku70 ad opera di CBP o PCAF accelera la morte cellulare, la sua deacetilazione ad opera di SIRT1 promuove la sopravvivenza cellulare tramite un aumento dell’attività di riparazione del DNA (Fig.9). Questo scenario potrebbe costituire una base plausibile per il meccanismo di promozione della sopravvivenza cellulare: in condizioni di danno al DNA, SIRT1 influisce sulla modulazione dell’attività di riparazione, tramite cicli di acetilazione-deacetilazione della proteina Ku70 e conseguentemente favorisce la sopravvivenza cellulare. Pertanto, la formazione di complessi tra SIRT1 e Ku70 può avere un profondo effetto nel superamento di pericolosi cambiamenti ambientali prodotti da condizioni di stress (come rotture a livello della doppia elica), in tal modo estendendo la durata della vita.
Inoltre, l’osservazione che SIRT1 deacetila diversi substrati coinvolti nella risposta al danno del DNA, inclusi p53, FOXO, NF-κB, oltre a Ku70, suggerisce che questo enzima possa interconnettere tra loro vari pathway di risposta al danno al DNA tramite la sua attività di deacetilasi [57;58;59].
Figura 9. Modello della modulazione funzionale della proteina del riparo Ku70 ad opera di SIRT1.
3.4 SIRT1 e NF-κB
Il fattore nucleare NF-κB (Nuclear Factor Kappa-light-chain- enhancer of activated B cells) è un complesso proteico funzionante come fattore di trascrizione pleiotropico, sequenza-specifico, che regola molti pathways cellulari, fornendo un meccanismo attraverso cui la cellula è in grado di rispondere a un’ampia varietà di stimoli e sfide ambientali. NF-κB regola l’espressione di prodotti genici che influenzano processi cellulari importanti, quali
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l’adesione, il ciclo cellulare, l’angiogenesi e l’apoptosi, gioca un ruolo chiave nella regolazione della risposta immunitaria alle infezioni e sue disfunzioni sono state collegate al cancro (come il mieloma multiplo), ai processi infiammatori, alle patologie autoimmuni, agli shock settici, alle infezioni virali e alle malattie del sistema immunitario [60;61].
L’attivazione aberrante dell’NF-κB è frequentemente osservata in molte forme tumorali, al contrario la sua soppressione limita la proliferazione delle cellule tumorali.
NF-κB è costituito da omo- o eterodimeri formati da una famiglia di cinque fattori di trascrizione: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-κB1 (p105/p50) e NF-κB2 (p100/p52); i dimeri sono caratterizzati da una regione di legame al DNA e da un dominio di transattivazione. Questo fattore nucleare regola l’espressione di un’ampia varietà di geni coinvolti nella risposta immunitaria e infiammatoria, nella proliferazione e nel differenziamento cellulare [62]. Nello stato inattivato, NF-κB è localizzato nel citosol in forma di eterodimero ed è legato alla proteina inibitoria IκB, che ne maschera la sequenza di localizzazione nucleare (NLS). Tramite il coinvolgimento degli specifici recettori integrali di membrana, una varietà di segnali extracellulari può attivare l’enzima IκB chinasi (IKK), che, a sua volta, fosforila la proteina IκB, portando alla sua ubiquitinazione e degradazione da parte del proteasoma. In questo modo NF-κB è reso disponibile ed attivo, viene traslocato nel nucleo, dove richiama altre proteine coattivatrici e va a interagire con i promotori dei suoi geni target per stimolarne la trascrizione. NF-κB attiva la trascrizione anche dell’mRNA codificante per la sua subunità inibitrice IκB, generando, quindi, un circuito a feedback negativo [63;64].
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Il meccanismo di attivazione di NF-κB è piuttosto complesso ed è basato su una cascata di modificazioni post-traduzionali, tra cui l’acetilazione risulta essere una delle principali modalità con cui il fattore nucleare può essere regolato. Infatti, l’acetilazione a livello della subunità p65 di NF-κB, ne impedisce il legame con IκB. Nella via di NF-κB l’acetilazione avviene sia sugli istoni (permettendo di attivare la trascrizione), sia direttamente sul fattore di trascrizione, a livello delle lisine 221 e 310 di p65. L’acetilazione a livello della Lys221 aumenta l’affinità di legame con il DNA, mentre quella della Lys310 è necessaria per la completa attività trascrizionale della proteina. Al contrario, la deacetilazione di NF-κB promuove il legame con IκB, favorendo il trasporto del complesso dal nucleo al citoplasma e quindi la sua inattivazione. Nello specifico, SIRT1 inattiva NF-κB deacetilando selettivamente la subunità p65 sul residuo di lisina 310. Un recente studio ha dimostrato che, oltre a bloccare la proliferazione cellulare, SIRT1, agendo su NF-κB, sensibilizza le cellule all’apoptosi indotta dal TNF-α (Tumor Necrosis Factor) [63;66;67;68].
Numerose evidenze indicano che la via di segnalazione di NF-κB può anche controllare i cambiamenti metabolici energetici di concerto con SIRT1. Quest’ultima può inibire il signaling di NF-κB sia direttamente, sia indirettamente; a sua volta, il sistema di NF-κB sopprime le funzioni mediate da SIRT1 inibendo le molecole target a valle di SIRT1 e in questo modo le due proteine agiscono in maniera antagonistica [65].
3.5 SIRT1 e TELOMERI
Un'altra importante funzione di SIRT1 si svolge a livello dei telomeri, dove questa proteina sembra essere un regolatore positivo della loro lunghezza, attenuandone l’accorciamento fisiologico associato all’invecchiamento, un effetto dipendente dall’attività dell’enzima telomerasi.
I telomeri sono delle strutture nucleoproteiche specializzate che proteggono le estremità dei cromosomi eucariotici da reazioni di riparazione del DNA insolite e dalla degradazione. Nei Vertebrati i telomeri sono costituiti da ripetizioni della sequenza nucleotidica TTAGGG legate da un complesso multiproteico specializzato chiamato Shelterin, che svolge delle funzioni fondamentali nel regolarne la lunghezza e nella loro protezione. A causa dell’intrinseca incapacità del macchinario di replicazione del DNA di copiare le estremità
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delle molecole lineari e delle attività endogene di degradazione delle stesse, i telomeri divengono progressivamente più brevi dopo ogni ciclo di divisione cellulare. Le ripetizioni telomeriche sono generate da una ribonucleoproteina con attività di trascrittasi inversa chiamata telomerasi, la cui abbondanza e attività nei tessuti adulti non è sufficiente per compensare il progressivo logoramento telomerico che si verifica con l’invecchiamento [69;70;71;72]. Nell’Uomo parecchi studi hanno mostrato una correlazione inversa tra la lunghezza telomerica e l’età in diversi tessuti e tra la suddetta lunghezza e determinate malattie associate all’età. Inoltre, è stato ipotizzato che fattori che possono ridurre la longevità, come lo stress psicologico o l’obesità, possano avere un impatto negativo sull’attività della telomerasi e la lunghezza telomerica. In assenza del suddetto enzima, le estremità cromosomiche possono essere mantenute da un meccanismo dipendente dalla ricombinazione, conosciuto come allungamento alternativo dei telomeri (ALT, Alternative Lenghtening of Telomeres), che coinvolge diversi complessi di proteine di riparo del DNA [73;74].
Abbiamo già visto come SIRT1 sia coinvolta nella risposta al danno al DNA, oltre che nel rimodellamento della cromatina e nel silenziamento genico. In particolare, questa deacetilasi viene reclutata a livello della cromatina in seguito a delle lesioni al DNA e qui favorisce un’efficiente riparazione delle rotture a doppio filamento, tramite ricombinazione omologa, ad esempio deacetilando una specifica elicasi. Inoltre SIRT1 espleta la sua azione anche su una delle subunità responsabili dell’allungamento alternativo dei telomeri dipendente dalla ricombinazione [75;76]. Si è visto, ancora, che topi contenenti copie addizionali del gene codificante per SIRT1 risultano protetti dal danno al DNA e dalla carcinogenesi del fegato e mostrano una riduzione dei segni dell’invecchiamento. In particolare, in questi esperimenti, la sovraespressione di SIRT1 porta alla formazione di telomeri più lunghi, attenua la loro erosione dovuta all’età nei tessuti adulti e questi effetti sembrano dipendere dall’attività della telomerasi. In uno studio recente si è osservato che una diminuzione di SIRT1 può causare disfunzione telomerica, mentre la sua attivazione tramite resveratrolo porta ad un aumento del DNA telomerico extra-cromosomico e della co-localizzazione di specifiche proteine che si legano ai telomeri e li allungano mediante ALT. SIRT1 sembra, infatti, interagire con le ripetizioni telomeriche, funzionando come regolatore positivo della loro lunghezza in vivo ed attenuandone significativamente l’accorciamento dovuto all’invecchiamento; in più sembra avere un ruolo rilevante anche nel promuovere la ricombinazione in differenti regioni cromosomiche, inclusi i telomeri. Tutto ciò, legando SIRT1 all’attività telomerica, può
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fornire nuove spiegazioni sul ruolo dell’aumentata espressione della deacetilasi relativamente alla protezione dal danno al DNA e alla prevenzione di alcune patologie associate all’età [76;77;78;79].
4 REGOLAZIONE DI SIRT1
Le Sirtuine operano in diversi compartimenti cellulari, deacetilando istoni e diversi regolatori trascrizionali nel nucleo, ma anche proteine specifiche in altri distretti come il citoplasma e i mitocondri. Di conseguenza, questi enzimi regolano il metabolismo del glucosio e dei grassi in risposta ai fisiologici cambiamenti nei livelli energetici della cellula, agendo, in tal modo, come cruciali regolatori della rete che controlla l’omeostasi dell’energia e determinando, così, la durata della vita in piena salute [9].
E’ degno di nota il ruolo delle Sirtuine, e in particolare di SIRT1, nella restrizione calorica (l’unico intervento fisiologico che aumenta la durata della vita), nella prevenzione delle malattie correlate all’età e anche nel mantenimento dell’omeostasi metabolica. Pertanto, la ricerca di attivatori delle sirtuine, che siano di origine nutraceutica (cioè ottenuti attraverso il cibo) o farmacologica, è stata intensa e ha portato all’identificazione di diverse sostanze attivatrici delle Sirtuine. In particolare, ha ricevuto grande attenzione il resveratrolo, un polifenolo che si trova nell’uva rossa, nei frutti di bosco e nelle arachidi. Si pensa che l’attivazione delle Sirtuine sia benefica non solo per le malattie correlate al metabolismo, come diabete di tipo 2 e obesità, ma anche per quelle neurodegenerative, come la malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson. Ciò è dovuto, in parte, al fatto che le Sirtuine stimolano l’attività dei mitocondri (che rappresentano le “centrali elettriche” della cellula) e delle proteine mitocondriali, che hanno un ruolo chiave nelle suddette patologie [80;81;82;83;84]. La regolazione dell’attività delle Sirtuine avviene a vari livelli; la stessa localizzazione subcellulare ne determina, in parte, l’attività. Tuttavia, è richiesta un’ulteriore regolazione, dal momento che diverse Sirtuine hanno in comune lo stesso compartimento e anche per consentire la corretta attività di queste proteine a livello di substrati specifici. La regolazione trascrizionale, le modificazioni post-traduzionali, la formazione di complessi proteici e di substrati enzimatici contribuiscono tutte all’attività delle Sirtuine a diversi livelli, ma non si sa ancora molto su quanto tutto ciò possa effettivamente contribuire alla loro regolazione,
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specialmente in vivo. Anche alcune sostanze nutritive e piccole molecole possono modulare l’attività delle Sirtuine, aprendo la possibilità ad alcuni interventi terapeutici [85].
Figura 11. Regolazione dell'espressione e dell'attività di SIRT1
.
4.1 REGOLAZIONE ATTRAVERSO L’ESPRESSIONE
Un primo tipo di regolazione è quello che viene definito “regolazione attraverso l’espressione”.
L’espressione di SIRT1 cambia in diverse condizioni fisiologiche: è indotta durante uno stato di bassi livelli di energia ed è repressa durante gli stati caratterizzati da un eccesso di energia. Per esempio, la restrizione calorica fa aumentare l’espressione di SIRT1, mentre una dieta ricca di grassi la fa diminuire.
L’analisi del promotore di SIRT1 ha rivelato la presenza di siti di legame per differenti fattori di trascrizione, tra cui FOXO1, CREB (proteina legante gli elementi di risposta al cAMP), ChREBP (proteina legante gli elementi di risposta ai carboidrati) e diversi elementi di
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risposta alle proteine PPAR (recettori attivati da proliferatori perossisomiali); ciò suggerisce che questi fattori di trascrizione regolino l’espressione di SIRT1 in risposta a stimoli appropriati. Infatti FOXO1, PPARα, PPARβ/δ e CREB aumentano i livelli di SIRT1, mentre PPARγ e ChREBP ne reprimono l’espressione. Inoltre HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) funziona come un repressore trascrizionale di SIRT1, secondo un meccanismo mediato da un altro repressore trascrizionale, CtBP (proteina legante il Carbossi-terminale), ed intensificato dal NADH, in linea con la repressione dell’espressione di SIRT1 in periodi di eccesso di energia. Ancora, PARP2 (poli ADP-ribosio polimerasi), che appartiene a una famiglia di enzimi nucleari coinvolti nella riparazione del DNA, nell’apoptosi e nella trascrizione, si lega al promotore di SIRT1, reprimendolo (anche se l’esatto meccanismo non è ancora ben conosciuto). E’ importante sottolineare che CREB, ChREBP e PARP2 non solo regolano l’espressione delle sirtuine in vitro, ma è stato dimostrato che controllano la loro espressione anche in vivo [86].
A un livello differente di regolazione, anche alcuni microRNA (miRNA) modulano i livelli dell’mRNA di SIRT1, attraverso la degradazione del trascritto primario, o tramite l’inibizione della traduzione. Ad esempio, nel topo, il miR-199a reprime l’espressione di SIRT1 e quella del sensore dell’ossigeno HIF1α (Hypoxia-inducible factor 1α); in condizioni di ipossia questo miRNA è inibito nei cardiomiociti, consentendo l’espressione di SIRT1 e di HIF1α e, in tal modo, stabilizzando p53 e riducendo l’apoptosi. (Fig.11a) [85]
4.2 REGOLAZIONE ATTRAVERSO MODIFICAZIONI
POST-TRADUZIONALI
Il secondo tipo di regolazione dell’attività delle Sirtuine (Fig.11b), derivante dalle modifiche post-traduzionali, non è stato ancora pienamente compreso in maniera dettagliata. Sono stati identificati diversi siti di fosforilazione su SIRT1, ad esempio questa può avvenire ad opera del complesso ciclinaB-CDK1, che lega la deacetilasi, e mutazioni nei siti di fosforilazione perturbano la normale progressione del ciclo cellulare. Anche la proteina chinasi JNK (cJUN N-terminal kinase) fosforila SIRT1 su tre residui, in particolare in condizioni di stress ossidativo, e ciò comporta la deacetilazione dell’istone H3 ma non di p53, suggerendo che tale modificazione post-traduzionale indirizzi SIRT1 su bersagli specifici. Inoltre le due tirosin-chinasi DYRK1 e DYRK3 fosforilano SIRT1 su uno specifico residuo di treonina, attivandola, e ciò porta ad un aumentato grado di deacetilazione di p53
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da parte di SIRT1, prevenendo l’apoptosi in caso di stress genotossico.
Si è osservato che SIRT1 può anche essere sumoilata e ciò, in cellule in coltura, determina un aumento della sua attività. In seguito a stress genotossico, indotto ad esempio da luce ultravioletta o perossido di idrogeno, una proteina con funzione di desumoilasi rimuove questa modificazione, inattivando SIRT1 e promuovendo la morte cellulare. Alcune evidenze indicano che tali condizioni portano ad un’attivazione degli enzimi PARP -che formano la famiglia dei maggiori utilizzatori del NAD+- che, in tal modo, esauriscono i livelli di NAD+, inibendo l’attività di SIRT1 [85;89].
4.3 REGOLAZIONE ATTRAVERSO LA FORMAZIONE DI COMPLESSI PROTEICI
Le Sirtuine sono ulteriormente regolate grazie alla formazione di complessi con altre proteine (Fig.11c).
La proteina AROS (active regulator of SIRT1) è l’unico regolatore conosciuto che controlli positivamente SIRT1 in seguito alla formazione di un complesso, avendo come effetto quello di sopprimere p53.
Al contrario, sono stati studiati diversi regolatori negativi: ad esempio NCoR1 (nuclear receptor co-repressor1) e SMRT (silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptors) formano un complesso con SIRT1 e PPARγ durante il digiuno e reprimono l’induzione dell’adipogenesi mediata da PPARγ. DBC1 (deleted in breast cancer1) si lega al dominio catalitico di SIRT1 inibendone l’attività in vitro in condizioni di stress genotossico; la rilevanza fisiologica del complesso DBC1-SIRT1 è stata confermata dall’osservazione che la formazione di tale complesso risulta inibita durante il digiuno ed aumentata in topi nutriti con una dieta ricca di grassi. Anche l’istone metiltrasferasi LSD1 (lysine-specific demethylase1) interagisce con il sito catalitico di SIRT1 per regolare l’espressione dei geni target a valle di Notch: infatti la deacetilazione mediata da SIRT1 a livello di specifiche lisine degli istoni H4 e H1, in associazione con la demetilazione di una lisina dell’istone H3 operata da LSD1, porta alla repressione dei geni target di Notch [85;86;87;88].
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4.4 COMPOSTI CHE REGOLANO L’ATTIVITA’ DELLE SIRTUINE
Oltre alle modalità di regolazione descritte e oltre al cofattore NAD+ e a molecole come l’AMPK (la cui influenza su SIRT1 sarà analizzata più avanti), sono state identificate anche delle sostanze naturali che modulano l’azione di SIRT1, attivandola. Uno studio effettuato sul lievito e riguardante piccole molecole ha, infatti, messo in luce come diversi polifenoli vegetali, e in particolare il resveratrolo, possano indurre SIRT1 a deacetilare p53 e vari peptidi dipendenti da questo oncosoppressore in vitro e inoltre il trattamento di S.Cerevisiae con i suddetti composti, ne ha determinato un aumento nella durata della vita. Il resveratrolo incrementa l’attività di SIRT1 ed intensifica la funzione mitocondriale nei topi, proteggendoli dall’obesità indotta dalla dieta e migliorando il loro esercizio fisico e la loro resistenza al freddo; inoltre, se sottoposti ad un’alimentazione ricca di grassi, i topi trattati con resveratrolo vivono più a lungo. Questa sostanza migliora l’attività mitocondriale e il controllo del metabolismo anche nell’Uomo: è interessante notare che in quest’ultimo dosi di resveratrolo significativamente inferiori portano a livelli plasmatici della sostanza, all’attivazione di AMPK e ad altri effetti fisiologici paragonabili a quelli osservati nei topi [90].
Sono stati descritti anche alcuni composti sintetici in grado di attivare il pathway di SIRT1 e che, in maniera simile al resveratrolo, proteggono dall’obesità indotta dalla dieta, migliorando la funzione mitocondriale ed estendendo la durata della vita nei topi obesi. Anche se gli effetti dei polifenoli e dei composti di sintesi sono ampiamente dimostrati, non è ancora ben chiaro il meccanismo tramite il quale attivano SIRT1. Originariamente si pensava che queste sostanze agissero direttamente sulla deacetilasi, modificandone le proprietà enzimatiche -abbassando, ad esempio, la km sia per la proteina substrato sia per il NAD+- ma evidenze recenti suggeriscono che, piuttosto che attivare SIRT1, il resveratrolo sembra attivare l’AMPK, probabilmente attraverso l’inibizione della fosforilazione ossidativa. A favore dell’importanza dell’AMPK c’è l’osservazione della perdita degli effetti indotti dal resveratrolo in topi privi di AMPK, pur non avendo la dimostrazione della direzionalità dell’interazione tra SIRT1 e AMPK. In questi stessi esperimenti, nei topi il rapporto NAD+/NADH risulta aumentato dal resveratrolo in maniera dipendente dall’AMPK, consentendo l’attivazione delle sirtuine a valle. Allo stesso modo, agonisti noti di AMPK portano ad un aumento dei livelli di NAD+ e alla deacetilazione di PGC1α dipendente da SIRT1 e ancora, esperimenti time-course hanno rivelato che l’attivazione di
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AMPK in seguito al digiuno o all’esercizio fisico precede l’aumento del NAD+ e l’attivazione di SIRT1 [85].
4.5 REGOLAZIONE ATTRAVERSO IL NAD+ E LO STATO ENERGETICO
CELLULARE
Le Sirtuine dipendono, per la loro attività, dal cofattore NAD+ e quindi la disponibilità di questo composto costituisce un altro elemento importante per la loro regolazione.
Il Nicotinammide Adenina Dinucleotide (NAD+) è un coenzima classico che, insieme alla sua forma ridotta (NADH), media il trasferimento degli ioni idruro in molte reazioni redox metaboliche e che gioca un ruolo chiave anche nella regolazione degli enzimi che lo consumano, tra cui le Sirtuine. La biosintesi del NAD+, mediata in particolare dalla nicotinammide fosforibosiltrasferasi (NAMPT), opera insieme a SIRT1 per regolare il metabolismo e il ritmo circadiano. I livelli di NAD+ diminuiscono durante il processo di invecchiamento, provocando difetti nelle funzioni nucleari e mitocondriali, che portano a diverse patologie associate all’età. Il ripristino di questo coenzima, tramite l’integrazione degli intermedi del NAD+, combinato all’attivazione delle Sirtuine, può migliorare drasticamente questi difetti funzionali associati all’età, contrastando molte malattie dell’invecchiamento [91;92;93;94;95].
Per generare il NAD+, i Mammiferi utilizzano quattro differenti precursori: il triptofano, la nicotinammide, l’acido nicotinico e il riboside della nicotinammide (NR). E’ noto che la via di sintesi del NAD+ predominante nei Mammiferi è costituita dalla via di recupero che inizia dalla nicotinammide, durante la quale il NAMPT produce il nicotinammide mononucleotide (NMN) a partire dalla nicotinammide e dal 5’-fosforibosil-1-pirofosfato; l’NMN, insieme all’ATP, è poi convertito in NAD+. E’ stato dimostrato che il NAMPT è una fosforibosiltrasferasi dimerica di tipo II, che funziona come enzima limitante della velocità di sintesi del NAD+ nei Mammiferi e che regola direttamente l’attività di SIRT1 [96]. Il NAD+ è composto da due mononucleotidi legati covalentemente, la nicotinammide mononucleotide, o NMN, e l’adenosinmonofosfato, o AMP e in tutte le reazioni in cui funziona da cosubstrato per altri enzimi, viene tagliato a livello del legame glicosidico tra la nicotinammide e l’ADP ribosio. In particolare, nella reazione catalizzata dalle Sirtuine, il taglio del NAD+ favorisce la rimozione del gruppo acetilico dalle lisine delle proteine substrato o degli istoni e il suo trasferimento sull’ADP ribosio, dando come prodotti i
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substrati proteici o gli istoni deacetilati, la molecola di 2’-O-acetil-ADP-ribosio e la nicotinammide (NAM) (Fig.3) [95].
Figura 12. Principali vie coinvolte nella regolazione di SIRT1.
Il NAD+ e il NAM costituiscono due elementi chiave nella regolazione di SIRT1. Il NAM, prodotto dalle Sirtuine stesse durante la reazione di deacetilazione, è un inibitore di SIRT1, mentre il NAD+ è il cofattore essenziale per la reazione enzimatica da essa catalizzata. Un altro elemento chiave, in questo contesto, è il NAMPT, che ha il compito di convertire il NAM in NAD+: esso, infatti, aumentando i livelli di NAD+, regola positivamente SIRT1. Inoltre, la deplezione nutrizionale e l’esercizio fisico portano ad un’aumentata produzione di NAMPT e si pensa che la stimolazione della sintesi delle Sirtuine che si osserva in seguito al verificarsi di tali condizioni, possa avvenire proprio tramite questa regolazione [97].
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Per quanto riguarda l’esercizio fisico, è importante sottolineare che quando si ha una riduzione dello stato energetico della cellula conseguente ad uno sforzo fisico, si ha una variazione nella concentrazione dell’adenosina trifosfato (ATP): più precisamente, si osserva un innalzamento dei livelli di adenosina monofosfato (AMP) e un abbassamento dei livelli di ATP. Ciò comporta un aumento nel rapporto tra i due ribonucleosidi, AMP/ATP, che viene percepito dall’enzima AMPK (protein chinasi attivata dall’AMP). Questo è un sensore metabolico che si attiva durante l’esercizio fisico o in condizioni di richiesta energetica ed è coinvolto anche nella regolazione delle Sirtuine. In queste condizioni metaboliche l’attivazione dell’AMPK ripristina l’equilibrio energetico stimolando i processi catabolici che generano ATP (come, ad esempio, l’ossidazione degli acidi grassi) e inibendo quelli anabolici che consumano ATP, ma che non sono fondamentali per la sopravvivenza (come la sintesi dei trigliceridi e delle proteine o la proliferazione cellulare), con lo scopo di ripristinare la riserva di ATP [98].
AMPK e SIRT1 presentano delle analogie nella loro regolazione e nella loro azione su diversi processi, quali il metabolismo cellulare, l’infiammazione e le funzioni mitocondriali e si è visto che queste analogie si verificano, almeno in parte, perché queste due proteine si regolano a vicenda e condividono molte molecole target comuni.
L’AMPK è un eterotrimero costituito da una subunità α, catalitica, e due subunità regolatorie, β e γ; tutte e tre sono richieste per l’attività della proteina. Sulla subunità α sono presenti i siti di fosforilazione, mentre la subunità γ contiene diversi domini che, in condizioni di base, legano l’ATP. Quando una cellula è in deficit energetico e il rapporto AMP/ATP aumenta, l’AMP rimpiazza l’ATP nei legami della subunità γ e ciò causa un cambiamento conformazionale che porta ad un modesto aumento dell’attività di AMPK e alla fosforilazione sulla subunità α, che risulta in un’attivazione molto più consistente dell’enzima stesso, che, a questo punto, può fosforilare svariate molecole (enzimi, attivatori e co-attivatori trascrizionali), con il risultato finale di un ripristino dello stato energetico della cellula. Ci sono due protein chinasi che agiscono a monte di AMPK, fosforilandola: LKB1 (Liver Kinase B1, una serina-treonina chinasi) e CaMKKβ (Calcium/calmoduline kinase kinase- β). LKB1 è la principale chinasi che fosforila AMPK, attivandola, in risposta ad una diminuzione dello stato energetico della cellula, come quella causata dalla privazione di nutrienti o dall’aumento del dispendio energetico (dovuto, ad esempio, all’esercizio fisico). CaMKKβ, invece, fosforila e attiva AMPK in risposta ad un aumento della concentrazione di Ca2+ intracellulare ed espleta la sua azione anche in assenza di LKB1. Una volta attivata,
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AMPK mette in moto un’ampia varietà di eventi che, in misure diverse, portano ad un innalzamento dei livelli di ATP [99;100;101;102].
Tra SIRT1 e AMPK vi è una regolazione reciproca, infatti AMPK può funzionare da attivatore di SIRT1, come dimostrato in alcuni esperimenti in cui si osserva un aumento nell’attività della deacetilasi in seguito all’attivazione di AMPK e ciò può avvenire o tramite la stimolazione del NAMPT o perché l’AMPK può alterare il rapporto tra NAD+ e NADH e così stimolare SIRT1 indipendentemente dal NAMPT. Inoltre, in seguito alla riduzione del rapporto tra NAD+ e NADH si verifica una diminuzione dell’attività sia di SIRT1 sia di AMPK e questo collegamento sembra essere mediato da LKB1. Infatti, in studi condotti su cellule di rene embrionale umano, una sovraespressione di SIRT1 determina una diminuzione nell’acetilazione di alcune lisine su LKB1, permettendo la sua traslocazione dal nucleo al citoplasma, dove la chinasi può associarsi ad altre proteine ed è in grado di fosforilare AMPK, attivandola. Un’altra evidenza di una correlazione tra il meccanismo di segnalazione di SIRT1/LKB1/AMPK si ha dalla dimostrazione che, affinché i polifenoli (come il resveratrolo) possano attivare l’AMPK, è necessaria la presenza sia di SIRT1 sia di LKB1 [103].
Come conseguenza di questo feedback positivo, SIRT1 e AMPK hanno molte funzioni simili nella regolazione del metabolismo energetico: ad esempio sono entrambi sensori primari della carenza di energia e possono, pertanto, stimolare adattamenti metabolici in maniera interdipendente [65].
29 Figura 13. Regolazione dell'AMPK e principali funzioni.
L’AMPK è una proteina importante non solo per la sua azione stimolatrice sulle Sirtuine, ma anche per la sua azione inibitoria su mTOR.
La mTOR (mammalian target of rapamycin) è una serin/treonin-protein chinasi citoplasmatica, che espleta la sua azione lungo la via di trasduzione del segnale PI3K/AKT/mTOR (una via di segnalazione intracellulare importante nella regolazione del ciclo cellulare) e che rappresenta un regolatore centrale della crescita, della proliferazione, della motilità e della sopravvivenza delle cellule, della sintesi proteica, della trascrizione, dell’apoptosi, dell’autofagia e dell’angiogenesi. In associazione con altre proteine, forma i complessi mTORC1 e mTORC2. Le attuali conoscenze indicano che questa chinasi agisce come un interruttore principale nei processi anabolici e catabolici cellulari, regolando il tasso di crescita e la proliferazione cellulare. La disregolazione del segnale di mTORC1 altera il metabolismo corporeo ed è causa di affezioni correlate all’età, diabete, invecchiamento per
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inibizione dell’autofagia (processo necessario al prolungamento della vita che tende a ridursi con il procedere dell’età) e affezioni tumorali in cui la proteina è iper-regolata. Nei tumori maligni la network TOR rappresenta, di conseguenza, un importante target terapeutico. La rapamicina (un antibiotico immunosoppressore) è il primo inibitore selettivo di mTORC1, tuttavia, nel corso degli anni, sono stati scoperti altri inibitori di entrambi i complessi e della via del segnale PI3K/AKT/mTOR, che possono migliorare la risposta biologica, unitamente ad una più completa attività antitumorale.
La via del segnale di mTOR è attivata da nutrienti (glucosio, amminoacidi, acidi grassi), insulina e altri ormoni, fattori di crescita, citochine, mitogeni; altri fattori importanti nell’attivazione di mTOR sono NAM, AKT (o protein chinasi B, PKB) e ERK (extracellular signal-regulated kinase, una MAP chinasi). Al contrario, tale via risulta regolata negativamente dalla ridotta disponibilità di energia (restrizione calorica) che, a sua volta, determina l’attivazione di AMPK e di SIRT1: queste due proteine riducono l’attivazione di mTOR [104;105;106].
Figura 14. Inibizione di mTOR da parte di AMPK.
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a) preserva la funzione delle cellule staminali in numerosi tessuti migliorandone la capacità riparativa e, in ultima analisi, rallentando la progressione di affezioni età-correlate e prolungando la sopravvivenza;
b) previene la moltiplicazione di cellule aberranti.
5 mTOR
La proteina mTOR (mammalian target of rapamycin, bersaglio della rapamicina nei Mammiferi), è una grande serina/treonina protein chinasi che nell’Uomo è codificata dal gene MTOR e che regola la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza delle cellule, la sintesi proteica, l’autofagia e la trascrizione. mTOR è un membro della famiglia delle protein chinasi imparentate alla fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e guida e controlla la transizione delle cellule dallo stato anabolico a quello catabolico.
Questa chinasi integra lo stimolo proveniente da percorsi superiori, inclusi insulina, fattori di crescita e mitogeni e percepisce i nutrienti cellulari, i livelli di energia e lo stato redox. La rapamicina è un immunosoppressore che può inibire la mTOR, associandosi con il suo recettore intracellulare. Il pathway di mTOR appare sregolato in diverse patologie umane, specialmente in alcuni tipi di cancro e infatti questa proteina è oggetto di diversi studi di laboratorio, poiché la sua inibizione farmacologica è risultata essere un potente mezzo per sopprimere la crescita di molti tipi di tumori, come la leucemia, le mielodisplasie, il glioblastoma, il carcinoma mammario, epatico e pancreatico. Oltre alla rapamicina, infatti, sono già stati elaborati alcuni farmaci sperimentali specifici per la mTOR.
mTOR si lega ad altre proteine e funziona come componente principale di due distinti complessi proteici, che regolano diversi processi cellulari. In particolare, in entrambi i complessi mTOR agisce come una serina/treonina protein chinasi e inoltre in uno dei due questa proteina ha anche la funzione di tirosin chinasi e promuove l’attivazione dei recettori dell’insulina e dell’IGF1 (insulin-like growth factor 1) ed è implicata nel controllo e nel mantenimento del citoscheletro di actina [107;108].
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5.1 STORIA
mTOR è il target di una molecola chiamata rapamicina o sirolimus, che è un antibiotico macrolide scoperto come prodotto del batterio Streptomyces Hygroscopicus in un campione di terreno proveniente da Rapa Nui (Isola di Pasqua, da cui il nome rapamicina) e che ha guadagnato attenzione in primo luogo per le sue spiccate proprietà antiproliferative. Nei primi anni Novanta, grazie ad analisi genetiche nel lievito Saccaromyces Cerevisiae, furono identificati i geni TOR1 e TOR2 quali mediatori degli effetti tossici della rapamicina sul lievito. Poco dopo, approcci biochimici nei Mammiferi portarono alla purificazione di mTOR e alla sua scoperta come bersaglio fisico della rapamicina [109]. Questa tossina batterica agisce formando un complesso inibitorio con il proprio recettore intracellulare, la proteina FKBP12 (FK506 binding protein), che si lega a una regione presente all’estremità C-terminale delle proteine TOR, denominata FRB (regione che lega il complesso FKBP12-rapamicina, FKBP12- rapamycin binding), inibendo, così, l’attività di TOR. I genomi dei Mammiferi, così come quelli degli altri Metazoi, codificano per una singola proteina TOR, con struttura simile e che presenta circa il 42% di identità di sequenza amminoacidica con le proteine TOR di lievito [110].
5.2 PROPRIETA’ BIOCHIMICHE
Le proteine TOR sono caratterizzate da un elevato peso molecolare e contengono diversi domini strutturali distinti e conservati. mTOR è costituita da 2549 amminoacidi e anch’essa comprende una serie di domini strutturali conservati.
Figura 15. La struttura primaria di mTOR.
All’estremità N-terminale sono presenti 20 ripetizioni HEAT (dai nomi delle proteine in cui è presente questo dominio: Huntingtina, EF3-elongation factor3, subunità A della proteina fosfatasi2-PP2A, TOR1) in tandem. Ognuna di queste ripetizioni HEAT è formata da due α
