ELETTROFORESI E WESTERN BLOT

Per verificare la presenza della proteina di nostro interesse, α-sin e dei suoi eterocomplessi, α- sin/Aβ e α-sin/tau, nei campioni di cervello e di colon è stata utilizzata la tecnica del Western Blot. Il Western Blot o immunoblot è una tecnica biochimica mediante la quale è possibile identificare una determinata proteina in una miscela, tramite il riconoscimento da parte di anticorpi specifici. Per facilitare il riconoscimento, si ha una prima fase di separazione delle proteine, presenti nel campione, in base al loro peso molecolare utilizzando un’elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE). Successivamente, si ha il trasferimento delle proteine su un supporto solido, generalmente una membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF) ed infine di procede con il vero e proprio riconoscimento da parte dell’anticorpo.

3.5.1 PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

Per detectare la proteina α-sin i campioni, contenenti 50 µg di proteine, sono stati sospesi in tampone RIPA (NaH2PO4 9.1 mM, Na2HPO4 1.7 mM, NaCl 150 mM, pH=7.4, 0,5% sodio desossicolato, 1% Nonidet P-40, 0.1% SDS ed un cocktail di inibitori delle proteasi, IP) e mantenuti in ruota per 60 minuti alla temperatura di 4 °C, per effettuare la lisi cellulare. Successivamente, ai lisati ottenuti è stata aggiunta la Laemmli Solution (Tris-HCl 1 mM pH=6.8, SDS 4%, β- mercaptoetanolo, glicerolo, H2O, blu di bromofenolo): il beta-mercaptoetanolo riduce i ponti disolfuro; il glicerolo aumenta la densità e il blu di bromofenolo è aggiunto come indicatore della corsa. Infine, i campioni sono stati bolliti per 5 minuti. Per identificare gli eterocomplessi α-sin/Aβ e α-sin/tau, invece, è stata usata la co- immunoprecipitazione, una tecnica che si utilizza per ricercare l’interazioni proteina-proteina. I campioni di cervello e colon sono stati lisati in tampone RIPA e sono stati incubati con un anticorpo anti α-sin tutta la notte a 4 °C in rotazione continua. Il giorno successivo, ad ogni campione, sono stati aggiunti 80 µL di proteina A-Sepharose per 2 ore a 4 °C in rotazione continua, in modo tale da ottenere la precipitazione degli immunocomplessi di α-sin. Successivamente, i campioni sono stati centrifugati a 14000 x g per un minuto ed è stato aspirato il surnatante. I pellet ottenuti sono stati lavati con RIPA contenente inibitori delle proteasi, sono stati spinnati per 15 secondi alla massima velocità ed il surnatante è stato aspirato di nuovo. L’operazione di lavaggio è stata ripetuta due volte. Ai campioni è stata quindi aggiunta la Laemmli Solution 2X. Si è poi proceduto con la bollitura dei campioni per cinque minuti per promuovere la denaturazione delle proteine e il

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distacco della proteina A-Sepharose dal complesso proteico. Una volta pronti i campioni sono stati caricati per la corsa elettroforetica.

3.5.2 ELETTROFORESI SDS-PAGE

L’elettroforesi è una tecnica utilizzata per la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare e si realizza in presenza di sodio dodecilsolfato, un detergente anionico che si lega saldamente alla proteina provocandone la denaturazione. In eccesso di SDS, la proteina assume una carica negativa per unità di massa, quindi l’interazione SDS-proteina provoca la destabilizzazione della struttura terziaria di questa denaturandola. La proteina mantiene la forma denaturata perché le cariche negative di SDS permangono e si respingono a vicenda evitando che la proteina possa tornare alla sua conformazione nativa. Il risultato è che la proteina assume una forma linearizzata ed una carica negativa proporzionale alla sua massa, in modo che il rapporto carica/massa sia uguale per proteine diverse (Figura 4).

Figura 4- Interazione SDS-Proteina

(http://www2.unibas.it/plsbiotecnologie/images/materiale_didattico/Interazione%20antigene- anticorpo%20mediante%20Western%20Blotting.pdf)

La separazione dei complessi SDS-proteina, in un campo elettrico, avviene in base all’effetto setaccio molecolare dovuto alle dimensioni dei pori del gel. Di conseguenza, le proteine più piccole si muovono più velocemente attraverso il gel rispetto a quelle più grandi che sono più rallentate. Proteine con dimensioni molecolari differenti migreranno in maniera diversa, mentre proteine con dimensioni molecolari uguali migreranno in maniera uguale (Figura 5).

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Figura 5- Migrazione delle proteine nel gel di poliacrilammide (https://slideplayer.it/slide/10359693/)

L’elettroforesi SDS-PAGE è un’elettroforesi a gel discontinui in quanto vengono utilizzati due tipi di gel o tamponi: lo stacking gel, gel di impaccamento, in cui vengono formati i pozzetti nei quali si depositano i campioni da analizzare; il running gel, gel di separazione, che è la matrice in grado di separare le macromolecole. Lo stacking gel è un gel di poliacrilammide a percentuale bassa 3-5% e possiede pori di grosse dimensioni. Il running gel ha une percentuale compresa tra 7,5% e 20% in cui i pori di piccole dimensioni fungono da setacci molecolari. Nei pozzetti dello stacking gel sono stati caricati i campioni insieme agli standard proteici, miscele di proteine di peso molecolare noto, capaci quindi di indicare la migrazione di proteine di peso molecolare simile. Si chiamano marker di peso molecolare e servono a monitorate la corsa elettroforetica. Come controllo è stata utilizzata la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi, GAPDH, una proteina housekeeping con peso molecolare differente dalle proteine di nostro interesse. La GAPDH è un enzima coinvolto nella glicolisi, ed è espresso in molti tessuti ed è per questo motivo che viene utilizzato come controllo. È stato preparato il running buffer (Tris 30 g, glicina 144 g, SDS 10 g, pH 8.6, diluito 1:10 in acqua milliQ), tampone di corsa nel quale è stato immerso il gel. Una volta caricati i campioni, è stato applicato un campo elettrico di 17 mA: le proteine, che a seguito del contatto con SDS hanno assunto carica negativa, si muovono verso l’elettrodo positivo. Prima che le molecole da analizzare abbiano raggiunto il fondo del running gel, il campo elettrico viene tolto e si ottiene così una separazione in base alla loro mobilità elettroforetica (Figura 6).

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Figura 6- Elettroforesi SDS-PAGE (https://www.creative-diagnostics.com/Sample-Gel-Preparation.htm)

3.5.3 TRASFERIMENTO SU MEMBRANA: ELETTROBLOTTING

Una volta eseguita l’elettroforesi, si procede con il trasferimento delle proteine dal running gel alla membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF), per rendere possibile il riconoscimento delle proteine da parte dell’anticorpo. Il metodo principale è l’elettroblotting (Figura 7) che usa una corrente elettrica per il trasferimento: le proteine vengono trasferite dal gel alla membrana e mantengono la posizione che hanno nel gel; una volta avvenuto il trasferimento sono esposte su una superficie sottile, la membrana di PVDF, per la rilevazione. Ci sono varie tipologie di membrane scelte in base alle loro proprietà non-specifiche di legame con le proteine, che è basato su interazioni idrofobiche.

Figura 7- Blot: trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di PVDF. (https://www.creative- diagnostics.com/Electrophoresis-Protein-Transfer.htm)

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3.5.4 RICONOSCIMENTO DA PARTE DELL’ANTICORPO

Avvenuto il trasferimento su PVDF, la membrana è stata inserita in una vaschetta e ricoperta con Milk 5% (Tris Hcl 10 mM, NaCl 150 mM, pH=8, Milk 5%, Tween20 0,05%), per bloccare i siti aspecifici di legame ed evitare che vi si leghi l’anticorpo. Con questa operazione si ha la riduzione del “rumore” di fondo e si ottengono risultati più puliti senza falsi positivi. La membrana è stata lasciata incubare in agitazione 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, la membrana è stata incubata con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse (α-sin, α-sin/Aβ, α-sin/tau) overnight in agitazione a 4°C. Dopo l’incubazione overnight, sono stati eseguiti tre lavaggi in TBS Tween per eliminare l’anticorpo in eccesso e la membrana è stata incubata per 2 ore con un anticorpo secondario marcato, legato ad un enzima, che si lega all’anticorpo primario che si è legato alla proteina. Al termine delle due ore di incubazione, sono stati fatti tre lavaggi da 5 minuti in TBS Tween ed un ultimo lavaggio in TBS (1.21 g/L tris-HCl, 8.77 g/L NaCl, pH 8). È stato aggiunto il substrato chemiluminescente ECL (Figura 8) e i punti in cui le proteine hanno legato gli anticorpi sono diventati visibili. L’enzima coniugato all’anticorpo secondario è la perossidasi di rafano (HRP), enzima che catalizza la reazione tra perossido di idrogeno e luminolo, il substrato chemiluminescente. Il luminolo, in seguito ad ossidazione, dà luogo ad emissione di luce bluastra ad una lunghezza d’onda di circa 430 nm. La luminescenza è in grado di impressionare una lastra fotografica confermando la presenza della proteina di interesse.

Figura 7- Aggiunta del luminolo, il substrato chemiluminescente (https://www.covalab.com/products- covalight)

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