Esperimenti

3.3.1 Valutazione della vitalità cellulare, dello stress

ossidativo e della quantità di ossido nitrico

Gli studi sui parametri di vitalità, stress ossidativo e NO sono stati eseguiti piastrando le cellule in multiwell da 6 pozzetti, in cui sono state seminate 500 000 cellule per pozzetto. Dopo 24 ore in incubatore, tempo necessario per l’adesione, è stato eseguito il trattamento con il veicolo, costituito dal mezzo di piastratura con DMSO allo 0.1%, e con i nuovi composti ibridi, H2S-donor, alla concentrazione finale di 1µM; i pozzetti destinati alla valutazione del controllo e del danno sono stati invece trattati con solo veicolo. Dopo un’ora in incubatore è stato indotto il danno con LPS alla concentrazione finale di 5 µg/mL, ad eccezione del pozzetto considerato come controllo. Dopo 24 ore, le cellule sono state staccate dal pozzetto attraverso lo scraper; le sospensioni così ottenute sono state trasferite in altrettante falcon e centrifugate (1100 rpm per 5 minuti). Una volta aspirato il surnatante le cellule sono state risospese in 100 µL di Assay Buffer 1X, fornito dai kit. Per le valutazioni dei vari parametri è stato utilizzato il microcitofluorimetro Muse® Cell Analyzer (Fig.3.7).

Fig.3.7 Muse® Cell Analyzer è un microcitofluorimetro che fornisce analisi quantitative dei parametri cellulari mediante rilevazione fluorescente miniaturizzata, tramite un microcapillare attraversato da un laser.

3.3.1.1 Vitalità

Per questo esperimento, è stato utilizzato il kit specifico Muse® Count & Viability Assay Kit (Merck). La procedura indicata dal kit prevede che 380 µL di

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reagente siano aggiunti a 20 µL della sospensione cellulare precedentemente ottenuta in seguito a centrifuga. Dopo 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente, ogni campione viene analizzato con il microcitofluorimetro Muse® Cell Analyzer, secondo il programma previsto per il saggio di vitalità cellulare e seguendo le metodiche riportate nell’apposito manuale.

Questo kit determina accuratamente il conteggio totale delle cellule e la valutazione della vitalità in base alla differente permeabilità di due sonde leganti il DNA. La sonda nucleare marca solo le cellule nucleate, mentre la sonda della vitalità marca le cellule morte o in fase apoptotica. Questa combinazione di sonde consente al kit di distinguere cellule vitali da quelle morte. Inoltre, i detriti sono esclusi dai risultati sulla base della mancata fluorescenza.

3.3.1.2 Stress ossidativo

Per ottenere il dato relativo allo stress ossidativo è stato impiegato il Muse® Oxidative Stress Kit. Il reagente “ROS-Working”, utilizzato in questo saggio è stato preparato al momento dell’esperimento utilizzando Assay Buffer 1X con la relativa sonda composta da diidroetidio (DHE): 1 µL di sonda viene diluito in 99 µL di Assay Buffer 1X. Successivamente 25.75 µL di questa soluzione vengono addizionati a 1876.25 µL di Assay Buffer 1X. Da ciascuna falcon, contenente le sospensioni precedentemente ottenute per centrifuga, si prelevano 10 µL di sospensione cellulare e si aggiungono a 190 µL di reagente. Dopo 30 minuti di incubazione a 37 °C, la sospensione viene analizzata con il microcitofluorimetro Muse® Cell Analyzer, secondo il programma previsto. Il Kit di Stress Ossidativo Muse® determina simultaneamente il conteggio e la percentuale di cellule sottoposte a stress ossidativo, in base alla rilevazione intracellulare di radicali dell’ossigeno. Il kit utilizza il Reagente Muse® di Stress ossidativo, che è basato sulla presenza del diidroetidio (DHE), un composto che è ampiamente utilizzato per rilevare le specie ossidative reattive nelle popolazioni cellulari.

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3.3.1.3 Ossido nitrico

Per ottenere il dato relativo alla valutazione quantitativa dell’ossido nitrico, è stato utilizzato il Muse® Nitric Oxide Kit. Il kit consente di effettuare misurazioni quantitative simultanee di due importanti parametri di salute delle cellule: i cambiamenti nei livelli di attività dell'ossido nitrico intracellulare e la vitalità cellulare. Il Muse® Nitric Oxide Reagent è un reagente nei confronti del quale la membrana cellulare è permeabile e che genera un prodotto altamente fluorescente in assenza di ossidazione all'interno della cellula. Nel kit è incluso anche un marcatore di cellule morte (7-AAD), che funziona come indicatore dell'integrità strutturale della membrana cellulare e della morte cellulare. 7-AAD è escluso dalle cellule vive con membrane intatte, ma permea le membrane che sono compromesse o stressate così come le cellule morte.

Il protocollo prevede la preparazione della “Nitric oxide Working Solution”, mediante aggiunta di 1 µL di Muse® Nitric Oxide Reagent a 999 µL di Assay Buffer 1X. Di questa soluzione, 100 µL vengono addizionati a 10 µL di sospensione cellulare, precedentemente preparata centrifugando la sospensione prelevata dai pozzetti. Segue un’incubazione per 30 minuti a 37 °C, dopodiché vengono aggiunti 90 µL della “Muse® 7-AAD Working Solution”, preparata aggiungendo 20 µL del Muse® 7-AAD a 880 μL di Assay Buffer 1X. I campioni vengono poi incubati a temperatura ambiente, al buio, per 5 minuti e analizzati con il microcitofluorimetro Muse® Cell Analyzer secondo il programma previsto per il saggio del Nitric Oxide e seguendo le metodiche riportate nell’apposito manuale.

3.3.2 Rilevazione del rilascio di H

S in substrati

biologici mediante sonda fluorescente (WSP-1)

Per gli esperimenti sul rilascio di H2S, le cellule sono state piastrate in una multiwell nera da 96 pozzetti (72 000 cellule per ogni pozzetto); dopo 24 ore dalla piastratura, il mezzo di coltura è stato sostituito con 180 µL di Buffer Standard medicato con sonda WSP-1 alla concentrazione di 100 µM. La piastra contenente

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le cellule con il WSP-1 è stata quindi incubata per 30 minuti prima di rimuovere la sonda in eccesso. Al termine dei 30 minuti, la sonda contenuta nel buffer extracellulare è stata rimossa e sostituita con 180 µL di Buffer Standard. Successivamente la multiwell è stata sottoposta ad una prima lettura spettrofluorimetrica, in modo da ottenere una misurazione basale della fluorescenza. Di seguito è stato effettuato il trattamento delle cellule con i vari composti in triplicato: le cellule BV-2 sono state trattate con il veicolo (mezzo di coltura con DMSO all’1%), con il DADS utilizzato come H2S-donor di riferimento e con i composti ibridi di nuova sintesi, alla concentrazione finale di 100 µM. Come da protocollo, il planner è stato ripetuto in maniera analoga nei pozzetti non piastrati con cellule, detti “bianchi”, e la piastra è stata subito sottoposta a lettura spettrofluorimetrica con EnSpire® (PerkinElmer), alla temperatura di 37 °C e alla lunghezza d’onda di 465 nm in eccitazione e di 515 nm in emissione. Lo strumento è stato impostato in modo tale da effettuare letture ripetute ogni 5 minuti per un tempo complessivo di 60 minuti, così da ottenere una lettura in cinetica del rilascio di H2S.

3.3.2.1 WSP-1

WSP-1 (Washington State Probe-1) è una sonda fluorescente (Fig. 3.8) che si presenta come un solido cristallino in grado di rilevare la presenza di H2S nei campioni biologici e all’interno delle cellule. WSP-1 reagisce rapidamente con solfuro di idrogeno attraverso una reazione di sostituzione nucleofila da cui si ottiene un prodotto caratterizzato da un gruppo -SH libero e da un gruppo estereo altamente elettrofilo; questa particolare struttura consente al composto di ciclizzare spontaneamente per formare benzoditiolone, rilasciando un fluoroforo con eccitazione a 465nm ed emissione massima a 515 nm. Ciò permette non solo di catturare H2S come un prodotto stabile e analizzabile ma anche di studiarne la cinetica di rilascio. La sonda mostra inoltre, sensibilità e selettività nei confronti di H2S e non di altri composti solforati. Infatti la reazione tra WSP-1 e composti come cisteina e glutatione, porta alla formazione di un intermedio che non è in grado di ciclizzare e di conseguenza incapace di rilasciare il fluoroforo (Fig. 3.9)

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Fig. 3.8 Struttura chimica della sonda WSP-1.

Fig. 3.9 Meccanismo d’azione della sonda WSP-1: in presenza di H2S si ha produzione del fluoroforo, mentre in presenza di residui cisteinici monosostituiti, come Cisteina e Glutatione, si ottiene un intermedio che non è in grado di ciclizzare e perciò incapace di rilasciare il fluoroforo.

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