Sali di solfuro

I sali di solfuro inorganici come l’idrosolfuro di sodio (NaHS) e il solfuro di calcio (CaS) sono stati ampiamente utilizzati come equivalenti di H2S nella ricerca. Numerose funzioni biologiche regolate da H2S sono state identificate utilizzando questi sali solfuro. Tuttavia, un H2S-donor ideale per uso terapeutico dovrebbe mostrare una cinetica di rilascio lenta. A causa dell’elevata velocità di rilascio di H2S, che può portare ad un brusco calo pressorio, questi sali non trovano applicazione in clinica [Martelli A. et al., 2012].

1.3.5.2

Polisolfuri

La famiglia delle Alliaceae, a cui appartiene l’aglio, è ricca di composti contenenti zolfo e in grado di rilasciare H2S. I benefici salutistici ben noti dell'aglio (come gli effetti antipertensivi) sono stati recentemente correlati (almeno in parte) alla sua capacità intrinseca di rilascio di H2S. Allicina (diallil tiosulfinato) è il composto alliaceo maggiormente caratterizzato; in vivo, si decompone in una serie di composti reattivi contenenti zolfo tra cui diallil solfuro (DAS), diallil disolfuro

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(DADS), e diallil trisolfuro (DATS) [Amagase H., 2006]. È stato dimostrato che i globuli rossi umani ricchi di GSH possono innescare il rilascio di H2S dall'estratto di aglio, così come da DADS e DATS [Benavides G.A. et al., 2007]. Il fatto che la somministrazione di DADS in modelli sperimentali in vivo aumenti i livelli di H2S conferma l’ipotesi della produzione di H2S da parte di tali composti solforati, contenuti nell’aglio, nei tessuti biologici [Insko M.A. et al., 2009]. Inoltre è stato dimostrato che la generazione di H2S sia dovuta alla reazione di sostituzione nucleofila che avviene grazie alla presenza di tioli endogeni (come GSH), attraverso uno scambio tiolo/disolfuro [Benavides G.A. et al., 2007].

Fig.1.15: composti solforati derivati dalle Alliaceae.

1.3.5.3

GYY4137

(morpholin-4-methoxyphenyl-

morpholino-phosphinodithionate)

Oltre a molecole di origine naturale, sono stati sintetizzati composti capaci di rilasciare solfuro di idrogeno. Il reagente di Lawesson è un potente donatore di H2S in solventi organici, ma non può mimare la produzione di H2S endogeno a causa del rilascio rapido e incontrollato del gas [Zhao Y. et al., 2014; Hughes M.N. et al., 2009]. Questo composto è stato salificato con una molecola di morfolina, ottenendo il composto chiamato GYY4137 che rilascia H2S in modo più lento rispetto al reagente di Lawesson, mimando gli effetti del rilascio del solfuro d’idrogeno endogeno [Li L. et al., 2009]. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che 4.17 ± 0,5 nmol/25 min di H2S vengono rilasciate da 1 mM di GYY4137. Il rilascio di H2S da questo donatore è pH dipendente, con un maggiore rilascio a pH acido (3.0) e minore a pH neutro o basico (7.4 e 8.5) [Lil A. et al., 2008].

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Fig. 1.16: Struttura chimica del GYY4137 e del reagente di Lawesson

1.3.5.4

Ditioltioni

I ditioltioni (DTT) sono composti di origine sintetica e, a partire dal 3H-1,2-ditiol- 3-tione (D3T), sono state sintetizzate molecole, fra cui il 5-[4-metossifenil]-1,2- ditio-3-tione (ADT). È stato dimostrato che l’ADT ha attività chemoprotettiva, antiossidante, chemioterapica e radioprotettiva [Kensler T.W. et al., 1992]. Inoltre, ha la capacità di rilasciare H2S in soluzione acquosa, sebbene il meccanismo non sia ancora del tutto chiaro. È stato comunque dimostrato che ADT sciolto in tampone fosfato a 120 °C è in grado di rilasciare H2S [Qandil A.M., 2012; Caliendo G. et al., 2010].

Fig. 1.17: rilascio di H2S da parte dei DTTs.

I DTT sono stati ampiamente usati per studiare gli effetti biologici correlati all’ H2S nel sistema gastrointestinale. L’uso di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) è associato ad un elevato rischio di gastrolesività. Il solfuro di idrogeno può essere utile per ridurre tale effetto avverso e di conseguenza, sono stati progettati e sintetizzati numerosi composti in grado di rilasciare solfuro di idrogeno tramite la coniugazione dei FANS con una porzione ditiltionica. I

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farmaci ibridi H2S-FANS hanno mostrato una riduzione significativa degli effetti collaterali a carico del sistema gastrointestinale rispetto alle molecole native [Gargallo C.J., Lanas A., 2013; Chan M.V., Wallace J.L., 2013].

1.3.5.5 Isotiocianati

• Di origine vegetale

Gli isotiocianati sono sostanze chimiche che si formano in risposta a situazioni di stress, in piante appartenenti alla famiglia delle Cruciferae. Numerose piante edibili appartengono a questa famiglia, per citarne alcune: broccoli, cavolo, cavolini di Bruxelles, senape e cavolfiore [Fahey J., 2016; Johnson T., Dinkova- Kostova A., 2016]. I glucosinolati presenti nelle crucifere, vengono idrolizzati mediante l'azione dell'enzima mirosinasi in nitrili, tiocianati ed isotiocianati [Hayes J.D., et al., 2008]. L'idrolisi dei glucosinolati fornisce un importante meccanismo di difesa contro gli attacchi degli agenti patogeni, dei cambiamenti climatici e altre sollecitazioni meccaniche come taglio e masticazione. [Del Carmen Martínez-Ballesta M., et al., 2013] Sono stati identificati più di 120 diversi glucosinolati [Fahey J.W., et al., 2001; Dinkova-Kostova A.T., Kostov R.V., 2012]. Glucosinolati diversi producono isotiocianati distinti. Ad esempio, glucorafanina (GR) è il glucosinolato precursore del sulforafano (SFN; 1- isotiocyanato-4-(metilsulfinil) butano) mentre la gluconasturtiina è il glucosinolato dell'isotiocianato di feniletilenile (PEITC; 2-isotiociatoetilbenzene). Diversi studi clinici hanno dimostrato che la somministrazione di glucosinolati contenuti nelle crucifere o di isotiocianati promuove effetti protettivi e terapeutici in diverse patologie. In particolare, il SFN contenuto nei broccoli (somministrato sottoforma di broccoli maturi, estratto di germoglio di broccoli, estratto di semi di broccoli e polvere di broccoli) è stato testato con risultati promettenti in trials clinici su: tumore pancreatico [Lozanovski V.J., et al., 2014] prostatico [Alumkal J.J., et al., 2015], e della vescica [Leone A., et al., 2017].

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È stato osservato che vi è un’interessante sovrapposizione tra molti effetti

biologici attribuiti ad alcune Brassicaceae e quelli esibiti dal gastrasmettitore H2S. In uno studio condotto nel 2014 presso il laboratorio di farmacologia del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, sono stati selezionati alcuni importanti isotiocianati e glucosinolati naturalmente presenti in molte specie di

Brassicaceae e ne è stato valutato il rilascio di H2S in presenza di tioli organici:

l'isotiocianato di allile (AITC, presente nella senape nera, Brassica nigra L.), l'isotiocianato di 4-idrossibenzile (HBITC, presente in senape bianca, Sinapis alba

L.), isotiocianato di benzile (BITC, presente nel crescione inglese, Lepidium sativum L.) ed erucina (ERU, presente in diverse specie come broccoli, Brassica oleracea L., e rucola, Eruca vesicaria L. ed Eruca sativa Mill.) e il glucosinolato

sinigrina (SIN, precursore di AITC) L’attività di rilascio di H2S dei composti selezionati è stata studiata attraverso una tecnica amperometrica. Tutti i composti hanno mostrato capacità di rilasciare H2S in maniera trascurabile in assenza di tioli organici, ad eccezione del composto HBITC. Al contrario la presenza di cisteina ha promosso il rilascio di H2S con una cinetica lenta e controllata [Citi V., et al., 2014].

L'utilità nutraceutica e fitoterapeutica delle Brassicaceae nella prevenzione di importanti malattie umane, come il cancro, i processi neurodegenerativi e le malattie cardiovascolari, è stata ampiamente discussa nella letteratura scientifica [Dinkova-Kostova A.T., Kostov R.V., 2012]. Sebbene questi effetti siano ragionevolmente attribuiti agli isotiocianati, l'esatto meccanismo d'azione non è ancora noto. Questo è stato il primo rapporto sperimentale a dimostrare che alcuni isotiocianati naturali si comportano come agenti a lento di rilascio di H2S. Pertanto, le proprietà di rilascio dell'H2S da parte di alcuni isotiocianati naturali, come descritto in questo studio, danno spunti per comprendere le proprietà biologiche e farmacologiche e il meccanismo d'azione di molte specie di

Brassicaceae. Inoltre, sulla base delle crescenti conoscenze scientifiche sui ruoli

fisiopatologici di H2S, questa constatazione può contribuire a valutare e identificare il potenziale farmaceutico e nutraceutico degli isotiocianati naturali [Citi V., et al., 2014].

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• Di origine sintetica

Nel 2013, Martelli et al. hanno condotto uno studio sui profili di rilascio di H2S di cinque aril-isotiocianati di origine sintetica (PhNCS, PhNCS – COOH, PhNCS – CH3, PhNCS – CF3 e PhNCS – iPr), confrontati con composti di riferimento ben noti, come NaHS, DADS e GYY4137. Tutti i composti sono stati sottoposti per la prima volta ad una valutazione amperometrica, che ha permesso di avere una determinazione analitica del rilascio di H2S e quindi di eseguire una descrizione quali-quantitativa del processo. In assenza di L-cisteina, l'incubazione di tutti gli isotiocianati ha portato alla formazione di quantità trascurabili di H2S. In presenza di L-cisteina, l'incubazione di PhNCS ha portato ad un lento rilascio di H2S. La presenza di un gruppo di 4-carbossi (PhNCS-COOH) ha causato un aumento del rilascio di H2S, mediato da L-cisteina, senza influire sulla cinetica lenta del processo.

Indipendentemente dal meccanismo di reazione, il rilascio di H2S cisteina- dipendente è considerato una proprietà particolarmente vantaggiosa, perché consente a questi composti di comportarsi come donatori "smart" di H2S, in grado di liberare il gastrasmettitore solo in ambiente biologico [Martelli et al., 2013].

1.3.5.6 Ariltioammidi

Presso il Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, è stata sintetizzata una library di composti ariltioammidici di cui è stata valutata la capacità di rilasciare H2S attraverso uno studio farmacologico. La idrossibenzotioammide [Wallace J.L., et al., 2008; Wallace J.L., et al., 2010] è stata selezionata come struttura lead per costruire i vari composti, inserendo una serie di modifiche sulla porzione aromatica. La generazione di H2S è stata valutata attraverso rilevazioni amperometriche. Questo lavoro sperimentale ha portato a identificare un numero di ariltioammidi a rilascio di H2S con un meccanismo L-cisteina-dipendente. Tale profilo è stato considerato interessante per lo sviluppo di potenziali farmaci, in quanto questa caratteristica può fornire un H2S-donor selettivo in un ambiente

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biologico (cioè, in presenza di tioli organici endogeni come L-cisteina, glutatione ridotto, ecc.). Inoltre, la p-idrossibenzotioammide, che è stata selezionata come prototipo della classe di ariltioammidi ha prodotto effetti vascolari tipici di H2S, sia in esperimenti in vitro che in vivo. In particolare, ha provocato iperpolarizzazione delle membrane di cellule HAMSC (Human Aortic Smooth Muscle Cells), ha inibito la vasocostrizione indotta da noradrenalina in anelli aortici isolati di ratto, e ha ridotto la pressione arteriosa sistolica dopo somministrazione orale. Questi derivati ariltioammidici potrebbero, quindi, rappresentare strumenti utili per lo sviluppo razionale di promettenti agenti H2S- donors indirizzati al trattamento terapeutico delle malattie cardiovascolari [Martelli A. et al., 2013].

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Capitolo 2

Scopo della ricerca

La malattia di Alzheimer è la malattia neurodegenerativa progressiva più diffusa negli esseri umani e la principale causa di demenza in tutto il mondo. Poiché l'invecchiamento è il fattore di rischio primario dell’AD, la sua incidenza incrementa con l’aumentare della popolazione anziana. Le stime indicano che AD colpisce più di un terzo della popolazione di età superiore agli 85 anni, ponendo notevoli preoccupazioni per gli oneri economici degli Stati, ma soprattutto per le persone affette e per coloro che devono prendersene cura.

La progressione della malattia di Alzheimer è lenta ma inesorabile. I sintomi iniziali sono i disturbi della memoria a breve termine e di altre funzioni mnesiche. Negli stadi finali della malattia, i pazienti possono presentare incontinenza, mutismo, incapacità nella deambulazione e di conseguenza perdita totale di autosufficienza.

È appurato che quando il SNC subisce un danno, si abbia l’attivazione delle cellule di supporto dei neuroni, ovvero la microglia e gli astrociti, che liberano fattori proinfiammatori come le citochine, i radicali liberi e gli enzimi proteolitici. L'infiammazione è una risposta fisiologica protettiva necessaria per regolare i processi associati ai meccanismi di danno nell'organismo. Di conseguenza, una risposta neuroinfiammatoria acuta è benefica per il SNC, riducendo al minimo il danno attraverso l’attivazione del sistema immunitario innato. Al contrario, l'infiammazione cronica è caratterizzata dalla lunga attivazione della microglia, portando ad un aumento dello stress ossidativo e nitrosativo, che perpetuano il ciclo infiammatorio, prolungando ulteriormente l'infiammazione, che è determinante nelle diverse malattie neurodegenerative.

Dobbiamo, purtroppo, constatare che l’armamentario terapeutico attualmente disponibile è fallimentare. I trattamenti, al momento utilizzati, agiscono solo a livello sintomatico o ritardano l’esordio della patologia di pochi anni.

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Queste terapie farmacologiche si basano prevalentemente sull'ipotesi colinergica della patologia. Indagini biochimiche post-mortem dei tessuti cerebrali, da pazienti affetti da AD, hanno mostrato, infatti, una riduzione dell’attività dell’acetilcolintransferasi, della sintesi e del rilascio di acetilcolina e del riassorbimento della colina. Queste osservazioni hanno avvalorato l’ipotesi che la degenerazione dei neuroni colinergici e la perdita associata di neurotrasmissione colinergica, nella corteccia cerebrale, contribuiscano significativamente alla compromissione delle funzioni cognitive nella malattia di Alzheimer. Diversi approcci terapeutici mirano a migliorare la neurotrasmissione colinergica, ripristinando i livelli fisiologici di Ach, attraverso l’inibizione dell’acetilcolinesterasi.

Inoltre, numerosi studi hanno evidenziato l’importanza fisiopatologica del gastrasmettitore solfuro d’idrogeno (H2S) nel mantenimento dell’omeostasi di diversi sistemi dell’organismo. Nel SNC, a concentrazioni fisiologiche, H2S partecipa positivamente ai meccanismi cognitivi, di memoria e di neuroprotezione. I meccanismi alla base dell'azione neuroprotettiva di H2S coinvolgono i suoi effetti antiossidanti, antiapoptotici e antinfiammatori. Pertanto, si ritiene che i farmaci che rilasciano H2S possano avere un potenziale terapeutico nei disordini neurodegenerativi dell'invecchiamento, che hanno componenti ossidative e infiammatorie preminenti come nell’AD.

In questo lavoro di tesi sono stati testati nuovi farmaci ibridi ottenuti dalla combinazione di un inibitore dell’acetilcolinestrasi (AchEI), con moieties in grado di donare H2S. In particolare, è stato valutato l’effetto citoprotettivo di tali composti, delle moieties e dell’AchEI nativo, su un modello di neuroinfiammazione lipopolisaccaride-indotta, in cellule di microglia murine (BV-2). Inoltre, è stato valutato l’effetto antiossidante attraverso la quantificazione della produzione delle ROS e dell’NO. Infine, nell’ottica di valutare la capacità di rilasciare H2S a livello intracellulare dei nuovi composti, è stata effettuata la misurazione del rilascio di H2S all’interno delle cellule BV-2, attraverso un saggio spettrofluorimetrico, mediante utilizzo della sonda WSP-1.

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AchEI

+

+

Nuovo composto AchEI ibrido

Fig. 2.1 Rappresentazione schematica dei nuovi composti di sintesi formati da una

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