ESPERIMENTI IN FERMENTATORE

mercaptoetanolo 14 mM a cui vengono di seguito aggiunti 50 µl di zimoliasi (2 mg/ml). Successivamente le cellule vengono incubate a 37°C per 30 minuti e la formazione degli sferoplasti viene seguita con l’aiuto del microscopio. A questo punto la purificazione del DNA genomico viene effettuate utilizzando il Genomic DNA Purifi cation Kit della Fermentas seguendo le istruzioni della casa produttrice. 200µl del campione vengono miscelati con 400 µl di lysis solution e incubati a 65°C per 5 minuti. Poi si aggiungono 600 µl di cloroformio e si emulsiona agitando lentamente. Si centrifuga a 10000 rpm per 5 minuti, si recupera la fase acquosa superiore, si trasferisce in un tubo nuovo e si aggiungono 800 µl di precipitation solution ( 720 µl di acqua deionizzata sterile, 80 µl di precipitation solution 10X). Si miscela il tutto e si incuba a temperatura ambiente per 2 minuti. Dopo centrifugazione a 10000 rpm per 2 minuti si rimuove completamente il sovranatante e si dissolve il pellet di DNA in NaCl 1,2 M e si aggiunge Ribonucleasi A incubando per 10 minuti a 37°C per eliminare le tracce di RNA. Poi si aggiungono 300 µl di etanolo al 96% freddo e si lascia precipitare il DNA a -20°C per 20 minuti, si lava poi con 300µl di etanolo al 70% per rimuovere i sali, si lascia asciugare a 37°C e si risospende in 20 µl di acqua distillata sterile.

3.2.5 ESPERIMENTI IN FERMENTATORE

3.2.5.1 Fermentatore

E’ stato utilizzato un fermentatore da banco da 2 litri della Applikon Italia (Fig. 3.2) che permette il controllo dei seguenti parametri: temperatura, pH, ossigeno disciolto, velocità della girante. Un bioprocessore, collegato al fermentatore, controlla e mantiene i parametri ai valori desiderati durante la fermentazione. La temperatura è mantenuta costante tramite un flusso di acqua proveniente da un termostato a circolazione esterna. Il valore di pH viene misurato da un elettrodo specifico e mantenuto costante tramite l’aggiunta di una soluzione alcalina. L’elettrodo ad ossigeno misura costantemente l’O2 disciolto. Tale valore viene

espresso in percentuale ed è considerato uguale a 100 all’inizio della fermentazione. Esso tende ad abbassarsi durante la fermentazione, ma può essere mantenuto costante aumentando

la velocità della girante, aumentando il flusso di aria, o attraverso l’immissione di O2.

La quantità di aria ed eventualmente di O2 è regolata da un flussimetro, e la velocità della

65 fed-batch la fonte di carbonio viene aggiunta utilizzando una pompa peristaltica con flusso

variabile. Il fermentatore è inoltre dotato di un sistema di prelievo che permette di realizzare campionamenti quando necessario per la valutazione della biomassa e delle proteine prodotte dai lieviti ricombinanti.

Figura 3.2 - Schema del fermentatore da 2 litri

1) Entrata liquido termostato 2) Condotto prelievo 3) Condotto entrata aria 4) Condotto per il controllo pH 5) Condotto per il feed

6) Termometro 7) Fori per elettrodi 8) Supporto rotore 9) Piastra inferiore 10) Viti di chiusura 11) Contenitore

12) Supporto contenitore 13) Attacco per il rotore 14) Eliche

3.2.5.2 Prove di fermentazione con ceppi ricombinanti mutati di P. pastoris

Gli esperimenti di produzione di laccasi ricombinante in fermentatore sono stati condotti per i cloni di GS115 mutati Asp205Cys, Asp205Ser ed Asp205Lys e per la laccasi minoritaria Lcc2.

Le prove di fermentazione sono state effettuate seguendo le linee guida indicate dalla Invitrogen nel manuale Pichia Fermentation Process Guidelines. I parametri di fermentazione sono indicati in Tabella 3.6 e la composizione del terreno di fermentazione è riportata in Tabella 3.7.

La precoltura per la semina del fermentatore è stata preparata in terreno MGY (50 ml), utilizzando, per l’inoculo, cellule prelevate da una piastra MM. I parametri di fermentazione all’inizio del processo erano: temperatura, 25°C; pH, 5.0; aerazione, 1.5 vvm; velocità della girante, 750 rpm. Per contrastare la tendenza di P. pastoris di acidificare il terreno di coltura durante la crescita, il pH del mezzo viene mantenuto costante, in modo automatico, tramite aggiunta di idrossido di ammonio al 28%. Aerazione e velocità della girante sono aumentate gradualmente in modo manuale per mantenere la concentrazione di O2 disciolto al di sopra del

20%.

Dopo sterilizzazione a 121°C per 30 minuti, il terreno viene portato a pH 5.0 (30°C), con idrossido di ammonio 28%, ed emendato sterilmente con 1 ml di antischiuma (Antifoam 204, Sigma) e 4.35 ml di soluzione PTM1 Trace Salts per litro di brodo (Tabella 3.8).

Nella fermentazione effettuata in condizioni ottimizzate, la temperatura viene aumentata a 30°C e, quando necessario, viene aggiunto O2 ad un flusso pari a 0,05 – 0,2 vvm.

La strategia di fermentazione utilizzata prevede tre fasi: 1. accrescimento in batch su glicerolo;

2. accrescimento in fed-batch con glicerolo (feed di glicerolo 50 % ad un flusso di 10 ml/h per litro di brodo di fermentazione);

3. accrescimento in fed-batch con metanolo (feed di metanolo 50 % al un flusso di 3–6 ml/h per litro di brodo di fermentazione).

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Tabella 3.6 - Parametri di fermentazione per P. pastoris

Tabella 3.7 - Composizione del terreno (BS) utilizzato per la crescita in fermentatore del ceppo ricombinante di P. pastoris (composizione per litro di terreno)

Fermentation Basal Salt (BS) Medium

Acido fosforico 85% 26.7 ml Solfato di calcio 0.93 g Solfato di potassio 18.2 g Solfato di magnesio – 7H2O 14.9 g Idrossido di potassio 4.13 g Glicerolo 40.0 g

Tabella 3.8 - Composizione della soluzione PMT1 Trace Salts

PTM1 Trace Salts (per litro)

Solfato di rame – 5H2O 6.0 g Ioduro di sodio 0.08 g Manganese solfato - H2O 3.0 g Sodio molibdato – 2H2O 0.2 g Acido borico 0.02 g Cobalto cloruro 0.5 g Zinco cloruro 20.0 g Solfato di ferro – 7H2O 65.0 g Biotina 0.2 g Acido solforico 5.0 ml Parametro Valore

Volume di lavoro 1.1 litri

Temperatura 25–30°C

Ossigeno disciolto > 20%

pH 5.0

Agitazione 750-900 rpm

3.2.5.3 Determinazione della biomassa, dell’attività laccasica e del contenuto proteico La determinazione della biomassa, come peso secco, è stata effettuata su campioni di brodo colturale da 1 ml; per ciascuna determinazione sono state effettuate almeno tre repliche. Le cellule sono state separate dal mezzo di coltura mediante centrifugazione (per 5 minuti a 13000 g) ed i pellets cellulari sono stati essiccati a 110°C per 24 ore prima di essere pesati.

L’attività laccasica presente nei brodi di coltura è stata misurata tramite un saggio spettrofotometrico seguendo l’incremento di assorbanza a 420 nm dovuto all’ossidazione del substrato ABTS ed espressa in U.I.. La concentrazione proteica è stata determinata usando il metodo descritto da Bradford.