3.5.1 Immobilizzazione dell’enzima
L’immobilizzazione è stata effettuata per adsorbimento su Sepharose-ConA (Sigma- Aldrich), con una resa del 99,9% a pH 4.0. La resina Sepharose-Con A è stata lavata (2-3 volte) con tampone acetato 0.1 M, pH 4.0, successivamente è stata impaccata in una colonna cromatografica (1,0 x 10 cm) ed equilibrata con lo stesso tampone di partenza. L’enzima, diluito in 10 ml di tampone acetato 0.1 M, pH 4.0, è stato caricato sulla colonna cromatografica ad un flusso di 1 ml/min. Per calcolare la percentuale di enzima immobilizzato, è stato saggiato l’eluato della colonna sotto flusso di tampone acetato (1 ml/min) finché si è arrivati a non trovare più attività; le unità enzimatiche eluite corrispondono alla percentuale di enzima non immobilizzato. La procedura è estremamente rapida, e l’enzima immobilizzato è stabile e conserva il 100% dell’attività fino a 22 giorni, e ne conserva ancora l’80% dopo 1 mese.
L’attività della laccasi è stata determinata seguendo con HPLC il consumo di un substrato ben metabolizzato dall’enzima, il guaiacolo (60 ml 10 mM), che è stato fatto passare in ricircolo continuo sulla colonna con l’enzima immobilizzato ad un flusso di 1 ml/min, nell’arco di 24 ore.
3.5.2 Prove di degradazione di composti fenolici
Le prime prove di degradazione sono state effettuate utilizzando un sistema in ricircolo su una miscela di sette fenoli di 100 ml. I fenoli utilizzati (mostrati nella tabella 3.9, Sigma- Aldrich) a una concentrazione di 0,4 mg/ml totali sciolti in tampone acetato 0,1 M, pH 4.0, sono stati caricati in continuo su colonna contenente Sepharose-conA e la laccasi Lcc1 immobilizzata per adsorbimento (1x6 cm, ca. 5 ml, con 50 U DMP immobilizzate) ad un flusso di 1 ml/min.
Le prove di degradazione sono state effettuate anche utilizzando un sistema in batch (in Falcon contenente 0,5 ml di Sepharose Con-A con 5 U DMP immobilizzate), in cui l’enzima immobilizzato è posto a contatto della soluzione contenente i substrati da degradare e in continua agitazione, utilizzando sempre le stesse condizioni di pH e concentrazione dei substrati. Queste prove sono state effettuate sia per i fenoli singoli che in miscela di tre fenoli acido caffeico, p-cumarico e acido 4-idrissifenilacetico (0,4 g/L di ciascuno fenolo).
Tabella 3.9 – Fenoli utilizzati nelle prove di degradazione CH
OH OH
CH COOH Acido caffeico:
acido diidrossicinnamico PM. 180,6 CH2COOH OH Acido 3-idrossifenilacetico PM. 152,15 CH2COOH OH OH Acido 3,4-didrossifenilacetico PM. 168,15 CH2 OH
COOH Acido 4-idrossifenilacetico
PM. 152,15
CH2
OH
CH2COOH Acido 3-(4-idossifenil)-propionico
PM. 166,18
CH
OH OCH3
CH COOH Acido ferulico:
acido 4-idrossi-3-metossi cinnamico PM. 194,19
CH
OH
CH COOH Acido p-cumarico
PM: 164,16
3.5.3 Prove di degradazione di coloranti con enzima immobilizzato
Il sistema in batch è stato applicato anche alla degradazione di tre coloranti utilizzati in molti processi industriali: alizarina, amaranto e indaco (Sigma-Aldrich). I tre coloranti sono stati utilizzati separatamente a una concentrazione di 0,4 mg/ml in tampone acetato 0,1 M pH 4.0. E’ stata effettuata una prima prova di decolorazione in assenza di mediatori, e successivamente la capacità catalitica dell’enzima è stata provata sia in presenza di HBT che di acido violurico (entrambi a concentrazione 1 mM). Sono state poi fatte delle prove su amaranto e alizarina in miscela, con 0,2 e 0,4 mg/ml di ciascun colorante. La degradazione dei substrati è stata analizzata mediante HPLC.
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3.5.4 Analisi con HPLC
A vari intervalli di tempo (0, 4, 24, 28, 48, 52 e 72 ore) è stata prelevata un’aliquota di eluato ed è stata analizzata mediante HPLC per controllare il consumo del substrato.
Le cromatografie in HPLC sono state effettuate su una colonna YMC-Pack ODS-AM (25 cm x 0.46 cm) impiegando due solventi: una soluzione di acido acetico 2% in acqua milliQ (soluzione A) e una soluzione di acido acetico 2% e metanolo 30% in acqua milliQ (soluzione B), per un tempo di circa 60 minuti ad un flusso iniziale pari a 0,8 ml/min e una percentuale iniziale della soluzione B pari al 20%, monitorando l’eluato a 280 nm (il gradiente utilizzato è mostrato in Fig. 3.3).
Figura 3.3 - Gradiente di eluizione HPLC utilizzato.
3.5.5 Prove di decolorazione in “Microtiter Plate”
Al fine di analizzare un più ampio campione di coloranti è stato utilizzato un sistema di screening rapido su Microtiter Plate che permette di effettuare numerose prove contemporaneamente.
Una Microtiter Plate è una piastra con 96 pozzetti (8x12) ognuno dei quali può contenere una miscela diversa. E’ buona norma, comunque, lavorare in triplicati dai quali è possibile calcolare il valore medio e la deviazione standard. Un apposito spettrofotometro (50 MPR Microplate Reader, Varian) misura l’assorbanza in ciascun pozzetto. In tutti gli esperimenti effettuati con questo sistema, le unità enzimatiche utilizzate sono sempre state riferite ad ABTS come substrato.
0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 tempo, min % B 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 flusso, ml/min %B flusso
I saggi di decolorazione sono stati effettuati su coloranti contenenti gruppi cromofori diversi (Fig. 3.4), azoici (amaranth, carmoisine, new coccine, sunset yellow), antrachinonici (remazol brilliant blue R), triarilmetano (patent blue) e indigoidi (indigo) (Sigma-Aldrich). Sono stati impiegati complessivamente sette coloranti, che in alcuni casi sono stati divisi in due gruppi (“serie rossa” e “serie blu”) in base al loro massimo di assorbimento, in modo da effettuare la scansione in un minor intervallo di lunghezze d’onda, riducendo quindi il tempo necessario ad effettuare la lettura dell’intera piastra.
I coloranti della “serie rossa” con massimo di assorbimento compreso tra 450-550 nm, appartengono tutti alla classe degli azoici, i coloranti della “serie blu” appartengono a classi diverse ma hanno un massimo di assorbimento sempre compreso tra 550 e 700 nm:
Figura 3.4 - Coloranti utilizzati nelle prove in microtiter
Su questi sette coloranti è stata effettuata una prova preliminare utilizzando 10 mU/ml dell’enzima Lcc1 wt e 0,05 mg/ml di colorante, ad eccezione del Remazol Brilliant Blue R (più concentrato: 0,25 mg/ml) e del Patent Blue (più diluito: 0,025 mg/ml), in tampone Sodio/Fosfato pH 5.0 per un volume totale di 250 µl; sono stati condotti esperimenti con e senza mediatori (HBT o acido violurico, a concentrazione 1 mM).
Le prove successive, che hanno coinvolto solo i coloranti della serie rossa, sono state condotte con diverse concentrazioni di enzima (2,5 - 5 - 7,5 - 10 mU/ml), prima mantenendo il mediatore a concentrazione costante (1 mM) e poi variandolo proporzionalmente all’enzima (0,25 - 0,5 - 0,75 - 1 mM).
E’ stata poi misurata la degradazione del solo amaranto aumentando di molto la concentrazione dell’enzima (50 mU/ml, 100 mU/ml, 500 mU/ml, 1 U/ml) in assenza di mediatore. L’attività di Lcc1 wt è stata testata anche a diversi valori di pH (3.0 - 4.0 - 5.0).
Sunset yellow
Amaranth New Coccine
Remazol brilliant blue R Patent blue Carmoisine
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Questo tipo di esperimenti è stato utilizzato anche per andare a confrontare l’enzima nativo con la forma ricombinante in Pichia pastoris. Sono state scelte le condizioni in cui la decolorazione non era completa ed era quindi possibile seguirne l’andamento nel tempo e rilevare eventuali differenze: 100 mU/ml di E senza mediatori; 10 mU/ml di E + 1 mM di HBT e 2,5 mU/ml di E + 1 mM AV.
L’analisi dell’efficienza di decolorazione è stata anche estesa all’enzima espresso in
S. cerevisiae (Lcc1Sc) e K. lactic (Lcc1Kl).