Mero-14 Up •
Mero-25 Up
IstMes2 Non espresso
NCI-H28 Up •
Ren Up •
Tabella 5: Espressione endogena di CCNO rispetto alle MeT-5A e scelta delle linee cellulari in cui silenziare il gene
48 4.3.2 Valutazione dell’espressione genica e proteica di CCNO dopo silenziamento genico
Le Real Time RT-PCR sono state condotte su Mero-14, NCI-H28, Ren e Met-5A. Il silenziamento è risultato statisticamente significativo nelle Mero-14 (p-value = 0,001) con una riduzione del 59% dell’mRNA di CCNO, nelle NCI-H28 (p-value = 0,015) con una riduzione del 32%, nelle Ren (p- value = 0,00004) con una riduzione del 60% e nelle Met-5A (p-value = 0,001) con una riduzione del 62%. Il silenziamento può quindi ritenersi efficace per tutte le linee cellulari. Per ulteriore validazione inoltre è stato investigato anche il livello della proteina attraverso l’analisi al Western Blot nelle linee cellulari di MPM scelte, purtroppo l’anticorpo non è risultato specifico per la proteina di interesse e quindi – nonostante numerose prove di settaggio – non è stato possibile osservare il livello proteico.
In figura 20 sono mostrati i livelli di espressione genica di CCNO.
Figura 20: Sono evidenziati i risultati della Real Time RT-PCR dopo silenziamento di CCNO nelle varie linee cellulari
49 4.3.3 Saggio apoptotico
Il saggio apoptotico ha mostrato un trend tendente all’aumento dell’attività apoptotica (10-30%) per tutte le linee cellulari, sebbene statisticamente non significativo, in seguito a spegnimento di CCNO. Nella figura 21 sono evidenziati i fold change del livello apoptotico.
Figura 21: Fold change del livello apoptotico tra trasfezione con il siRNA C- ed il siRNA del gene per Mero-14, NCI-H28, Ren e MeT-5A
50 4.3.4 Wound Healing Assay
Il Wound Healing Assay non ha evidenziato differenze significative tra il siRNA di controllo ed il siRNA del gene. Sono riportate le foto fatte al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione per le Mero-14 in figura 22, le NCI-H28 in figura 23, le Ren in figura 24 e le MeT-5A in figura 25.
Figura 22: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su Mero-14 con siRNA C- e siRNA CCNO
Figura 23: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su NCI-H28 con siRNA C- e siRNA CCNO
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Figura 24: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su Ren con siRNA C- e siRNA CCNO
Figura 25: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su MeT-5A con siRNA C- e siRNA CCNO
52 4.3.5 Saggio della Sulforodamina B (SRB)
Il saggio dell’SRB ha evidenziato come il silenziamento di CCNO comporti un aumento della proliferazione nelle Ren del 27% statisticamente significativo (p-value = 0,017), invece per le Mero-14, NCI-H28 e MeT-5A non risulta esserci una variazione della capacità proliferativa. Nella figura 26 sono evidenziati i fold change della capacità proliferativa per le Ren e per le MeT-5A.
Figura 26: Fold change della capacità proliferativa tra trasfezione con il siRNA C- ed il siRNA del gene per Ren e MeT-5A
4.3.6 Colony Formation Assay
I risultati del Colony Formation Assay hanno mostrato differenze significative per le Ren nell’aumento della capacità di formare colonie (6,55 volte maggiore del controllo negativo) dopo trasfezione con il siRNA (p-value = 0,040), mentre per le Mero-14, NCI-H28 e Met-5A non ci sono state variazioni significative. La figura 27 mostra il fold change delle Ren e delle Met-5A con il siRNA di controllo ed il siRNA di CCNO, mentre la figura 28 mostra la foto del risultato.
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Figura 27: Fold change della capacità aggregante delle Ren e delle MeT-5A in seguito alla trasfezione con il siRNA di CCNO
Figura 28: Colony Formation Assay per Mero-14, NCI-H28, Ren e MeT-5A trattate con il siRNA C- ed il siRNA CCNO
54 4.3.7 Riassunto risultati CCNO
La tabella 6 ricapitola i risultati ottenuti in seguito alla trasfezione delle linee cellulari con il siRNA di CCNO.
CCNO
Mero-14
NCI-H28
Ren
MeT-5A
Silenziamento •• •• •• ••
Saggio apoptotico + + + +
Wound Healing Assay ND ND ND ND
SRB ND ND ++ ND
Colony Formation Assay ND ND ++ ND
Tabella 6: Riassunto risultati riguardanti CCNO
Legenda:
Simbolo Significato
•• Silenziamento statisticamente significativo • Silenziamento evidente ma non significativo ++ Aumento statisticamente significativo + Aumento evidente ma non significativo - - Diminuzione statisticamente significativo - Diminuzione evidente ma non significativo ND Nessuna differenza
4.4 Silenziamento di Thrombospondin 2 (THBS2)
Gli esperimenti condotti per CFB e CCNO sono stati effettuati anche per THBS2.
4.4.1 Espressione endogena di THBS2
La valutazione dei livelli di espressione di THBS2 ha evidenziato sovraespressione significativa per le Mero-14 (p-value = 0,032), Mero-25 (p-value = 0, 037), IstMes2 (p-value = 0,003) rispetto alle Met-5A, mentre le NCI-H28 e Ren non esprimono il gene. Quindi sono state silenziate tutte le linee cellulari sovraesprimenti il gene, eccetto le Mero-25 le quali non sono risultate trasfettabili. La fig. 29 mostra i livelli di espressione di THBS2 da parte delle linee cellulari di MPM rispetto alle MeT- 5A.
55
Figura 29: Real Time RT-PCR per mostrare l’espressione endogena del gene THBS2 nelle varie linee cellulari di MPM rispetto alla linea cellulare di controllo
La tabella 7 mostra i livelli basali di THBS2 nelle linee cellulari a nostra disposizione.
Linea Cellulare
Espressione rispetto
alle MeT-5A
Esperimenti di
silenziamento
Mero-14 Up • Mero-25 Up IstMes2 Up •NCI-H28 Non espresso
Ren Non espresso
Tabella 7: Espressione endogena di THBS2 rispetto alle MeT-5A
4.4.2 Valutazione dell’espressione genica e proteica di THBS2 dopo silenziamento genico
Le Real Time RT-PCR, per verificare l’avvenuto silenziamento, sono state condotte su Mero-14, IstMes2 e Met-5A. Il silenziamento è risultato significativo nelle Mero-14 (p-value = 0,001) con una riduzione del 84% dell’mRNA di THBS2, nelle IstMes2 (p-value = 0,00002) con una riduzione del 62% e nelle Met-5A (p-value = 0,002) con una riduzione del 51%. Il silenziamento può quindi ritenersi efficace per tutte le linee cellulari testate, considerando le differenze dovute alla differenza di espressione basale del gene. Per ulteriore validazione inoltre è stato investigato anche il livello
56 della proteina mediante l’analisi con Western Blot nelle linee cellulari di MPM scelte. In figura 30 sono mostrati i livelli di espressione genica e proteica di THBS2.
Figura 30: Sono evidenziati i risultati della Real Time RT-PCR e del Western Blot dopo silenziamento di THBS2 nelle varie linee cellulari. Il Western Blot evidenzia il silenziamento della banda a 180 kDa per le Mero-14 e della banda a
129 kDa nelle IstMes2, isoforme di splicing diverse della stessa proteina
4.4.3 Saggio apoptotico
Il saggio apoptotico ha mostrato un aumento statisticamente significativo dell’attività apoptotica per le Mero-14 in seguito a silenziamento di THBS2 (p-value = 0,032), con un aumento del 30% della morte cellulare nelle cellule trasfettate con il siRNA di THBS2 rispetto alla trasfezione con il siRNA di controllo; per le IstMes2 e le MeT-5A non è stata osservata variazione. Nella figura 31 sono evidenziati i fold change del livello apoptotico per le Mero-14 e le MeT-5A.
Figura 31: Fold change del livello apoptotico tra trasfezione con il siRNA C- ed il siRNA del gene per Mero-14 e MeT-5A
57 4.4.4 Wound Healing Assay
Il Wound Healing Assay non ha evidenziato differenze significative tra il siRNA di controllo ed il siRNA del gene. Sono riportate le foto al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione per le Mero-14 in figura 32, le IstMes2 in figura 33 e le MeT-5A in figura 34.
Figura 32: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su Mero-14 con siRNA C- e siRNA THBS2
Figura 33: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su IstMes2 con siRNA C- e siRNA THBS2
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Figura 34: Foto effettuate al momento dello scratch ed a 72h dalla trasfezione su MeT-5A con siRNA C- e siRNA THBS2
4.4.5 Saggio della Sulforodamina B (SRB)
Il saggio dell’SRB ha evidenziato come il silenziamento di THBS2 comporti una diminuzione della proliferazione delle IstMes2 del 41% statisticamente significativa (p-value = 0,044), per le Mero-14 e MeT-5A invece non risulta esserci una variazione della capacità proliferativa. Nella figura 35 sono evidenziati i fold change della capacità proliferativa per le IstMes2 e le MeT-5A.
Figura 35: Fold change della capacità proliferativa tra trasfezione con il siRNA C- ed il siRNA del gene per Mero-14 e MeT-5A
59 4.4.6 Colony Formation Assay
I risultati del Colony Formation Assay hanno mostrato differenze importanti per le IstMes2 nella diminuzione della capacità di formare colonie (66%) dopo trasfezione con il siRNA (p-value = 0,020), mentre per le Mero-14 e Met-5A non ci sono state variazioni significative. La figura 36 mostra il fold change delle IstMes2 e delle Met-5A con il siRNA di controllo ed il siRNA di THBS2, mentre la figura 37 mostra la foto del risultato.
Figura 36: Fold change della capacità aggregante delle IstMes2 e delle MeT-5A in seguito alla trasfezione con il siRNA di THBS2
Figura 37: Colony Formation Assay per Mero-14, IstMes2 e MeT-5A trattate con il siRNA C- ed il siRNA THBS2
60 4.4.7 Riassunto risultati THBS2
La tabella 8 ricapitola i risultati ottenuti in seguito alla trasfezione delle linee cellulari con il siRNA di THBS2.
THBS2
Mero-14
IstMes2
MeT-5A
Silenziamento •• •• ••
Saggio apoptotico ++ ND ND
Wound Healing Assay ND ND ND
SRB ND - - ND
Colony Formation Assay ND - - ND
Tabella 8: Riassunto risultati riguardanti THBS2
Legenda:
Simbolo Significato
•• Silenziamento statisticamente significativo • Silenziamento evidente ma non significativo ++ Aumento statisticamente significativo + Aumento evidente ma non significativo - - Diminuzione statisticamente significativo - Diminuzione evidente ma non significativo ND Nessuna differenza
61
V. DISCUSSIONE
Gli esperimenti condotti hanno fornito risultati utili a comprendere il compito di CFB, CCNO e THBS2 nell’MPM. Per verificare se ciascuno di essi svolgesse un ruolo chiave nella malignità senza interferire con il contesto fisiologico ogni esperimento è stato condotto anche sulle Met-5A: l’utilizzo di una linea cellulare di mesotelio immortalizzato non maligno come controllo ha permesso di distinguere tra effetti specifici per le cellule di MPM ed effetti generali per le cellule mesoteliali; inoltre ha permesso di identificare i geni sovra- o sottoespressi nell’MPM rispetto al mesotelio. Per quanto riguarda la scelta di investigare 5 linee cellulari diverse di MPM, la ragione risiede nell’elevata eterogeneità che presenta il tumore [144], con variazioni considerevoli da individuo ad individuo, che rende difficile generalizzare risultati ottenuti su singole linee cellulari o su piccole coorti di studio.
Il gene Complement Factor B (CFB) codifica per una proteina extracellulare appartenente al pathway alternativo dell’attivazione del complemento. CFB si trova sul braccio corto del cromosoma 6 (6p21.33) [Gene, ID: 629], è lungo 24.387 bp e presenta due forme alternative di splicing. La proteina (fig. 38) appartiene alla famiglia delle peptidasi S1 ed è lunga 764 aa con un P.M. di 85.533 Da; possiede 5 domini: all’N terminale 3 domini Sushi che compongono la frazione Ba, il dominio VWFA e Peptidasi S1 che compongono la frazione Bb.
Figura 38: CFB
Il complemento è un insieme di fattori proteici che prende parte alla risposta immunitaria innata, in particolare è responsabile della permeabilità vascolare, della vasodilatazione, della fagocitosi e della lisi cellulare. Le interazioni di CFB coinvolgono quindi soprattutto fattori del complemento [145- 147].
62 CFB è stato precedentemente associato ad alcune neoplasie, in particolare al carcinoma nasofaringeo [148-149], al cancro al seno [150-151] ed al cancro alla prostata [152]; non è però mai stato indagato nel dettaglio per evidenziare un suo ruolo primario o secondario nella comparsa della patologia tumorale. Per quanto riguarda l’MPM, in uno studio è stato osservato un aumento dell’espressione di CFB in seguito a sovraespressione ectopica del locus FUS1/TUSC2 in linee cellulari di MPM [153]. Infatti è stato evidenziato come il locus contenente il gene FUS1/TUSC2 è sottoespresso nell’84% dei casi di MPM e che il 36% dei pazienti affetti presenti perdita del suddetto gene. Questo locus è stato quindi proposto come nuovo oncosoppressore nell’MPM. Quando poi il trascritto è stato sovraespresso in linee cellulari di MPM e di pleura sana si è osservata una sovraespressione di numerosi geni, tra i quali anche CFB [153]. Gli autori hanno ipotizzato che tra questi geni ve ne siano alcuni con funzione di oncosoppressore e CFB potrebbe essere uno di questi. Un ulteriore studio pubblicato nel 2012 ha evidenziato come cambi l’espressione genica di cellule di MPM se cresciute su un monolayer o come sferoidi tridimensionali. Tra i 142 geni trovati deregolati figura anche CFB, inserito nel pathway della “Crescita Cellulare e Proliferazione”, il quale è risultato esser sovraespresso 10 volte più nel monolayer rispetto alle condizioni sferoidali [154].
Nel presente lavoro di tesi CFB è risultato overespresso in maniera significativa solo nelle Mero-14, circa 7 volte più delle MeT-5A. I test fenotipici hanno però mostrato che la deplezione di CFB non modifica sostanzialmente i risultati ottenuti rispetto alle colture di controllo. L’attività apoptotica, la capacità invasiva e la formazione di colonie non hanno risentito del diverso trattamento con il siRNA di CFB o con il siRNA C-. Il test dell’SRB ha mostrato un leggero trend di diminuzione della proliferazione (circa il 33%) nelle Mero-14, statisticamente non significativo.
Nel complesso quindi CFB non sembra svolgere un ruolo chiave nelle linee cellulari di MPM, ma potrebbe essere sovraespresso in alcuni casi come conseguenza dei cambiamenti somatici, risultando quindi un epifenomeno. Di interesse sarebbe lo studio del ruolo di CFB in un modello in vivo, d’altronde i fattori del complemento svolgono un compito esclusivamente come proteine secrete perciò le linee cellulari potrebbero non rappresentare un sistema modello ideale.
63 Il gene Cyclin O (CCNO) codifica per la proteina Ciclina O, presente a livello nucleare. Il gene si trova sul braccio lungo del cromosoma 5 (5q11.2) [Gene, ID: 10309], presenta una lunghezza di 2.529 bp e possiede due forme di splicing. La proteina appartiene alla famiglia delle cicline ed è lunga 350 aa, con un P.M. di 38.096 Da; presenta 3 domini funzionali: 1 dominio simil-ciclina, 1 dominio C-terminale ed 1 dominio N-terminale.
Questo gene fu inizialmente identificato come una Uracil DNA glicosilasi e chiamato UNG2 [155], solo in seguito fu correttamente proposto come ciclina [156]. Attualmente UNG2 rappresenta un’isoforma del gene UNG ma ancora oggi esiste confusione in letteratura. CCNO aumenta di 2-3 volte la sue concentrazione durante la fase G1 rispetto al valore medio sia nella linea cellulare HeLa sia in fibroblasti umani di polmone, mentre nella fase S e G2 raggiunge il suo minimo di concentrazione [156]. Nel 2009 uno studio condotto su linfociti di topo ha evidenziato come CCNO aumenti di espressione per attivare il pathway intrinseco dell’apoptosi scatenato da glucocorticoidi o da radiazioni-γ; CCNO si complessa con Cdk2 e ciò è necessario per l’attivazione delle caspasi iniziatrici [157]. Essendoci poca chiarezza sulla nomenclatura del gene anche i pathways e le interazioni in cui prende parte CCNO non sono chiari e numerosi databases conferiscono alla ciclina ruoli nella riparazione del DNA che sono però da ricondurre alla confusione regnante nel nominare la ciclina e la DNA glicosilasi.
Nel nostro studio CCNO è risultato sovraespresso in 4 linee cellulari di MPM (Mero-14, Mero-25, NCI-H28 e Ren) rispetto alle MeT-5A. I test fenotipici hanno suggerito che CCNO sia un oncosoppressore. Il suo silenziamento ha causato un leggero aumento dell’apoptosi, in tutte le linee cellulari (dal 10 al 30%). Il saggio per valutare l’invasività non ha evidenziato differenze, mentre la capacità proliferativa è aumentata del 27% nelle Ren (p-value = 0,017). Infine il Colony Formation Assay ha mostrato come le Ren siano particolarmente sensibili alla deplezione del gene, aumentando di circa 7 volte la capacità di formare colonie (p-value = 0,040). La leggera tendenza all’aumento dell’apoptosi, oltre a non essere statisticamente significativa, si aggira sul 10 – 30% ed è stata osservata anche nella linea cellulare di controllo, MeT-5A, ragion per cui non si può ritenere il gene responsabile dell’aumento della morte cellulare nell’MPM.
Il quadro finale sembra dare un possibile ruolo di oncosoppressore a CCNO nelle linee cellulari di MPM ed un suo silenziamento sembra aumentare la malignità nelle Ren. Il motivo per cui solo quest’ultime abbiano esibito una forte risposta alla deplezione conferma il fatto che l’MPM sia un tumore eterogeneo, risultando difficile trovare un marcatore specifico e sensibile con alte percentuali che valga in maniera universale. Di interesse sarà la valutazione dei cambiamenti
64 fenotipici in seguito ad iperespressione del gene, per evidenziare se la risposta delle linee cellulari sia in accordo con i risultati emersi dal silenziamento.
Il gene Thrombospondin 2 (THBS2) codifica per la proteina Trombospondina 2, una glicoproteina omotrimerica secreta nella matrice extracellulare (ECM). THBS2 si trova sul braccio lungo del cromosoma 6 (6q27) [Gene, ID: 7058], è lungo 38.265 bp e presenta sette forme alternative di splicing. La proteina (fig. 39) appartiene alla famiglia delle trombospondine ed è lunga 1.172 aa, sebbene sia poi ulteriormente processata, con un P.M. di 129.991 Da; presenta 16 domini: 1 dominio legante eparina N terminale, 1 dominio simil-procollagene, 3 domini TSP tipo 1, 3 domini TSP tipo 2, 7 domini TSP tipo 3, 1 dominio C terminale. Il polipeptide processato forma poi un omotrimero legato da ponti disolfuro.
Figura 39: Estremità C-terminale di THBS2
THBS2 appartiene alle proteine matricellulari, termine utilizzato per indicare polipeptidi che interagiscono con specifici componenti dell’ECM ma prendono parte anche ad altri processi intracellulari. I principali fattori con cui interagisce sono la trombina, il fibrinogeno, l’eparina, la fibronectina, il plasminogeno, la laminina, il collagene, varie integrine, il PDGFR, il CD47 e varie MetalloProteasi (MMP2 ed MMP9). I pathways in cui prende parte THBS2 sono numerosi: regola la concentrazione delle metalloproteasi nello spazio extracellulare, prende parte alla formazione del fagosoma interagendo con le integrine, modula l’adesione focale cellula/matrice, l’adesione cellula/cellula, il citoscheletro e l’angiogenesi.
THBS2 è stato correlato con varie tipologie di cancro, come il tumore ovarico maligno [158], il cancro gastrico [159], l’adenocarcinoma endometriale [160], la leucemia linfocitica acuta adulta [161] ed il tumore polmonare non a piccole cellule [162]; resta poco chiaro però il suo reale ruolo. Numerosi studi condotti su linee cellulari hanno correlato il gene in questione con un ruolo
65 oncosoppressivo: Chen e colleghi, studiando il MiR-1246 (di cui THBS2 risulta target) su una linea cellulare di cancro cervicale, hanno notato – tramite saggi di proliferazione, migrazione ed invasività – come la deplezione del miRNA aumenti la concentrazione della glicoproteina e diminuisca le caratteristiche maligne [163]. Inoltre nel 1999 uno studio ha proposto THBS2 come un potente inibitore di crescita tumorale ed angiogenesi: lo studio si basava sull’overespressione del gene in una linea cellulare di carcinoma a cellule squamose umane (che non lo esprimono) e la successiva iniezione delle cellule in topi nudi, i risultati hanno dimostrato la forte capacità antitumorale del gene [164]. Un ulteriore studio del 2002 ha confermato la capacità inibitoria della trombospondina con una terapia genica antiangiogenica [165]. Un lavoro del 2011 su linee cellulari di carcinoma orale a cellule squamose ha evidenziato aumento dell’espressione di THBS2 dopo trattamento con acido salvianolico b (un inibitore tumorale) con conseguente diminuzione della citotossicità ed aumento della proliferazione [166]. D’altro canto diverse pubblicazioni tendono invece ad evidenziarne un ruolo di oncogene. THBS2 infatti è stato associato ad un aumento dell’invasività nel carcinoma duttale infiltrante [167]. Sembra anche che la glicoproteina conferisca un fenotipo più aggressivo sia nel tumore ovarico epiteliale [168], sia nel tumore polmonare non a piccole cellule, in cui è stata evidenziata l’overespressione del gene ed è stato ipotizzato un possibile ruolo angiogenico [169]. Nel 2014 è stato scoperto THBS2 come uno dei geni sovraespressione nel cancro ovarico sieroso, associato ad una diminuzione della sopravvivenza ed un aumento delle metastasi [170].
Per quanto riguarda la correlazione tra THBS2 e l’MPM in bibliografia sono pochi gli studi condotti. Interessante un lavoro del 2009 che ha proposto THBS2 come marker identificativo dell’MPM: il lavoro si basava sulla capacità dei linfociti B tumor-infiltrating di attaccare l’MPM e produrre anticorpi associati ad antigeni specifici della neoplasia; gli anticorpi sono stati ottenuti da topi affetti da SCID e xenotrapiantati con tessuto di MPM umano. In seguito è stata costruita una library di mRNA da una linea cellulare di MPM e mediante il metodo SEREX (analisi sierologica di librerie di espressione ricombinanti) sono stati identificati gli anticorpi specifici per antigeni derivanti dall’MPM. La glicoproteina è risultata essere un antigene significativamente presente nel siero dei topi, inoltre analisi su pazienti affetti da MPM hanno confermato la presenza di anticorpi contro THBS2 nell’88% dei casi [171].
Nel nostro progetto di ricerca THBS2 è stato trovato overespresso in maniera statisticamente significativa in 3 linee cellulari di MPM (Mero-14, Mero-25 ed IstMes2) rispetto alle MeT-5A, in particolar modo le Mero-14 hanno evidenziato un aumento circa 300 volte superiore dell’espressione. I test fenotipici svolti hanno fornito un quadro generale per cui il gene può ritenersi un fattore importante per il mantenimento e la progressione della malignità tumorale. In
66 particolare il silenziamento del gene ha causato un aumento significativo dell’apoptosi (p-value = 0,032) nelle Mero-14 (maggiormente esprimenti il gene) con un incremento del 30% della morte cellulare. Il saggio per valutare l’invasività non ha dato valori alterati, mentre la capacità proliferativa è diminuita del 41% nelle IstMes2 (p-value = 0,044). Anche la capacità di formare