3.1 Linee cellulari
Sono state usate 5 linee cellulari di MPM (Mero-14, Mero-25, IstMes2, NCI-H28 e Ren) ed una linea cellulare di mesotelio normale immortalizzato (MeT-5A). Il sottotipo istologico delle Mero- 14, Mero-25, IstMes2 e Ren è epitelioide, per le NCI-H28 risulta ignoto.
Mero-14, Mero-25 e IstMes2 sono state gentilmente donate dall’Ospedale Universitario San Martino (Genova, Italia). Le MeT-5A e le NCI-H28 sono state acquistate dall’ATCC (American Type Culture Collection) e gentilmente donate da collaboratori del Dipartimenti di Farmacia dell’Università di Pisa. Le Ren sono state gentilmente donate dall’Università di Novara. L’identità di Mero-14, Mero-25, NCI-H28, Ren e Met-5A è stata verificata analizzando i markers genetici previo invio del campione alla BMR Genomics (Padova, Italia). Le IstMes2 invece sono una linea cellulare ottenuta localmente e non è disponibile alcuna certificazione.
Mero-14, Mero-25, and IstMes2 sono state cresciute in DMEM medium (Lonza, Basilea, Svizzera) con aggiunta del 10% di siero bovino fetale (Sigma Aldrich Corp., St Louis, Missouri, USA) e 1% Pen-Strep (Lonza, Basilea, Svizzera). Le NCI-H28 e Ren sono state cresciute in RPMI 1640 medium (Gibco, Life Technologies, Carlsbas, California, USA) con aggiunta del 10% di siero bovino fetale (Sigma Aldrich Corp. St Louis, Missouri, USA) e 1% Pen-Strep (Lonza, Basilea, Svizzera). Le MeT-5A sono state cresciute in Medium199 con HEPES (Life Technologies, Carlsbas, California, USA) con aggiunta di EGF (fattori di crescita dell’epidermide, 3.3 nM , Life Technologies, Carlsbas, California, USA), idrocortisone (400 nM, Sigma Aldrich Corp. St Louis, Carlsbas, California, USA), insulina (870 nM, Life Technologies, Carlsbas, California, USA), 10% di siero bovino fetale (Sigma Aldrich Corp. St Louis, Missouri, USA) e 1% Pen-Strep (Lonza, Basilea, Svizzera).
Sono state tutte mantenute in incubatore a 37°C con atmosfera umidificata e 5% (Forma* 311 Direct Heat Incubator, Thermo Scientific, Waltham, Massachussetts, USA).
3.2 Analisi espressione genica
3.2.1 Estrazione RNA da cellule
L’RNA totale dalle linee cellulari di MPM é stato estratto usando l’RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Olanda) seguendo il protocollo standard. Il test si basa sul metodo della guanidina
27 tiocianato: la guanidina tiocinato è un agente denaturante che permette sia la lisi cellulare sia l’inattivazione delle proteine. L’estrazione avviene attraverso l’utilizzo di colonnine che hanno alta affinità per l’RNA > 200 bp e permettono di separare questi ultimi dai detriti.
Il protocollo consiste in:
• ottenere il pellet di cellule per centrifugazione a 1100 rpm 8 minuti;
• aggiungere 350 µl di una soluzione con il buffer di lisi RLT e β-mercaptoetanolo per ogni campione ed in seguito con l’aiuto di una siringa degradare il pellet ed omogeneizzare il tutto;
• aggiungere 350 µl di etanolo al 70% e trasferire il tutto nella RNeasy Mini spin column;
• centrifugare a 10.000 rpm per 15’’ e poi scartare l’eluato;
• procedere con l’aggiunta di 700 µl del buffer di lavaggio RW1;
• centrifugare a 10.000 rpm per 15’’ e scartare eluato;
• aggiungere 500 µl buffer di lavaggio RPE;
• centrifugare a 10.000 rpm per 15’’ e scartare eluato;
• aggiungere 500 µl buffer di lavaggio RPE;
• centrifugare a 10.000 rpm per 2’;
• cambiare tubo di scarico e centrifugare a vuoto a 13.000 rpm per 1’;
• eluire l’RNA estratto con RNasi Free attraverso la centrifugazione per 10.000 rpm a 1’.
3.2.2. Quantificazione RNA
La concentrazione di RNA estratto è stata misurata spettrofotometricamente (SmartSpec 3000, Bio- Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Ogni campione è stato diluito 1:70 ed è stato misurato almeno due volte. La lettura è stata effettuata registrando i valori di assorbanza a 260 nm (A260). Sono stati inoltre valutati i rapporti A260/A280 per osservare eventuali contaminazioni da proteine e A260/A230 per impurità come fenolo e carboidrati. I valori medi di assorbanza registrati sono stati convertiti poi in concentrazioni attraverso la seguente formula:
/ = 260 ∗ 40 ∗ 70
1000
La seguente formula è stata ricavata dalla legge di Lambert-Beer: 70 è il fattore di diluizione utilizzato; 40 è la concentrazione espressa in µg/ml di una soluzione standard di RNA con assorbanza unitaria a & = 260 '(; 1000 è il fattore necessario per avere la concentrazione µg/µl.
28 3.2.3. Sintesi cDNA
La retrotrascrizione dell’mRNA in cDNA è stata ottenuta mediante il kit iSCRIPT cDNA synthesis (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA).
Il principio teorico su cui si basa il procedimento si deve all’enzima Retrotrascrittasi, una DNA Polimerasi RNA Dipendente, la quale sintetizza in direzione 5’ –> 3’ un filamento di DNA a partire da uno stampo ad RNA; il duplex ibrido DNA-RNA è poi separato e tramite un’RNAsi è degradato l’acido ribonucleico; infine è sintetizzato il secondo filamento di DNA ottenendo un cDNA duplex. L’enzima è la Retrotrascrittasi di Moloney Murine Leukemia Virus (MMuLV), modificata ed ottimizzata per la sintesi di cDNA e per essere RNAsi H+; i primers sono costituiti da oligo(dT) e random esameri. La miscela è ottimizzata per la produzione di targets con una lunghezza inferiore ad 1 Kb.
Il kit prevede la retrotrascrizione di 1 µg di RNA totale in un volume finale di reazione di 20 µl. Il protocollo prevede per ogni campione:
4 µl di 5x iScript reaction mix;
1 µl di iScript reverse transcriptase;
X µl di acqua nuclease-free per portare a volume;
X µl di RNA stampo.
Il profilo di retrotrascrizione prevede:
• 5’ a 25°C;
• 30’ a 42°C;
• 5’ a 85°C.
3.2.4. Real Time RT-PCR
La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una tecnica di amplificazione esponenziale di DNA che sfrutta una DNA Polimerasi termostabile per sintetizzare il prodotto di interesse. Si basa sulla ripetizione di 3 fasi: la fase di denaturazione, la fase di appaiamento ed infine la fase di sintesi. Le variabili che influenzano la riuscita di una PCR sono molte: il disegno dei primer, la quantità di stampo iniziale, la concentrazione dello ione , la temperatura di melting (Tm), la stabilità dell’enzima, la quantità dei nucleotidi.
La RT-PCR rappresenta una PCR normale il cui prodotto di amplificazione è un cDNA prodotto da una precedente reazione di retrotrascrizione.
29 A prescindere dalla quantità di partenza la PCR arriva ad un fase di plateau in cui non si ha più amplificazione esponenziale, ciò si deve alla deplezione dei materiali di partenza ed alla produzione di prodotti che inibiscono la reazione. Una conseguenza di ciò è che la PCR può considerarsi al massimo una tecnica semiquantitativa.
Una variante quantitativa che permette di analizzare l’espressione genica è la Real Time RT-PCR. Esistono varie tecniche attraverso cui è possibile monitorare la quantità di DNA prodotto, una delle più note si basa sulle sonde TaqMan (fig. 11): oltre ai due primer specifici vi è la presenza di una sonda, anch’essa specifica per la sequenza target, contentente al 5’ un reporter fluorescente ed al 3’ un quencher (il quale assorbe la radiazione emessa dal fluoroforo se posti relavitamente vicini); in questa maniera se la sonda è irradiata non rilascerà energia e non sarà visibile. La DNA Polimerasi utilizzata possiede attività 5’ esonucleasica e, scalzando i nucleotidi della sonda, permette l’emissione del segnale fluorescente – direttamente proporzionale alla quantità di DNA prodotto –.
Figura 11: Principio sonda TaqMan
La quantificazione è ottenuta fissando un valore soglia di fluorescenza – essendo certi che sia nella fase di amplificazione esponenziale – e registrando il numero di cicli necessario per il gene di interesse per raggiungere la soglia di fluorescenza decisa (threshold cycle, Ct) (fig. 12). La normalizzazione e la quantificazione relativa è svolta con dei geni di riferimento (geni housekeeping, HK). Un gene di riferimento è per definizione un gene che dovrebbe essere stabile sempre e dovunque nel sistema sperimentale di interesse, in modo da poter permettere una comprensione delle variazioni del gene target nella cellula.
30 Ad una determinata soglia di fluorescenza la quantità di DNA presente per il gene target ed il gene HK è la stessa, il parametro che varia è il Ct: maggiore è la quantità iniziale e minore è il Ct per raggiungere la soglia.
Figura 12: Modelli per la quantificazione del DNA
Per questo dato che:
)*+,-) = ( )*+,-) ./.0.*1-∗ 22)345673
89 ( 89 ./.0.*1-∗ 22):;
dove N rappresenta la concentrazione di mRNA al valore soglia. Quindi al valore soglia:
)*+,-) 89
per cui:
( )*+,-) ./.0.*1- ( 89 ./.0.*1-
22):<2)345673
da cui è possibile calcolare quante volte è più o meno espresso il gene target rispetto agli HK. La Real Time RT-PCR è stata effettuata utilizzando sonde TaqMan® (Applied Biosystem Inc, Foster City, California, USA) specifiche per i geni di interesse.
La miscela di reazione utilizzata è la 5x HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (no ROX) (Solis BioDyne Tartu, Estonia) e prevede per ogni campione:
5 µl di 5x HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (no ROX);
1 µl di sonde TaqMan®;
1 µl di ;
31 Il profilo di termociclizzazione prevede:
1) 1 ciclo da 95°C per 30’’; 2) 2 cicli da 95°C per 30’’; 3) 1 ciclo da 95°C per 15’; 4) 40 cicli da: 95°C per 15’’
60°C per 1’.
Per valutare l’espressione genica prima e dopo il silenziamento ogni livello di mRNA è stato misurato in tripletta per esperimento ed ogni esperimento è stato a sua volta ripetuto 3 volte.
3.3. Analisi espressione proteica
3.3.1. Estrazione proteine da cellule
L’estrazione delle proteine dalle linee cellulari è stata effettuata attraverso l’uso della Ripa Solution. La funzione della Ripa Solution è di permettere la lisi delle cellule ed evitare la degradazione delle proteine facilitandone l’estrazione.
I componenti della Ripa Solution e le rispettive proporzioni sono:
88% di Ripa Buffer;
10% di inibitore delle Proteasi;
1% di inibitore delle Fosfatasi;
1% di PMSF 100 mM (inibitore delle Serina Proteasi) solubilizzato in isopropanolo. Il protocollo prevede:
• centrifugare il pellet di cellule a 10.000 rpm per 1’ a 4°C e poi scartare surnatante;
• aggiungere la Ripa Solution (da 20 µl a 100 µl a seconda del pellet);
• incubare per 15’ in ghiaccio;
• Centrifugare a 13.000 rpm per 15’ a 4°C e recuperare surnatante, contenente le proteine.
3.3.2. Quantificazione proteine
Il kit usato per la quantificazione è il QuantumMicro Protein (EuroClone, Siziano (PV), Italia). Il principio teorico della quantificazione delle proteine consiste nel registrare i valori di assorbanza di gruppi cromofori, ovvero molecole o parti di esse capaci di assorbire onde elettromagnetiche del visibile o del vicino UV. La quantificazione è possibile poiché l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione, secondo la legge di Lambert-Beer.
32 Il metodo di rilevazione del kit si basa sull’acido bicinconinico: la soluzione proteica è posta in ambiente alcalino a contatto con citrato o tartrato di rame; lo ione = probabilmente interagisce con i gruppi amminici dei legami peptidici riducendosi a ione =, in seguito l’acido bicinconinico assieme allo ione rameoso forma un complesso fortemente assorbente a 562 nm.
Il protocollo prevede che per ogni campione la Working Solution (WS) sia in rapporto 1:1. Il volume totale per ogni campione è pari a 200 µl in piastre da 96 pozzetti. La WS è composta da 3 reagenti, con le seguenti proporzioni: 50% Reagente A, 48% Reagente B, 2% Reagente C.
Dopo una fase di incubazione al buio a 37°C per 30’ è stata effettuata la lettura dell’assorbanza. L’assorbanza delle proteine estratte è stata misurata con l’uso di un lettore di piastra (iMarkTM Microplate Absorbance Reader, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Ogni campione è stato misurato 2 volte. Le concentrazioni sono state ottenute calcolando la media delle assorbanze, corrette con le misure del bianco, e trasformate attraverso una retta di taratura con la BSA realizzata con il test dei minimi quadrati.
3.3.3. Western Blot
La tecnica del Western Blot permette di individuare la presenza di una proteina specifica di interesse in un estratto proteico; si basa inizialmente su una separazione delle proteine grazie ad una SDS-Page, in seguito le proteine sono trasferite elettricamente su una membrana di nitrocellulosa; la stessa è incubata con latte per saturare tutti i siti aspecifici. Infine si incuba con anticorpo primario e secondario per rilevare la banda della proteina di interesse tramite una reazione di chemioluminescenza. Il Western Blot si può ritenere una tecnica qualitativa e semiquantitativa nell’analisi delle bande ottenute.
Nel caso specifico, l’SDS-Page è stata effettuata caricando 30 µg per ogni campione e sono stati usati gel con % di poliacrilammide dall’8 al 12%. I campioni sono stati trattati con una WS in rapporto 1:1, con le seguenti componenti:
5% di β mercaptoetanolo;
95% di Laemmli Buffer.
Sono stati in seguito denaturati per 10’ a 97°C. In seguito alla corsa elettroforetica è stato effettuato il trasferimento su membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata poi bloccata con l’uso di latte in polvere solubilizzato in PBS contenente lo 0,1% di Tween 20X. L’incubazione con vari anticorpi primari è stata svolta tutta la notte a 4°C in agitazione sul basculante; in seguito ad una fase di lavaggi in TBS Tween, TBS, PBS Tween o PBS è stata effettuata l’incubazione con gli anticorpi secondari coniugati all’HRP per 1h sul basculante a temperatura ambiente. Dopo un’ulteriore fase
33 di lavaggi la lettura è stata effettuata in chemioluminescienza previa incubazione della membrana con con il kit Western Lightning® Plus-ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA); il kit è composto da due reagenti che vanno usati in rapporto 1:1. L’immagine è stata acquisita attraverso il Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA).
3.4. Trasfezioni e saggi funzionali
3.4.1. Prodotti chimici
Gli anticorpi utilizzati sono:
CFB policlonale (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA);
CCNO policlonale (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA);
THBS2 policlonale (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA);
anticorpi secondari HRP coniugati anti-rabbit, anti-goat e anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA).
Le sonde per la Real Time RT-PCR sono state comprate dall’Applied Biosystems (Foster City, California, USA) e sono:
CFB (ID:00156060_m1), come gene target;
CCNO (ID: 00221731_m1), come gene target;
THBS2 (ID: 00170248_m1), come gene target;
RPLP0 (ID: 99999902_m1), come gene di riferimento;
TBP (ID: 00427620_m1), come gene di riferimento;
HPRT1 (ID: 01003267_m1), come gene di riferimento;
3.4.2. Trasfezioni siRNA
Le trasfezioni sono state effettuate con i siRNA, le cui sequenze target sono:
CCNO: 5’-CCGGGCGTTGAAGGTAGTAAA-3’ (Qiagen, Venlo, Olanda);
CFB: 5’-CAGCTCAATGAAATCAATTAT-3’ (Qiagen, Venlo, Olanda);
THBS2: 5’-CCTCAAGTACGAATGCAGAGATATT-3’ (Invitrogen, Carlsbas, California, USA);
AllStars Hs Cell Death Control (Qiagen, Venlo, Olanda);
34 I siRNA sono stati risospesi nel buffer fornito dalla casa produttrice per una concentrazione finale di 20 µM. L’agente trasfettante usato è stato l’HiPerFect® (Qiagen, Venlo, Olanda).
Il procedimento richiede la semina del numero desiderato di cellule in una piastra da 6 pozzetti e la trasfezione effettuata 24 h dopo; il protocollo prevede:
• diluizione dei siRNA alla concentrazione voluta con i mezzi di crescita senza siero bovino fetale e Pen-Strep;
• aggiunta del volume scelto di HiPerFect®;
• vortexare ed effettuare una rapida centrifugazione dei siRNA;
• incubare 10’ per permettere la formazione dei complessi;
• aggiungere ai pozzetti goccia a goccia.
Le cellule sono state quindi mantenute nell’incubatore dalle 24 h ai 14 giorni. Per valutare l’efficienza del silenziamento sono state effettuare Real Time RT-PCR.
3.4.3. Saggio apoptotico
Il kit utilizzato è il Caspase - Glo® 3/7 Luminescence Assay (Promega Corp., Madison , Wisc., USA). Tale saggio apoptotico permette di valutare l’attività apoptotica delle cellule in studio: le cellule – se in apoptosi – esprimono e rilasciano caspasi (come le caspasi 3 e 7); questi enzimi sono capaci di riconoscere sequenze specifiche e tagliarle. Il kit fornisce un substrato delle caspasi 3/7 proluminescente, che contiene il peptide DEVD tagliato dagli enzimi; in seguito al taglio il substrato rilascia aminoluciferina, a sua volta substrato della luciferasi per produrre la luce.
Le cellule sono state seminate nelle piastre da 6 pozzetti, dopo prove di settaggio, con le seguenti quantità:
150.000 cellule per pozzetto: IstMes2, Ren;
200.000 cellule per pozzetto: Mero-14, Mero-25, MeT-5A;
300.000 cellule per pozzetto: NCI-H28.
La trasfezione è stata effettuata 24 h dopo. A 72 h dalla trasfezione le cellule sono state recuperate e 50 µl di ognuna sono stati trasferiti in piastre da 96 insieme a 100 µl di reagente (Caspase - Glo® 3/7 Luminescence Assay). Dopo 60’ di incubazione è stata letta la luminescenza con il luminometro (Tecan Sunrise, Austria GMBH) e rilevata l’attività apoptotica delle cellule trasfettate con il siRNA target rispetto a quelle trasfettate con il siRNA di controllo. Ogni campione è stato analizzato in doppietta ed ogni misurazione è stata effettuata in tripletta per esperimento, infine ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte.
35 3.4.4. Wound Healing Assay
Il Wound Healing Assay valuta la capacità di migrazione cellulare. Le cellule sono state seminate nelle piastre da 6 pozzetti, dopo prove di settaggio, con le seguenti quantità:
130.000 cellule per pozzetto: IstMes2;
200.000 cellule per pozzetto: Ren;
250.000 cellule per pozzetto: MeT-5A;
300.000 cellule per pozzetto: Mero-14;
350.000 cellule per pozzetto: NCI-H28.
È stato innanzitutto necessario calcolare per ogni linea cellulare il tempo necessario per richiudere lo scratch, effettuato in condizioni basali con una punta sterile per pipette, ed è stato visto che:
le MeT-5A impiegano 45 h a richiudere lo scratch;
le NCI-H28 impiegano 45 h a richiudere lo scratch;
le Mero-14 impiegano 33 h a richiudere lo scratch;
le Ren impiegano 20 h a richiudere lo scratch;
le IstMes2 impiegano 18 h a richiudere lo scratch;
Dopo aver stabilito la tempistica necessaria le cellule sono state trasfettate, in esperimenti indipendenti, 24 h dopo la semina con i rispettivi siRNA; e sono stati effettuati degli scratch lineari sulle cellule a confluenza:
a 27 h dalla trasfezione per le MeT-5A;
a 27 h dalla trasfezione per le NCI-H28;
a 39 h dalla trasfezione per le Mero-14;
a 52 h dalla trasfezione per le Ren;
a 54 h dalla trasfezione per le IstMes2.
Le quantità di cellule seminate e le ore in cui sono stati effettuati gli scratch sono stati decisi dopo prove di settaggio. A 72 h dalla trasfezione sono state valutate le migrazioni cellulari calcolando la distanza di chiusura dello scratch per ogni linea cellulare trasfettata con il siRNA target rispetto al siRNA di controllo. Per ogni esperimento le foto sono state ottenute con un ingrandimento 10X attraverso un microscopio ottico ed ogni esperimento è stato ripetute 3 volte.
36 3.4.5. Saggio della Sulforodamina B (SRB)
Il saggio dell’SRB permette di evidenziare la citotossicità e la proliferazione cellulare. Si basa sulla capacità dell’SRB di legare elettrostaticamente ed in maniera pH dipendente i residui aminoacidici basici delle proteine di cellule fissate con l’acido tricloroacetico.
Il saggio è stato effettuato per valutare la citotossicità dei siRNA trasfettati e il tasso di proliferazione delle cellule a seguito del silenziamento dei geni target. Le cellule sono state seminate nelle piastre da 96 pozzetti, dopo prove di settaggio, con le seguenti quantità:
1.500 cellule per pozzetto: IstMes2;
2.000 cellule per pozzetto: Ren;
3.000 cellule per pozzetto: Mero-14, Mero-25, NCI-H28, MeT-5A.
Dopo 24 h una piastra è stata fissata come Day 0, mentre le altre sono state trasfettate e fissate a 6 – 8 giorni dalla trasfezione. Il fissaggio è avvenuto aggiungendo 100 µl di acido tricloroacetico per pozzetto (TCA, Sigma Aldrich Corp. St Louis, MO, USA), successiva incubazione per 60’ a 4°C e poi lavaggio con . In seguito ogni piastra è stata colorata con 100 µl di 0,4% p/v SRB (Sigma
Aldrich Corp., St Louis, MO, USA) in acido acetico 1% per 30’ al buio e dopo lavata con acido acetico 1%. Il giorno seguente sono stati aggiunti 100 µl di Tris Base 10 mM per pozzetto e le piastre sono state mantenute in agitazione per 10’. Infine è stata effettuata la lettura al lettore di piastra (iMarkTM Microplate Absorbance Reader, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) a 492 nm permettendo la valutazione dell’effetto del siRNA target rispetto al siRNA di controllo. Ogni linea cellulare è stata seminata in 4 pozzetti per esperimento ed ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte.
3.4.6. Colony Formation Assay
Il Colony Formation Assay valuta la capacità di formare colonie delle cellule dopo il trattamento con i siRNA. Le cellule sono state seminate nelle piastre da 96 pozzetti, dopo prove di settaggio, con le seguenti quantità:
150.000 cellule per pozzetto: IstMes2, Ren;
200.000 cellule per pozzetto: Mero-14, Mero-25, MeT-5A;
300.000 cellule per pozzetto: NCI-H28.
Dopo 24 h sono state trasfettate con i siRNA rispettivi. In seguito ad ulteriori 24 h sono state staccate e trasferite in piastre da 6 pozzetti. Dopo 14 giorni è stato rimosso il mezzo e le cellule
37 sono state fissate e colorate con una soluzione di etanolo 10% avente cristal violetto 0,1%. Le immagini sono state acquisite con una “Canon eos 60d”. Ogni esperimento è stato ripetute 3 volte.
3.5. Analisi Statistica
L’analisi statistica per la misurazione dell’espressione genica e sui risultati dei test fenotipici è stata effettuata con un test t di Student a due code. Le statistiche sono state ottenute con Statgraphics Centurion Xv (StatPoint, Inc.).
38
IV. RISULTATI
4.1 Prove di trasfettabilità
L’efficienza di trasfettabilità non può considerarsi uniforme tra vari esperimenti, le variabili da tenere in considerazione sono numerose, le più importanti possono ritenersi: la tipologia di agente trasfettante usato, il siRNA e le caratteristiche delle linee cellulari. Per questo, prima di procedere con gli esperimenti volti a valutare la reversione fenotipica delle linee cellulari a seguito della deplezione dell’espressione di uno dei geni in studio, è stato necessario valutare varie combinazioni tra siRNA e agente trasfettante. In questo studio l’agente trasfettante utilizzato è stato l’ HiPerFect® (Qiagen, Venlo, Olanda), un vettore lipidico. L’efficienza di trasfettabilità è stata valutata con l’utilizzo di due siRNA di controllo: l’AllStars Hs Cell Death Control e AllStarsNegative Control; il primo capace di silenziare geni fondamentali per la vita delle cellule e quindi responsabile della loro morte, il secondo invece non agisce sulla vitalità della cellula, fungendo da controllo negativo. In particolare, le concentrazioni di siRNA testate sono state:
25 nM, 50 nM, 100 nM per Mero-25, IstMes2, Ren, NCI-H28, MeT-5A;
20 nM, 40 nM, 80nM per Mero-14.
I volumi di HiPerFect® provati sono stati: 7 µl, 14 µl e 21 µl, secondo quanto suggerito dai rispettivi datasheet dei reagenti.
Ogni linea cellulare è stata monitorata nell’arco delle 72 h successive alla trasfezione ed è stata scelta la combinazione ottimale tra concentrazione di siRNA e volume di Hiperfect che mostrava una differenza maggiormente significativa in termini di vitalità, morfologia ed adesione delle cellule tra Cell Death Control (siRNA C+) e Negative Control (siRNA C-). Di seguito le fotografie scattate a 72 h dalla trasfezione e le rispettive combinazioni scelte per ogni linea cellulare.
39
Mero-14: 20 nM siRNA – 7 µl HiPerFect®
Mero-25: 100 nM siRNA – 21 µl HiPerFect®
40
NCI-H28: 50 nM siRNA – 21 µl HiPerFect®
Ren: 50 nM siRNA – 7 µl HiPerFect®
41 L’unica linea cellulare che ha evidenziato bassa efficienza di trasfezione è Mero-25, per cui non è