Espressione e purificazione di rMOG ED (His)

Cellule elettrocompetenti di E. coli appartenenti al ceppo ER2566 sono state trasformate con i plasmidi pQE12rMOGED(His)6 e pREP4, entrambi con

concentrazione 0,120 µg/µl. La trasformazione è stata effettuata mediante elettroporazione. Successivamente le cellule sono state piastrare su terreno LB Agar contenente ampicillina e kanamicina e incubate a 37 °C per tutta la notte.

E’ stata utilizzata una singola colonia derivante dalla trasformazione per inoculare 10 ml di terreno LB contenente ampicillina e kanamicina; la coltura è stata incubata 37 °C sotto agitazione per tutta la notte.

Un’aliquota di 1 ml della precoltura così ottenuta è stata usata per inoculare 1 litro di LB contenente ampicillina e kanamicina. I batteri sono stati fatti crescere sotto agitazione a 37 °C fino a quando la densità ottica misurata a 600 nm non ha raggiunto un valore compreso tra 0,5 e 0,8. Successivamente è stata indotta l’espressione di rMOGED(His)6 tramite

aggiunta di IPTG in concentrazione finale 1 mM e incubando a 37 °C, sotto agitazione, per tutta la notte.

E. coli è largamente impiegato per la produzione di proteine ricombinanti che non necessitano di modificazioni post-traduzionali per la loro attività biologica. Tuttavia alti livelli di espressione di proteine ricombinanti in

E. coli spesso portano ad accumularle come aggregati insolubili in vivo, cioè come corpi inclusi.64,65

L’espressione proteica in questa forma presenta alcuni vantaggi:

- i corpi inclusi spesso contengono esclusivamente la proteina ricombinante;

- la proteina ricombinante contribuisce per più del 30% del totale delle proteine cellulari;

64 _{J. F. Kane, D. L. Hartley, Formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia}

coli, Trends Biotechnol., 1988, 6, 95–101.

65 _{B. Fahnert, H. Lilie, P. Neubauer, Inclusion Bodies: formation and utilisation, P. Adv.}

- fornire una protezione alla cellula contro la tossicità causata dalla proteina ricombinante, poichè queste formazioni non presentano una propria attività biologica;

- i corpi inclusi possono essere accumulati nel citoplasma in quantità notevolmente più alte rispetto a proteine solubili.

Tuttavia le proteine espresse nei corpi inclusi sono prive di attività biologica e sono necessarie complesse procedure di solubilizzazione, refolding e purificazione per recuperare il prodotto effettivamente attivo.

La purificazione dei corpi inclusi dal restante lisato cellulare risulta piuttosto semplice, ma, al tempo stesso, esiste una problematica che si presenta nel momento in cui si procede alla solubilizzazione della proteina espressa. Generalmente i corpi inclusi sono solubilizzati usando un’alta concentrazione di agenti denaturanti, come l’urea o il guanidinio HCl, insieme a agenti riducenti come il β-mercaptoetanolo. Quindi è necessario utilizzare, nel passaggio successivo, un metodo di diminuzione della concentrazione dell’agente denaturante per permettere il giusto ripiegamento e, allo stesso tempo, prevenire l’aggregazione della proteina.

rMOGED(His)6 è stata espressa nei corpi inclusi e il suo refolding è stato

ottenuto sfruttando la possibilità di purificare la proteina tramite cromatografia di affinità; è stata usata la resina Chelating Sepharose Fast Flow, che contiene gruppi imminodiacetici legati al Sepharose 6 Fast Flow

tramite legami eterei stabili mediante uno spacer a 7 atomi. Utilizzando uno ione metallico adatto (Ni2+_{) è perciò possibile trattenere le proteine che abbiano}

dei residui di His esposti, in quanto questi formano dei complessi con i metalli di transizione (Fig. 18).

Ni O N N N O N Matrice O O HN N H N N O Polipeptide O HN NH O O H3N N NH

Figura 18. Interazione Ni-IDA-6xHis-tag.

Al fine di ottenere il corretto ripiegamento di rMOGED(His)6 è stato

necessario effettuare il passaggio da condizioni altamente denaturanti (guanidinio HCl 6 M) a condizioni non denaturanti ed eliminare gli agenti riducenti per permettere la formazione del ponte disolfuro. L’eluizione della proteina è stata effettuata utilizzando un tampone contenente imidazolo 0,5 M che, avendo un’affinità maggiore per il Ni rispetto alla coda di sei His della proteina ricombinante, ne ha permesso il distacco. Ogni passaggio è stato effettuato a temperatura ambiente, in quanto è stato osservato che la proteina precipita irreversibilmente se conservata a 4 °C.

Per ottenere rMOGED(His)6 pura in soluzione in un tampone a bassa

concentrazione salina, devono essere eliminati l’imidazolo e gli eventuali piccoli aggregati che possono essersi formati durante il processo cromatografico. E’ stato pertanto necessario un ulteriore passaggio di purificazione.

La gel filtration è una metodica cromatografica molto indicata per questo scopo poiché separa le molecole in base alla loro dimensione. Può essere utilizzata per purificare molecole sensibili ai cambiamenti di pH o alle concentrazioni saline molto alte, è compatibile con la presenza di ioni, co- fattori, guanidinio HCl, detergenti, urea ed inoltre le proteine possono essere eluite con qualsiasi tipo di tampone. La fase stazionaria di una colonna per gel

filtration è una matrice porosa costituita da particelle sferoidali inerti che non presentano proprietà di reattività o di adsorbimento. Il principio su cui si basa questa tecnica è, perciò, legato alla mobilità delle molecole attraverso la fase stazionaria: le molecole di grosse dimensioni che non riescono a fluire attraverso i pori della matrice vengono eluite più rapidamente, le molecole che invece hanno una dimensione tale da riuscire ad attraversare la matrice sono rallentate nel loro percorso e quindi sono eluite molto più lentamente. La velocità di eluizione è perciò proporzionale alle dimensioni della molecola.

La purificazione di rMOGED(His)6 tramite gel filtration è stata

effettuata su colonna Superdex75 utilizzando come tampone di eluizione 20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. La resa finale è stata molto bassa, con perdite in concentrazione prossime al 60% dovute, probabilmente, alla scarsa solubilità di rMOGED(His)6 in tamponi a pH vicini al suo punto isoelettrico (pI

7.14).

Dall’analisi elettroforetica (SDS-PAGE 12%) dei campioni di rMOGED(His)6, prelevati nei diversi stadi di purificazione, è risultato evidente

che gli aggregati proteici (dimeri, trimeri) non sono presenti anche dopo il passaggio della cromatografia di affinità (Fig. 19).

Figura 19. SDS PAGE 12%: campioni derivanti da lisati cellulari provenienti da LB non indotto (n.I.) e LB indotto (I.), da corpi inclusi (IB), da Ni-IDA, da gel filtrazione (GF).

Non essendo presenti aggregati proteici da eliminare dalla soluzione di rMOGED(His)6 ottenuta dopo eluizione per cromatografia di affinità, è stato

ritenuto quindi opportuno eliminare questo ulteriore passaggio cromatografico. Inoltre per cambiare il tampone in cui è dissolta la proteina, passaggio necessario per effettuare i successivi studi su rMOGED(His)6, è stato deciso di

utilizzare la dialisi, essendo questa una tecnica più semplice da eseguire rispetto alla gel filtration.

La proteina rMOGED(His)6 ha una forte tendenza a precipitare in seguito

a variazioni di concentrazione, di pH o temperatura.

Inizialmente è stato usato il tampone Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8.5 che però ha causato la precipitazione per aggregazione di una consistente frazione della proteina in soluzione.

Sono state effettuate altre prove di solubilità in tamponi diversi per ridurre il tasso di precipitazione della proteina ed è stato deciso di utilizzare come tampone di dialisi il PBS a pH 8 che è adatto anche per i test ELISA.

Sono stati registrati spettri di massa di rMOGED(His)6 purificata tramite

cromatografia di affinità. E’ stato utilizzato lo spettrometro ESI Q-TOF (Electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometer) Micromass (Waters), che permette di identificare le proteine analizzando il rapporto massa/carica.

Il peso molecolare trovato sperimentalmente con lo spettrometro (15899 Da) conferma il peso molecolare calcolato teoricamente, convalidando l’identità della proteina (Fig. 20).

mass 15000 16000 % 0 100 15899.0000 15871.0000 15916.0000 15943.0000 17000mass 15000 16000 % 0 100 15899.0000 15871.0000 15916.0000 15943.0000 17000

Figura 20. Spettro di massa di rMOGED(His)6 dopo analisi di deconvoluzione.