Ottenimento del plasmide pTXB1rMOG ED (1-97)

Al fine di ottenere il frammento ricombinante rMOGED(1-97) come

tioestere C-terminale è stato necessario inserire la sua sequenza nucleotidica all’interno di un particolare vettore, acquistato da NEB.

Il plasmide pTXB1 è costituito da 6,706 paia di basi ed è disegnato per permettere l’espressione, la purificazione e la ligazione di proteine ricombinanti utilizzando il sistema IMPACTTM _{(Fig. 54). Esso contiene:}

- un sito di clonaggio multiplo (multiple cloning site, MCS) posizionato in modo tale da permettere la fusione traduzionale dell’inteina Mxe GyrA

al C-terminale del proteina clonata; - il CBD, legato al C-terminale dell’inteina;

- le origini di replicazione pMB1, da pBR322, e M13 (ori); - il promotore T7, che controlla la trascrizione del gene legato;

- il gene lacI che codifica per la proteina repressore dell’operone lattosio; - il gene per la resistenza all’ampicillina (Ap);

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Figura 54. Plasmide pTXB1.

Desiderando ottenere una traduzione della proteina corrispondente alla porzione 1-97 di rMOGED, è stato necessario amplificare questo frammento

utilizzando la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR) e il plasmide pQE12rMOGED(His)6.

La Polymerase Chain Reaction è una tecnica che prevede l’amplificazione di una sequenza di DNA di cui si conoscono le sequenze agli estremi del frammento.102 _{Per realizzarla si ha bisogno di:}

- una sequenza da amplificare;

- i deossiribonucleoclotidi trifosfato (dNTP), come dATP, dCTP, dGTP, dTTP;

- due sequenze oligonucleotidiche complementari agli estremi del cDNA da amplificare;

- una DNA polimerasi estratta da un termofilo, in grado di non denaturarsi ad alte temperature;

102 _{K. B. Mullis, F. A. Faloona, S. J. Scharf, S. K. Saiki, G. T. Horn, H. A. Erlich, Specific}

enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1986, 51, 263-273.

124 - dei tamponi opportuni;

- la presenza dello ione Mg2+ per il corretto funzionamento dell’enzima. La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi (Fig. 55):

- una prima fase di denaturazione, che avviene ad alte temperature (denaturation), in cui si ha la separazione dei frammenti. Questa fase è regolata dalla temperatura di melting;

- una fase di annealing o appaiamento, in cui i primer si appaiono ai filamenti. Anche in questo caso la temperatura gioca un ruolo fondamentale, infatti le sequenze dei primer devono essere scelte in modo tale che l'annealing avvenga solo con le sequenze d'interesse del DNA stampo, evitando l'adesione a sequenze simili, con la conseguente perdita di specificità;

- una fase finale di estensione (extension), in cui la polimerasi, sfruttando l’-OH libero fornito dai primer, polimerizza in direzione 5’-3’ usando come stampo la sequenza specifica.

125 Nel primo ciclo si ha una duplicazione dal primer fino alla fine del frammento, nei cicli successivi si ha l’amplificazione della sola sequenza compresa tra i due primer. La PCR in realtà prevede numerose varianti, che ad esempio permettono, attraverso una progettazione adeguata dei primer, di aggiungere delle sequenze che prima non esistevano alle estremità del frammento da amplificare oppure di amplificare solo una parte della sequenza codificante la proteina.

Sono stati costruiti dei primer, in modo tale da amplificare solo la parte corrispondente al frammento desiderato ed inserire nella sequenza i siti di taglio per gli enzimi di restrizione, necessari per tagliare il plasmide pTXB1 ed il frammento amplificato tramite PCR.

Il primer forward è stato costruito in modo da avere le sequenze omologhe all’estremità 3’ del cDNA della proteina rMOGED ed inserire i siti di

taglio per l’enzima di restrizione NdeI, mentre il primer reverse è stato costruito in modo da avere le sequenze omologhe alla fine della sequenza del cDNA del frammento 1-97 della proteina ed inserire il sito di taglio per l’enzima di restrizione SapI.

Clonando tra i siti di restrizione NdeI e SapI è possibile ottenere la fusione dell’inteina al C-terminale di rMOGED(1-97) senza avere amminoacidi

aggiuntivi sulla proteina dopo il distacco dell’inteina. Il sito SapI deve essere usato per clonare l’estremità 3’ di un inserto.

Le sequenze nucleotidiche dei primer utilizzati sono le seguenti: - rMOGED(1-97) forward

5’-GCCGCCCATATGGGACAGTTCAGAGTGATAGG-3’

- rMOGED(1-97) reverse

5’-GCCGCCGCTCTTCCGCATGTGTAGCCTCCTTCATCC-3’

dove:

- in nero sono indicate le basi prima dei siti di taglio per gli enzimi di restrizione che permettono di ai primer di legarsi al DNA: è preferito usare C e G perché formano tre legami a idrogeno con la loro base complementare favorendo il legame con il DNA;

126 - in rosso sono indicati le basi nucleotidiche necessarie all’enzima di

restrizione di riconoscere il sito di taglio;

- in blu sono indicate le basi nucleotidiche del cDNA della proteina.

Una volta terminata la PCR, è stata purificata la soluzione di reazione utilizzando il kit Wizard® _{PCR Preps DNA Purification System (Promega) che}

ha permesso di ottenere il doppio filamento del frammento amplificato del cDNA di rMOGED(1-97) purificato da contaminanti.

Il frammento amplificato ed il plasmide pTXB1 sono stati tagliati con gli enzimi di restrizione LguI, l’isoschizomero di SapI, e Nde I generando da due a quattro nucleotidi non appaiati all’estremità di ciascuna catena. Queste sequenze non appaiate sono denominate estremità coesive o appiccicose, perché possono appaiarsi fra loro o con le estremità coesive complementari di altri frammenti di DNA.

Il frammento digerito del cDNA di rMOGED(1-97) è stato nuovamente

purificato con il kit Wizard® _{PCR Preps DNA Purification System (Promega),}

mentre il plasmide digerito è stato trattato con fosfatasi alcalina, in modo tale da defosforilare le estremità 3’ e non permettere l’attacco delle sue estremità portando alla formazione del plasmide circolare senza l’inserimento del frammento amplificato; successivamente è stato purificato usando il kit di Promega.

Infine il frammento amplificato e il plasmide digerito sono stati sottoposti a reazione di ligazione tramite l’utilizzo di T4 DNA ligasi, un enzima del fago Lamba che permette l’attacco delle estremità libere di DNA. Sono state effettuate delle prove di ligazione per determinare le migliori condizioni, utilizzando sia rapporti diversi tra il vettore e il cDNA (1:3, 1:5 e 1:10) sia temperature diverse (18 °C, 4 °C).

E’ stata trasformata una coltura di cellule DH5α con il prodotto della ligazione e sono state piastrate le cellule trasformate su terreno LB Agar contenente ampicillina. Su alcune colonie provenienti da ogni piastra è stata effettuata una colony PCR per verificare se le ligazioni erano avvenute e per

127 individuare le colonie contenenti il nuovo plasmide per poi utilizzarle per ricavare, tramite protocollo Miniprep, il vettore da sequenziare.

Dal gel d’agarosio all’1% è stato possibile verificare la presenza della sequenza nucleotidica di rMOGED(1-97) inserita in pTXB1 nelle colonie

provenienti dalle trasformazioni delle DH5α con i prodotti di ligazione ottenuti dalle reazioni condotte a 18 °C utilizzando i tre diversi rapporti di quantità (Fig. 56).

Figura 56. Gel d’agarosio all’1% della colony PCR. M: marker, 1-12: colonie.

E’ stato quindi effettuato il sequencing su vari campioni di pTXB1rMOGED(1-97) per individuare il migliore clone da utilizzare per

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Figura 57. Allineamento tra rMOGED(His)6 rMOGED(1-97).