2 SCOPO DELLA RICERCA
3.9 Espressione e purificazione di rMOG ED15 N(His) 6 in terren
minimi
Al fine di effettuare lo studio della conformazione della proteina in soluzione è stata ottimizzata l’espressione di rMOGED15N(His)6 utilizzando E. coli e specifici mezzi di coltura, M9 e NMM, entrambi arricchiti con 15NH4Cl
come unica fonte di N, che generalmente permettono di ottenere la proteina marcata con 15N.
E’ stato condotto un test di espressione di rMOGED15N(His)6 in entrambi
i terreni di coltura e ne è stata confrontata l’efficienza mediante gel di poliacrilammide, in modo tale da poter selezionare il migliore terreno da utilizzare per l’ottenimento della proteina marcata.
Cellule elettrocompetenti di E. coli appartenenti al ceppo BL21(DE3) sono state trasformate con i plasmidi pQE12rMOGED(His)6 e pREP4, entrambi
con concentrazione 0,120 µg/µl. La trasformazione è stata effettuata mediante elettroporazione. Successivamente le cellule sono state piastrare su terreno LB Agar contenente ampicillina e kanamicina e incubate a 37 °C per tutta la notte.
Singole colonie di E. coli BL21(DE3) sono state utilizzate per inoculare 10 ml dei terreni NMM e M9, in cui sono già presenti gli antibiotici necessari per la selezione; le colture sono state incubate a 37 °C sotto agitazione tutta la notte.
Aliquote di 100 µl delle precolture così ottenute sono state prelevate per inoculare 100 ml di NMM e M9. I batteri sono stati fatti crescere sotto agitazione a 37 °C fino a quando la densità ottica misurata a 600 nm non ha raggiunto un valore compreso tra 0,5 e 0,8. Successivamente è stata indotta l’espressione di rMOGED15N(His)6 tramite aggiunta di IPTG in concentrazione
finale 1 mM e incubando a 30 °C, sotto agitazione, per tutta la notte.
Da osservazione dei livelli di espressione mediante analisi elettroforetica (SDS-PAGE 12%) è stato evinto che il terreno M9 è risultato essere migliore rispetto a NMM, conducendo all’ottenimento di quantità
proteiche molto più elevate: per questo il mezzo M9 è stato scelto per effettuare l’espressione della proteina marcata con 15N (Fig. 24).
Figura 24. SDS-PAGE 12%: campioni derivanti da lisati cellulari provenienti da NMM non indotto (n.I.), NMM indotto (I.), M9 non indotto (n.I.), M9 indotto (I.).
Pertanto è stato deciso di ottenere rMOGED15N(His)6 utilizzando il
terreno di coltura M9.
Una singola colonia di E. coli BL21(DE3), derivante dalla trasformazione con pQE12rMOGED(His)6 e pREP4, è stata utilizzata per
inoculare 10 ml di terreno M9, contenente gli antibiotici necessari per la selezione; le colture sono state incubate a 37 °C sotto agitazione tutta la notte.
Un’aliquota di 1 ml della precoltura così ottenuta è stata prelevata per inoculare 1 litro di M9. I batteri sono stati fatti crescere sotto agitazione a 37 °C fino a quando la densità ottica misurata a 600 nm non ha raggiunto un valore compreso tra 0,5 e 0,8. Successivamente è stata indotta l’espressione di rMOGED15N(His)6 tramite aggiunta di IPTG (1 mM) e incubando a 30 °C, sotto
agitazione, per tutta la notte.
rMOGED15N(His)6 è stata espressa nei corpi inclusi e il suo refolding è
stato ottenuto sfruttando la possibilità di purificare la proteina tramite cromatografia di affinità; è stata usata la resina Chelating Sepharose Fast Flow con lo ione Ni2+ immobilizzato su di essa.
La purificazione è stata effettuata a temperatura ambiente e ha previsto il passaggio da condizioni altamente denaturanti (guanidinio HCl 6 M) a condizioni non denaturanti, per ottenere il corretto ripiegamento di rMOGED15N(His)6, e l’eliminazione degli agenti riducenti per permettere la
formazione del ponte disolfuro. L’eluizione della proteina è stata effettuata utilizzando un tampone con imidazolo 0,5 M che, avendo un’affinità maggiore per lo ione Ni2+ rispetto alla coda di sei His della proteina ricombinante, ne ha
permesso il distacco.
Al fine di determinare l’assenza di contaminazioni e la percentuale di isotopo 15N effettivamente incorporato, è stato registrato uno spettro di massa
di rMOGED15N(His)6, ottenuta dalla purificazione, utilizzando lo spettrometro
MALDI-TOF UltraFlexIII (Bruker) (Fig. 25).
16114.136 8058.247 5358.170 0 1000 2000 3000 4000 In te n s . [a .u .] 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 m/z
Figura 25. Spettro di massa di rMOGED15N(His)6.
Successivamente sono state condotte varie prove di dialisi con tamponi diversi per determinare quale fosse più adatto per gli studi successivi da effettuare su rMOGED15N(His)6 (Tabella 3).
Tamponi Tempo di dialisi Concentrazione iniziale Concentrazione finale Acido citrico 100 mM pH 3.2 2 ore 1,56 mg/ml 1,63 mg/ml CH3COONa 100 mM pH 4.5 2 ore 1,39 mg/ml 1,55 mg/ml Citrato di Sodio 100 mM pH 5.5 2 ore 1,39 mg/ml 1,37 mg/ml CHES 100 mM pH 9.5 3 ore 1,86 mg/ml 1,68 mg/ml CAPS 100 mM pH 10.5 3 ore 1,86 mg/ml 1,24 mg/ml
Tabella 3. Tamponi di dialisi utilizzati e risultati ottenuti.
La scelta del tampone di dialisi è caduta su CH3COONa 100 mM pH 4.5,
in quanto il valore di pH dello stesso, conferendo alla proteina una maggiore stabilità, permette di mantenerla in soluzione.
Tuttavia questo tampone, non essendo deuterato, non ha consentito di ottenere spettri NMR molto significativi, poiché la presenza del CH3
dell’acetato, in un tampone avente concentrazione superiore a quella della proteina in analisi, ha coperto tutta l’area in cui cadono i segnali degli amminoacidi alifatici. Inoltre la presenza di cloruri, utilizzati per aggiustare il pH del tampone, ha interferito nella lettura degli spettri di dicroismo circolare.
Quindi è stato ricercato un altro tampone che potesse mantenere la proteina in soluzione, risultare stabile a quel valore di pH e non interferire con le successive analisi: è stato scelto il tampone H3PO4/H2PO4-, che ha
dimostrato di possedere le caratteristiche richieste.
Dopo aver effettuato la dialisi di rMOGED15N(His)6 in tampone NaH2PO4
20 mM pH 4.6, sono state condotte analisi CD su un campione della proteina. Sono stati registrati spettri a varie temperature che hanno mostrato che la proteina rimane inalterata, mantenendo la giusta conformazione anche a pH acido (Fig. 26).
Figura 26. Spettri CD di rMOGED15N(His)6 in NaH2PO4 20 mM pH 4.6 registrati a varie temperature: blu, 4 °C; verde, 20 °C; rosso, 40 °C; celeste, 60 °C; giallo, 80 °C; viola: lo spettro è stato registrato nuovamente a 4 °C, ma dopo aver eseguito l’ultima misura a 80 °C.