ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE

4.2.1 CRESCITA BATTERICA

Per l’allestimento di crescite batteriche viene preparato un preinoculo con 10 mL di terreno LB, antibiotico 1000x e una punta di glicerolato del clone BL21 selezionato; questo viene lasciato in incubazione O.N a 37 °C, 230 rpm. La mattina seguente, 5 mL del preinoculo vengono utilizzati per inoculare 1L di terreno composto da:

1 L di LB

10 mL di glicerolo 50% v/v 10 mL di glucosio 20% v/v 500 µl antibiotico 1000x

Gli antibiotici utilizzati sono: Ampicillina 100 mg/mL per la resistenza portata dal vettore pMAL, Spectinomicina 50 mg/mL per la resistenza portata dal vettore trasformato per la co-espressione della γ-fosfatasi, Cloramfenicolo 34 mg/mL per la resistenza portata dal ceppo batterico BL21 RIPL.

Le crescite sono state lasciate per 4 ore a 37 °C, 230 rpm. Al raggiungimento di OD600 = 0,6 l’induzione dell’espressione batterica è stata avviata tramite l’aggiunta di IPTG (isopropyl thiogalactopiranoside) 0,5 M per 4 ore a 37 °C.

I batteri sono stati poi raccolti tramite centrifugazione a 4000 rpm, 4°C, per 20 minuti e il pellet risospeso e lavato con PBS (Phosphate-Buffered Saline: NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM, pH 7,4) per eliminare i residui di terreno.

Il pellet così trattato è stato conservato a -20 °C.

4.2.2 LISI ED ESTRAZIONE BATTERICA

Per estrarre la proteina di interesse, il pellet batterico viene scongelato e risospeso in buffer A addizionato di cocktail di inibitore delle proteasi EDTA-free (Roche) per rallentare eventuali processi di proteolisi.

• Buffer A: TrisHCl pH 7,5 50 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 5 mM, β-mercaptoeptanolo 10 mM, glicerolo 10%

La lisi batterica avviene in due steps: un primo passaggio di sonicazione con sonicatore ad immersione per 2,5 minuti all’80% della potenza, seguito da un’incubazione di 1 ora a 4°C in agitazione dopo aggiunta di detergente (Triton-X100 10 %), DNAsi 1:1000 (stock 5 mg/ml, Sigma) e ugual quantità di MgCl2 1 M (necessario per l’attivazione della DNAsi). Il

lisato è stato poi centrifugato per 1 ora a 4 °C, 11000 rpm. Si ottiene così la separazione tra la frazione solubile (contenente la proteina) e la frazione insolubile.

4.2.3 TIPOLOGIE DI PURIFICAZIONE

Cromatografia di affinità per gravità: vengono allestite delle colonne da 25 mL contenenti una resina la cui composizione determina il tipo di cromatografia.

• Resina Ni-NTA: sfrutta il legame di coordinazione tra il Nichel, con cui vengono caricate delle beads di agarosio derivatizzate con acido nitrilotriacetico (NTA), e l’anello imidazolico delle code di istidine presenti sulla proteina da purificare (figura 1). Il surnatante è stato incubato per 4 ore con la resina a 4°C in rotazione, lavato col buffer A ed eluito con lo stesso buffer aggiunto di imidazolo 500 mM che spiazza il legame per maggiore affinità nella coordinazione.

Figura 37. Interazione della coda di istidine con la resina Ni-NTA. Il Nichel forma un legame di coordinazione a sei termini con i tre gruppi acetici e il doppietto libero dell’azoto dell’acido nitrilotriacetico con cui è funzionalizzata la resina, e i due anelli imidazolici della coda di istidine della proteina. Immagine da Qiagen.

• Resina di amilosio: la cromatografia in resina di amilosio isola proteine fuse all’MBP (Maltose Binding Protein) sfruttando l’affinità di questa per l’amilosio. Il surnatante chiarificato è stato incubato per 4 ore e lavato con buffer A; l’eluizione è stata eseguita con buffer A aggiunto di maltosio 10 mM.

Nel campione espresso in pMAL, per eliminare il tag MBP, è stata utilizzata la proteasi TEV (estratta da Tobacco Etch Virus) con una reazione O.N. a temperatura ambiente con un rapporto proteina:TEV di 1:100 w/w.

Il campione dopo eluizione da resina Ni-NTA è stato poi dializzato contro il buffer di lisi per eliminare l’imidazolo in eccesso e concentrato con l’uso di cut off Amicon Ultra 10K MWCO (Millipore) fino ad un volume di 500 µl per il successivo caricamento in FPLC, mentre il campione eluito da resina di amilosio è stato direttamente concentrato fino a 500 µl per il successivo caricamento in FPLC.

Fast protein liquid chromatography (FPLC): questo strumento (ÄKTAFPLC - GE Healthcare Life Sciences) permette di separare e purificare miscele di proteine utilizzando differenti tipi di colonne cromatografiche (a scambio ionico, di affinità e per dimensione). Durante la fase di purificazione è possibile monitorare la concentrazione del sale (conduttività) e la concentrazione proteica grazie a lampada UV. Per mezzo del software UNICORN 6 è possibile monitorare lo strumento e seguire il profilo di purificazione/eluizione.

Sono state scelte le tre colonne cromatografiche descritte di seguito sulla base delle caratteristiche chimico fisiche del campione in analisi.

• Gel filtration size exclusion chromatography (GF-SEC): ovvero una cromatografia per esclusione molecolare dove una resina di agarosio e destrano trattiene solo molecole con dimensioni inferiori a quella dei suoi pori. Le molecole più grosse escono quindi col fronte del solvente, quelle più piccole escono più lentamente (figura 17). È stata utilizzata una colonna Superdex 200 Increase 10/300 GL. Per la fase mobile è stato utilizzato il seguente buffer: TrisHCl pH 7,5 50 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 5 mM, β-mercaptoeptanolo 10 mM.

• Colonna a scambio ionico cationica SP HP: è costituita da una resina di sefarosio caricata negativamente che quindi attrae cariche positive. È stata utilizzata per la separazione di MBP e AURKA che hanno una grande differenza di pI al pH di lavoro. Per l’eluizione viene utilizzata una soluzione con alta concentrazione di sodio che rappresenta lo ione in grado di competere con l’analita nello scambio con la resina.

Buffer di caricamento: Buffer di eluizione:

TrisHCl pH 7,5, 50 mM buffer di caricamento + MgCl2 5 mM NaOH 1 M

Glicerolo 50%

2-mercaptoeptanolo 10 mM

• MBP-trap HP: colonna con resina di sefarosio funzionalizzata con destrosio con un’alta affinità per il tag MBP.

Buffer di caricamento: Buffer di eluizione: TrisHCl 50 mM pH 7,5 buffer di caricamento + MgCl2 5 mM maltosio 10 mM

Glicerolo 50% NaCl 200 mM

2-mercaptoeptanolo 10 mM

4.2.4 ANALISI FRAZIONI ELUITE

Le frazioni raccolte da FPLC sono state quantificate con biofotometro (Eppendorf) e aliquote contenenti c.a. 10 µg di proteina sono state aggiunte di SDS loading buffer 5x (soluzione di Laemmli), denaturate a 95 °C per 10 minuti e caricate su gel 4-12% Criterion XT Bis-tris Precast (Biorad) corso in MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) a 80 Volt per c.a. 3 ore. Come marker è stato utilizzato il Prestained protein ladder (Sigma). Il gel è stato poi colorato con Blu Coomassie e decolorato con soluzione destaining (metanolo 40% v/v, acido acetico 10 % v/v, acqua a volume).

Una seconda SDS-PAGE con 100 ng di campione è stata allestita per un’analisi tramite Western Blot. Questa tecnica prevede il trasferimento delle proteine dal gel ad una

membrana di nitrocellulosa tramite assemblaggio di un blotting sandwich costituito da due supporti spugnosi che racchiudono il gel e la membrana; una volta assemblato, il sandwich viene inumidito con soluzione transfer (25 mM Tris, 190 mM glicina, 20% v/v metanolo) e posizionato all’interno dell’apposito cassetto nel Trans-Blot Turbo Transfer System (Biorad), uno strumento che sfrutta la corrente elettrica per il trasferimento delle proteine da gel a membrana (electroblotting). La membrana viene poi trattata con la soluzione di blotting-grade blocker costituita da polvere di latte 5% v/v in PBST (PBS buffer + Tween20) per ricoprire tutti i siti aspecifici, e incubata O.N. a 4 °C con l’anticorpo primario murino anti-Histag (Sigma) diluito 1:1000 in una soluzione contenente latte e BPST. Successivamente, sono stati fatti 4 lavaggi di 10 minuti in PBST e la membrana è stata incubata con l'anticorpo secondario anti-mouse diluito 1:2500 nella soluzione di latte e PBST per circa 1 ora in agitazione a temperatura ambiente. Dopo altri 4 lavaggi di 10 minuti in PBST, lo sviluppo è stato effettuato con i reagenti del kit Clarity ECL Western Blotting Substrate (Bio-Rad) con un’incubazione di c.a. 2 minuti, ed il segnale di chemioluminescenza è stato rivelato mediante il sistema di imaging digitale ImageQuantTM LAS2000.

I campioni scelti per le prove di cristallografia sono stati ulteriormente concentrati fino ad una concentrazione finale di ~10 mg/mL.