Estrazione dell'alfa-enolas

L'alfa-enolasi utilizzata in immunoblotting è una proteina ricombinante

prodotta da E. coli.

Il cDNA corrispondente al segmento 10-434 aa dell'alfa-enolasi umana è

clonato ed inserito nel vettore pGex.

Il DNA viene inserito a valle di una sequenza che codifica per la

Glutation-S-Trasferasi (GST), che viene indotta insieme all'alfa-enolasi

risultando in un unico prodotto di fusione di circa 75 kDa.

La presenza della GST permette la purificazione della proteina di fusione

mediante resina di Sepharoso-Glutatione ed eluizione con Glutatione.

L'espressione di alti livelli della proteina è resa possibile dalla presenza

nel plasmide del promotore T7.

Il vettore pRset. è transfettato in E. coli del ceppo BLRI(DE3)p LysS che

contiene un lisogeno esprimente la polimerasi T7 sotto il controllo del

promotore lacU5.

In presenza di iso-propil-tio-galactoside (IPTG) le cellule sono indotte

ad esprimere alti livelli di RNA polimerasi T7, che permette l'elevata

trascrizione della proteina ricombinante sotto la guida del promotore T7.

I batteri E. coli BLRI(DE3)p LysS transfettati sono prima piastrati su LB

Successivamente 3 ml di SOB (un terreno di coltura non selettivo)

contenente ampicillina 50 µg/ml e cloramfenicolo 35 µg/ml sono

inoculati con una singola colonia di batteri ricombinanti e fatti crescere

over night in agitazione.

Il giorno successivo i 3 ml sono diluiti con 250 ml di SOB contenente

ampicillina 50 µg/ml e fatti crescere a 30° C in agitazione fino ad una

OD600 =0,4 - 0,6.

A questo punto viene aggiunto IPTG che induce la produzione di alfa-

enolasi ricombinante e i batteri vengono lasciati a 30° C per 4 ore.

Trascorso il periodo di induzione il mezzo contenente i batteri indotti

viene centrifugato per 30 minuti a 2500 rpm a temperatura ambiente. Il

surnatante della centrifugazione viene eliminato e i pellet contenti i

batteri indotti vengono congelati a - 20 ° C.

Per la purificazione della proteina ricombinante, il pellet dei batteri

indotti è risospeso in NaH2PO4 50 mM, NaCl 500 mM, ß-

mercaptoetanolo 5mM + inibitori delle proteasi.

Vengono quindi effettuati 3 cicli di congelamento e scongelamento per

favorire la lisi dei batteri.

Al termine di tali cicli, i batteri vengono incubati 30' a + 4° C con

Tween-20 1%; il lisato batterico è, infine, centrifugato a 15000 rpm per

30' a + 4° C.

Poichè durante la lisi l'alfa-enolasi-GST precipita in strutture chiamate

"corpi di inclusione", che in queste condizioni di centrifugazione si

ritrovano nel pellet, e viene solubilizzata solo da forti condizioni

denaturanti, il surnatante viene eliminato ed il pellet è risospeso in

NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, Guanidina 3 M pH 8 e dializzato tutta

la notte contro PBS.

Il dializzato è, quindi, caricato su una resina di Sepharoso-Glutatione che

interagisce con la GST, trattenendo la proteina di fusione.

Dopo alcuni lavaggi con NaH2PO4 20 mM (fino a che OD280 = 0.01) e

con NaH2PO4 20 mM, GST 60mM, per eliminare ciò che si lega in

modo aspecifico, la proteina viene eluita con Tris 50 mM, GST 15mM.

2.3 Elettroforesi

I campioni di alfa-enolasi e di lisato totale di rene prima di venire

sottoposti ad elettroforesi sono stati trattati con sodio dodecilsolfato

(SDS) e 2-beta-mercaptoetanolo. Il SDS, detergente fortemente anionico,

proteina una carica netta negativa; il 2-beta-mercaptoetanolo riduce i

ponti disolfuro tagliandoli. In questo modo le proteine tendono ad avere

lo stesso rapporto carica-massa e la stessa forma: infatti, si dissociano in

subunità acquisendo una conformazione a bastoncino, in cui il diametro

è costante, mentre la lunghezza varia in rapporto al peso molecolare, per

cui la separazione elettroforetica avverrà sulla base della loro massa. Il

peso molecolare può essere determinato comparando la mobilità

elettroforetica di una data proteina con la mobilità di proteine note usate

come markers: il logaritmo del peso molecolare è linearmente correlato

con la mobilità relativa. La densità delle maglie del gel varia a seconda

delle concentrazioni di acrilamide e del rapporto tra il monomero ed il

suo dimero che al momento della polimerizzazione forma dei legami

trasversali. Per separare le nostre proteine abbiamo usato un gel di

poliacrilamide secondo la tecnica descritta da Laemmli. Il gel è costituito

in realtà da due tipi di gel: stacking gel e separating gel. Il primo serve a

far arrivare le proteine alla stessa altezza; il secondo, le cui maglie

variano a seconda del tipo di proteine da separare, è il vero gel di

separazione. Un volume di estratto proteico è stato mescolato a metà

volume di "Laemmli sample buffer" (Tris HCl 0,25 M pH 6,8, SDS

20%, glicerolo 10%, 2-beta-mercaptoetanolo 5%, blu di bromofenolo

per favorire l'azione dell'SDS e del 2b-mercaptoetanolo, sono stati fatti

raffreddare e caricati sul gel. Al termine della corsa, la massa delle

proteine è determinata per confronto con la relativa mobilità delle

proteine standard.

2.4 Immunoblotting

Le proteine sono state trasferite dal gel alla nitrocellulosa mediante

"Western blotting". Il foglio di nitrocellulosa è stato posto a contatto con

il gel in un tampone di trasferimento (blotting buffer: Tris 50 mM,

glicina 4 mM, metanolo 20%) ed è stata effettuata una seconda

elettroforesi perpendicolare al gel (50 mA costanti per 2 ore). Al termine

dell'elettroblotting, l'avvenuto trasferimento delle proteine su

nitrocellulosa è stato controllato mediante la colorazione a base di Rosso

Ponceau. Quindi la nitrocellulosa è stata tagliata a strisce di 5 mm di

spessore e la residua capacità di assorbimento del supporto è stata

saturata con 5% latte in polvere magro in TBS 1X (Tris 10 mM, NaCl

150 mM pH 7,4). Lo stesso tampone è stata usato per diluire i sieri o gli

anticorpi purificati ed il secondo anticorpo marcato. Le strisce di

CM e con sieri di soggetti di controllo diluiti 1/250 in TBS, 5% FCS,

0.05% Tween-20 per tutta la notte a + 4 °C, in agitazione.

Al termine del periodo di incubazione sono stati effettuati tre lavaggi con

TBS 0.1% Tween-20 (T-TBS) e le strisce sono state incubate con un

anticorpo anti-human IgG marcato con Perossidasi di Rafano e poste in

agitazione a RT per 3 ore.

2.5 Chemiluminescenza

L'avvenuta reazione è stata evidenziata mediante chemiluminescenza

incubando le strisce con un substrato a base di luminolo e acquisendo la

luminescenza emessa mediante una fotocamera digitale (sistema di

acquisizione dell'immagine Versadoc 1000 - Biorad)

In ogni esperimento, oltre ai controlli negativi è stato inserito anche un

controllo positivo costituito da un anticorpo monoclonale anti-alfa-

enolasi.

La positività dei sieri è stata ottenuta grazie al confronto con la reattività

Risultati