Sulla base dei risultati delle estrazioni in beuta gli studi sono proceduti eseguendo estrazioni in con colonna impaccata.
Si definisce bed volume (BV) il volume che la resina occupa all’interno della colonna. Viene preso come unità di volume di riferimento per dosare la velocità di eluizione del campione e della mezzo desorbente. I flussi di eluizione verranno indicati in BV/h.
Le prove sono state condotte in una colonna di plexiglass di 40 cm di altezza con un diametro interno di 2.8 cm caricata con 150 g di resina. Il BV risulta circa di 250 ml
Condizionamento, adsorbimento e desorbimento sono avvenuti a un flusso di 2 BV/h, ovvero 500 ml/h. L’altezza dell’impaccamento è di 40 cm, 2.7 cm di diametro interno della colonna.
0 1000 2000 3000 4000 5000 0 5 10 15 20 25 PF t o t. (mg /L) % resina
resine non ioniche adsorbimento quebracho
Per impaccare la colonna la resina è stata introdotta insieme ad una piccola quantità d’acqua in mondo da permetterne la corretta sedimentazione evitando la formazione di bolle d’aria. Una volta riempita la colonna, l’acqua è stata fatta defluire dalla valvola in modo tale da consentire alla resina di compattarsi.
L’acqua che riempie la Colonna impaccata corrisponde al “dead volume” del Sistema, 100 ml, il quale occupa gli interstizi della resina. Prima di avviare le prove di estrazione la colonna è stata riempita d’acqua fino al livello della resina.
Nel caso della resina 91, la colonna è stata impaccata con 150 gr di resina, il condizionamento è avvenuto con 330 ml di soluzione di NaOH al 3%. La resina condizionata è stata lavata con 1 L di acqua deionizzata. L’adsorbimento è avvenuto facendo fluire 1.5 L di AVO filtrati a 0.45 µm attraverso la colonna impaccata. L’AVO esausta è stata raccolta e su di essa sono state effettuate le misure di PF totali e di HTy utili per il calcolo della resa di adsorbimento e la selettività nei confronti dell’idrssitirosolo.
Il desorbimento dei composti fenolici è avvenuto con 1 L di soluzione H2O/EtOH 50 : 50 v/v a pH = 3. L’estratto
è stato raccolto in aliquote da 100 ml e su ciascuna di queste è stata effettuata l’analisi dei PF totali e dell’HTy. Nel caso della resina non ionica 202 la procedura seguita è la medesima con la differenza che il condizionamento e il desorbimento sono avvenuti con una soluzione di H2O/EtOH 50 : 50 v/v.
Si fa iniziare il desorbimento immediatamente dopo il desorbimento, utilizzando 1 L di fase estraente ad una portata di 500 ml/h, ossia 2 BV/h. L’estratto è stato raccolto in aliquote da 100 ml e su ciascuna viene effettuata la misura di PF totali e di HTy. Dopo il desorbimento la colonna viene lavata con 1 L di acqua a 2 BV/h.
Riportiamo in grafico l’andamento delle concentrazioni in funzione del volume di solvente utilizzato per il desorbimento. 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0 50 100 150 200 250 300 350 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH m g eq u iv a c. ga lli co
Desorbimento PF tot. resina anionica 91
con H
2O/EtOH
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 id ro ss itiro so lo (m g)
Desorbimento HTy resina anionica 91
4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 0 50 100 150 200 250 300 350 pH m g eq u iv a c. ga lli co
Desorbimento PF tot resina ionica 502
con H
2O/EtOH pH=3
resina % adsorb % desorb sull'adsorbito % desorb sul totale HTy/PF % esausto HTy/PF % desorbito HTy 91 97.12 77.44 75.21 8.16 54.26 202 97.66 78.43 76.6 7.15 32.44 PF 91 88.35 51.8 45.76 202 89.16 87.45 77.97
La resa di desorbimento è definita in relazione alla quantità di PF o di HTy adsorbiti dalla resina. La resa di estrazione è calcolata invece rispetto alla quantità iniziale di PF o HTy presente nel campione.
Per le 10 aliquote raccolte della resina 91 e della resina 202 i risultati di resa di adsorbimento, resa di desorbimento, resa di estrazione sono riportati in tabella x.
Dalla curva di desorbimento (fig x e x) è possibile ottimizzare il recupero dei fenoli desorbiti selezionando il numero appropriato di aliquote al fine di aumentare la concentrazione di fenoli evitando la diluizione degli estratti. Per la resina 91 sono state scelte le aliquote 1 – 6, mentre per la resina 202 si è deciso di recuperare le frazioni 2 – 5
La resa di estrazione è stata ridotta al x% ma la concentrazione dei PF è aumentata del x% a x mg/L (analogamente per l’idrossitirosolo)
In figura è riportata la foto delle aliquote campionate in contenitori di plastica da 100 ml. È possibile notare come la colorazione stessa delle frazioni di estratto diminuisca con il procedere dell’eluizione.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m g eq u iv a c. ga lli co Axis Title
desorbimento HTy resina NON ionica 202
con H
2O/EtOH
Riportiamo in oltre le misure di idrossitirosolo e confrontando il rapporto HTy/PF dell’AVO prima e dopo estrazione e degli estratti possiamo avere un’informazione sull’affinità della resina verso i PF a basso peso molecolare. Quindi completa commento su questo tema.
In sintesi queste prove hanno evidenziato la possibilità di utilizzare le colonne impaccate con resine a scambio ionico e resine non ioniche per estrarre i polifenoli da AVO microfiltrate. Aggiungi commenti tra differenze di condizioni operative delle due resine (es. ionica più fasi della non ionica?)
6 Conclusioni
Il lavoro di tirocinio su cui è basata la presente tesi magistrale, è stato svolto con l’obiettivo di caratterizzare dal punto di vita analitico la matrice AVO in modo dettagliato e studiare il contenuto di composti fenolici. A tale scopo sono stati studiati e ottimizzati metodi di analisi da poter essere applicati direttamente alle AVO, metodi che solitamente vengono applicati a matrici differenti, come ad esempio soluzioni di estratti fenolici. Poiché le AVO costituiscono un matrice altamente complessa, la prima sfida per un approccio analitico è stata proprio quella di capire quali tecniche usare e in che modo possano essere applicate correttamente evitando pretrattamenti incisivi.
In particolare il lavoro di tirocinio è stato suddiviso in due sezioni principali:
Caratterizzazione delle AVO e monitoraggio del contenuto di polifenoli totali e dell’attività antiossidante dei campioni. Questa fase ha avuto lo scopo di studiare le metodiche di analisi che in letteratura si applicano ad altri campioni e ottimizzarle per l’applicazione alla matrice AVO tal quale, nell’ottica di caratterizzare il refluo e valutarne i possibili utilizzi. Caratterizzazione dei polifenoli al livello molecolare mediante tecniche di cromatografia liquida ad alte prestazioni diverse per fase stazionaria e per rivelatore. In particolare per chiarire la struttura chimica di alcuni composti incogniti non riconosciuti tramite rivelatore a serie di diodi (DAD), ulteriori studi sono stati condotti utilizzando un sistema di rivelazione a spettrometria di massa. Tutte le tecniche utilizzate si sono rivelate utili ai fini preposti.
Sono stati realizzati diversi metodi di estrazione dei polifenoli a basso peso molecolare, mediante tecniche di estrazione in fase liquida e in fase solida. È stato messo a punto un metodo di estrazione con solvente utilizzando tre composti green. Metodo di estrazione in fase solida utilizzando diverse resine polimeriche a scambio ionico e resine sintetiche non ioniche.
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