Interferenza ottica e ottimizzazione metodi ottici

Per riuscire a discriminare se la presenza dei solidi in sospensione influenzi le misure spettroscopiche causando interferenza dovuta a scattering oppure contribuisca alla concentrazione dei PF in soluzione è stata messa su una prova sperimentale. Il fine è anche quello di trovare le condizioni ottimali per effettuare misure ottiche sulle matrici costituite dai campioni di AVO. Il metodo scelto è quello della misura dell’attività antiossidante mediante il test del DPPH. Dalla stesso campione di AVO sono state prese due aliquote. La prima aliquota, indicata con A1, è stata filtrata a 0.45 µm e sul campione chiarificato è stato eseguito il saggio. Mentre sulla seconda aliquota, indicata con A2, è stato messo su il saggio del DPPH, ma prima della lettura dell’assorbanza allo spettro fotometro il campione è stato diviso in due aliquote e una di queste è stata centrifugata per 5 minuti a 4000 rpm (A2C), mentre la seconda è stata lasciata tal quale (A2tq). Ciascuna misura

di attività antiossidante è stata eseguita in triplicato.

Il fenomeno dello scattering dovuto alla torbidità della soluzione darebbe luogo a un valore di assorbanza più elevato rispetto a una soluzione trasparente, e ciò comporterebbe un falso negativo nella misura dell’attività antiossidante, poiché essa decresce all’aumentare della concentrazione di antiossidante in soluzione (DPPH che viene sottratto dalla reazione).

Abs % att antiox mg/L ac gall tq 0.399 ± 0.006 45.7 ± 0.8 218 ± 4 tq centrif 0.068 ± 0.001 90.7 ± 0.2 441 ± 1 filtr 0.45 0.062 ± 0.002 91.6 ± 0.2 445 ± 1 Didascalia tabella con legenda campioni

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

vinci tq vinci tq centrif vinci filtr 0.45

m g/l acid o ga lli co

Attività antiossidante

vinci tq vinci tq centrif vinci filtr 0.45

Ab

s

Come possiamo vedere dalla tabella le misure di attività antiossidante di A2c e di A1 coincidono, mentre le

misure su Atq scartano di un fattore 2 sull’attività antiossidante e di un ordine di grandezza sul valore di

assorbanza. Questi risultati testimoniano che il contributo principale del particolato in sospensione è quello di costituire fonte di interferenza ottica. La quantità di polifenoli trattenuti dai solidi sospesi, eventualmente allontanati dalla soluzione per filtrazione, non incide sulla misura di attività antiossidante.

Dai risultati di questa prova si è deciso che per applicare il test del DPPH ai campioni di AVO è necessaria la filtrazione a 0.45 μm. Condizione che verrà applicata anche per le misure di PF totali mediante metodo di Folin-Ciocalteau.

Concentrazione ottimale dei campioni per il test del DPPH

Nota la concentrazione di PF totali del campione espressa in mg/L equivalenti di acido gallico e noto il range di concentrazioni entro cui viene costruita la retta di taratura del saggio del DPPH, è possibile stimare a priori l’entità della diluizione a cui sottoporre il campione. Esempio: essendo il range di linearità del nostro metodo compreso fra 0.1 e 4.0 mg/L equivalenti di acido gallico, per effettuare la misura dell’attività antiossidante di un campione di AVO con una concentrazione di polifenoli totali compresa fra 2500-3000 mg/L di acido gallico, sarà necessaria una diluizione almeno 1:500 v/v per rientrare nel range della retta di calibrazione. (2500/500=5 mg/l). Nel nostro caso sono state effettuate comunque delle prove su campioni di AVO a concentrazione crescente, non solo per individuare la diluizione ottimale per il saggio, ma anche per studiare l’intervallo di linearità del metodo.

È stato effettuato il saggio su un campione di AVO filtrato a 0.45 μm portato a diversi livelli di diluizione. 1:1, 1:10, 1:20, 1:50, 1:75, 1:100, 1:200, 1:500, 1:600, 1:1000. Si è potuto avere prova di quanto esposto in letteratura, aumentando la concentrazione del campione (e quindi di composti antiossidanti) l’assorbanza scende e si abbassa parallelamente all’intensità della colorazione viola del campione (diluizioni da 1:1000 a 1:500). Poi si raggiunge un plateau in cui la soluzione si presenta giallo chiaro e l’assorbanza è al suo valore minimo (diluizioni fra 1:200 e 1:75). A concentrazioni più alte l’assorbanza torna ad aumentare e la soluzione si presenta di colore giallo-arancio o marrone (diluizioni da 1:50 a 1:1). Segno evidente tutti il DPPH presente ha reagito e che la soluzione inizia ad assumere il colore naturale delle AVO azzerando l’informazione sull’attività antiossidante.

In conclusione, per un campione di AVO con un valore di PF totali compreso fra 2000 e 3000 mg/L è necessaria una diluizione 1 : 500 perché la misura dell’attività antiossidante possa essere significativa.

Confronto HTy, PF e DPPH

Per verificare la correlazione tra le misure di attività antiossidante ottenute mediate test del DPPH, di concentrazione di polifenoli totali ottenute tramite metodi di Folin-Ciocalteau e di concentrazione di idrossitirosolo tramite metodo HPLC-DAD-RP-C18 è stata messa su la seguente prova sperimentale. Da un

campione di AVO sono state prelevate 4 aliquote, che indichiamo con lettere da A a D. Ciascuna delle quali è stata diluita secondo i seguenti rapporti di concentrazione:

A/B = 2 ; A/C = 1.5 ; A/D = 3

Su ciascun campione sono stati applicati i metodi sopra menzionati. Ciascuna misura è stata effettuata in triplicato. In tabella sono riportati i rapporti valori di concentrazione di polifenoli totali (PF), di attività antiossidante e di idrossitirosolo ottenuti sperimentalmente.

HTy/PF HTy/Att. antiox

A 0.29 0.61

B 0.31 0.59

C 0.31 0.57

D 0.28 0.52

Il rapporto fra le misure di HTy, di polifenoli totali e di attività antiossidante si mantiene pressoché costante all’aumentare della grado di diluizione.

A/B A/C A/D

PF 2.09 1.61 3.27

Att antiox 1.89 1.42 2.85 HTy 1.95 1.50 3.35

Teorico 2 1.5 3

Possiamo notare che i risultati dei rapporti di concentrazione sperimentali in tabella x hanno uno scarto dai valori attesi compreso fra lo 0.1 e l’11%. Questi i risultati confermano la correlazione tra i metodi impiegati in funzione della concentrazione. Una prova intra campione che testimonia come HTy, PF e attività antiossidante si muovano di pari passo con la concentrazione del campione. Come vedremo in seguito la correlazione inter-campione non è rispettata. Ovvero, non è possibile eseguire paragoni inter-campione rispetto alle grandezze indagate. L’attività antiossidante non è correlata direttamente alla concentrazione di idrossitirosolo ma alla composizione della miscela di polifenoli contenuta nei campioni. Composizioni di PF differenti determinano valori di attività antiossidante differenti a prescindere dalla concentrazione di PF totali e di HTy.