La tecnica FIA-ESI-MS ha permesso di estendere lo studio della composizione molecolare della resina dammar a valori di massa maggiori rispetto alle tecniche di spettrometria di massa descritte nei paragrafi precedenti.
Lo spettro di massa, relativo alla resina dammar grezza, è riportato nella seguente Figura 15:
Figura 15. Spettro di massa FIA-ESI-MS della resina dammar grezza. Range di m/z: 100 – 1200.
Si possono individuare vari cluster di m/z, a loro volta suddivisi in sotto-cluster. Lo spettro di massa può essere quindi suddiviso in quattro zone principali:
• 1°: m/z 100 - 400 • 2°: m/z 400 – 600 • 3°: m/z 600 – 800 • 4°: m/z 800 – 1200
Differenze di m/z di 14 e 16 unità, sono indice di una differenza di un atomo di ossigeno, nella forma di una funzionalità carbonilica e nella forma ossidrilica
73 rispettivamente. Infine differenze di 18 unità sono indice della differenza di una molecola d’acqua.
In Figura 16 è riportata la porzione dello spettro di massa relativa alla zona compresa tra m/z 400 - 600.
Figura 16. Spettro di massa FIA-ESI-MS della resina dammar grezza. Range di m/z: 400 – 600.
La frazione a basso peso molecolare (m/z 100 - 400) è caratterizzata dalla presenza di frammenti ionici tipici di molecole triterpenoidi a struttura dammaranica, oleanonica e ursanica. I segnali nel range di m/z 409,370 - 471,343 sono attribuibili a molecole triterpenoidi nella forma protonata [M+H]+ contenenti da 1 fino a 4 atomi di ossigeno. I segnali nel range di m/z 481,356 - 525,228 sono invece compatibili con molecole triterpenoidi nella forma di addotto con il sodio [M+Na]+ contenenti da 3 fino a 6 atomi di ossigeno. Questo può essere spiegato considerando che l’aumento del numero di atomi di ossigeno, produce una crescita della polarità della molecola e, di conseguenza, una maggiore affinità con gli atomi di sodio presenti negli eluenti.
74 Tabella 4. Elenco dei triterpenoidi individuati nello spettro FIA-ESI-MS della resina dammar grezza. Sono riportati i valori di m/z misurati ed esatti, la formula minima ed il catione corrispondente, oltre al composto di origine compatibile.
m/z misurato m/z esatto Formula Composto di origine Ipotizzato (M.M) Catione 409,374 409,3822 C30H49 dammaradienolo (426) [C30H50O -H2O+H]+
423,351 423,361 C30H47O aldeide ursolica/oleanolica (440) [C30H48O2 -H2O+H]+
425,368 425,377 C30H49O idrossidammarenone (442) dammaradienone (424) [C30H50O2 -H2O+H]+ [C30H48O +H]+ 439,353 439,356 C30H47O2 aldeide ursonica/oleanonica (438) [C30H46O2 +H]+ 441,370 441,372 C30H49O2 acido dammarenolico (458) aldeide ursolica/oleanolica (440) [C30H50O3 -H2O+H]+ [C30H48O2 +H]+ 443,377 443,387 C30H51O2 idrossidammarenone (442) [C30H50O2 +H]+ 455,347 455,351 C30H47O3 acido ursonico/oleanonico (454) [C30H46O3 +H]+ 457,364 457,367 C30H49O3 acido ursolico/oleanolico (456) ac. shoreico (474) [C30H48O3 +H]+ [C30H50O4 -H2O+H]+ 459,371 459,382 C30H51O3 acido dammarenolico (458) [C30H50O3 +H]+ 471,346 471,346 C30H47O4 lattone idrossioleanonico (470) acido asiatico (488) [C30H46O4 +H]+ [C30H48O5 - H2O +H]+
481,356 481,355 C30H50O3Na acido dammarenolico (458) [C30H50O3 +Na]+
493,338 493,324 C30H46O4Na lattone idrossioleanonico (470) [C30H46O4 +Na]+
497,355 497,355 C30H50O4Na - [C30H50O4 +Na]+
511,337 511,336 C30H48O5Na acido asiatico (488) [C30H48O5 +Na]+
513,365 513,364 C30H50O5Na - [C30H50O5 +Na]+
75 La tabella mostra come le masse di alcuni triterpenoidi sono compatibili con più di un segnale, considerandoli sia nella forma molecolare protonata [M+ H]+, sia nella forma disidratata protonata [M-H2O+ H]+, se presente all’interno della struttura una
funzionalità. Confrontando le abbondanze relative dello spettro FIA-ESI-MS con il profilo cromatografico GC-MS, si può ipotizzare che alcuni composti sono più stabili nella forma protonata ed altri nella forma disidratata. Ad esempio lo ione 441,370 m/z risulta compatibile sia con l’acido dammarenolico nella forma disidratata, che con l’aldeide ursolica e oleanolica. Le analisi GC-MS dimostrano però che le aldeidi ursolica e oleanolica sono molto meno abbondanti dell’acido dammarenolico. Pertanto il segnale a m/z 441,370 va attribuito non solo alle aldeidi ursolica e oleanolica nella forma [M+ H]+, ma anche all’acido dammarenolico nella forma [M-H2O+ H]+.
In Figura 17, sono riportate le porzioni dello spettro di massa relative alla zona compresa tra valori di m/z 600-800 e di m/z 800-1200.
76 Figura 17. Spettro di massa FIA-ESI-MS della resina dammar grezza. a) Range di m/z: 600 – 800; b) range di m/z: 800-1200.
77 Questa zona dello spettro presenta segnali di difficile interpretazione. Si può escludere la loro attribuzione ad ulteriori ossidazioni di molecole triterpenoidi, in quanto l’elevato numero di atomi di ossigeno renderebbero la molecola risultante altamente instabile. Inoltre, considerando che le tecniche precedenti escludono la presenza nella resina dammar analizzata in questa tesi, di una percentuale significativa di policadinene, è stata esclusa pure la possibilità che questi valori di m/z, possano essere assegnati, contrariamente a quanto riportato in letteratura, a trimeri o tetrameri di cadinene2 o a oligomeri misti di triterpenoidi e cadinene8.
L’acquisizione di spettri MS-MS ha permesso di chiarire la loro natura.
Segnali corrispondenti a valori nel range di m/z 923,700 - 999,673 possono essere attribuiti ad addotti formati nella fase di ionizzazione tra due molecole triterpenoidi. A titolo di esempio in Figura 18 è riportato lo spettro MS-MS dello ione di m/z 969,678.
Figura 18. Spettro MS-MS dello ione di m/z 969,678 addotto di due molecole triterpenoidi.
Lo spettro è caratterizzato dalla presenza di due segnali principali: m/z 481,211 e 511,332. Questi segnali sono dovuti alla possibilità che l’addotto nella forma sodiata di m/z 969,678 possa essere formato da una molecola di acido dammarenolico [MM: 458,375 Da] e da una molecola di acido asiatico [MM: 488,349 Da] (488,349 + 458,375 + 22,989 = 969,713). L’addotto corrispondente
78 nella cella di collisione CID si frammenta nelle due molecole triterpenoidi costituenti, e il sodio può essere ritenuto sia sull’acido dammarenolico (m/z 481,211) e sull’acido asiatico (m/z 511,332). Si osservano segnali di abbondanza relativa più bassa dovuti a combinazioni con minore probabilità, mediante le quali si può formare l’addotto.
Per quello che riguarda l’interpretazione dei segnali relativi ai cluster nel range di m/z 600-700 e di m/z 800-900 si mostrano a titolo esemplificativo gli spettri MS- MS degli ioni con m/z 865,718 e m/z 645,540 (Figura 19 e Figura 20).
79 Figura 20. Spettro MS-MS dello ione di m/z 645,540.
Lo spettro di MS-MS dello ione di m/z 865,718 contiene: frammenti ionici tipici di molecole triterpenoidi nel range di m/z 100-500, tra i quali i più abbondanti risultano m/z 109,100; 191,173; 203,177 e 423,351; frammenti ionici nel range di m/z 600-700, tra cui gli ioni più abbondanti risultano m/z 645,549 e m/z 659,525. A sua volta lo spettro MS-MS dello ione di m/z 645,549 contiene frammenti ionici tipici di molecole triterpenoidi nel range di 100-500, tra i quali i più abbondanti risultano m/z 109,100; 189,162 e 203,177.
Le acquisizioni degli spettri di MS-MS mostrano, quindi, che i segnali corrispondenti ai valori appartenenti ai cluster di m/z 600-700 e di m/z 800-900 sono tutti riconducibili a frammenti ionici derivanti da oligomeri contenenti molecole triterpenoidi.
A conferma di questa assegnazione, è stata ipotizzata la struttura del frammento ionico di m/z 865,718 (Figura 21), compatibile con un frammento appartenente ad una struttura oligomerica formata da molecole triterpenoidi legate mediante legami esterei. In particolare il frammento di m/z 865,718 potrebbe essere ottenuto da un oligomero contenente l’idrossidammarenone (M.M.=442,380 Da) e l’acido dammarenolico (M.M=458,375 Da). Viene riportato, inoltre, il possibile punto di
80 rottura all’interno dello ione di m/z 865,718 al momento della frammentazione che porta alla formazione del frammento ionici di m/z 645,549 (Figura 21).
Figura 21. Struttura ipotizzata relativa al frammento ionico di m/z 865,718 e dei frammenti ionici più abbondanti presenti nel suo spettro di MS-MS.
81 Si possono osservare segnali non compatibili con la struttura riportata in Figura 21, come ad esempio quello a m/z 849,720 risultate dalla perdita di una molecola d’acqua dallo ione genitore (m/z 865,718), non essendo presente una funzionalità ossidrilica all’interno della struttura oligomerica risultante proposta in (Figura 21). D’altro canto tale frammentazione si potrebbe ottenere se, invece l’oligomero di partenza contenesse un idrossidammarenolo (M.M.=444,3954 Da) e una molecola di acido oleanolico/ursolico (M.M.=456,3591 Da) o una molecola di acido shoreico (M.M.=474,7696 Da) il quale ha disidratato in sorgente, legate fra di loro (compatibile con i frammenti nello spettro FIA-ESI-MS distanziati da m/z 18: 407,3572; 423,3506; 439,3399). Quindi è possibile concludere che ciascun segnale corrispondente a valori nel range di m/z 800-900 sia il risultato della somma di vari frammenti ionici diversi formati a partire da strutture oligomeriche diverse.
Questo risultato, permette comunque di confermare i risultati ottenuti mediante le altre tecniche descritti precentemente e quindi di poter affermare che gli oligomeri nella resina dammar sono costituiti da molecole triterpenoidi legate tra di loro mediante legami esterei, e che i triterpenoidi della frazione oligomerica sono gli stessi della frazione libera.
Una volta data questa attribuzione, si osserva che le abbondanze relative dei segnali corrispondenti agli oligomeri, non rispecchiano ciò che ci si aspetta sulla base dei profili delle curve termogravimetriche. Le minori abbondanze relative dei segnali corrispondenti agli oligomeri possono essere spiegate in due modi:
1. gli oligomeri sono altamente instabili e nella fase di ionizzazione si osservano soltanto i relativi frammenti ionici;
2. la resa di ionizzazione nel processo di ionizzazione elettrospray degli oligomeri è molto più bassa rispetto a quella dei monomeri.
Il confronto degli spettri di massa FIA-ESI-MS della resina dammar fresca e della frazione II insolubile in metanolo (Figura 22), permette di avallare la prima ipotesi. Infatti, nonostante la frazione II insolubile in metanolo contiene una maggiore quantità di frazione oligomerica i due spettri di massa mostrano lo stesso profilo, con un minimo aumento dei segnali corrispondenti a valori nel range di m/z 600- 1000 per la frazione II insolubile in metanolo.
82 Figura 22. Spettro di massa FIA-ESI-MS della resina dammar grezza (a) e della frazione II insolubile in metanolo (b). Range di m/z: 100 - 1200.
Infine sono state eseguite misure variando alcuni parametri strumentali (le temperature del drying gas e del sheath gas, la percentuale degli eluenti e l’energia di frammentazione), rispetto alle condizioni strumentali utilizzate nelle analisi precedenti. Le singole prove sono riportate nella seguente Tabella 5.
83 Tabella 5. Valori dei parametri strumentali modificati nelle singole prove di FIA-ESI-MS.
T drying gas (°C) T sheath gas (°C) E frammentazione (V) Eluenti 1 350 375 170 80% H2O, 20 % ACN 2 250 275 170 30% H2O, 70 % ACN 3 250 275 400 30% H2O, 70 % ACN
I cambiamenti più significativi, si osservano tra le condizioni strumentali 1 e 3, come si può vedere dai relativi spettri di massa (Figura 23).
84 Figura 23. Spettri di massa FIA-ESI-MS relativi alle condizioni strumentali 1(a) e 3 (b). Range di m/z: 100 - 1200.
85 Lo spettro acquisito nella modalità 3, mostra che nonostante la maggiore energia di frammentazione produca un aumento delle abbondanze relative dei segnali corrispondenti a valori nel range di m/z 600-1000, comporta anche una maggiore frammentazione della frazione di triterpenoidi liberi nella forma protonata. Infatti si osserva un aumento dell’abbondanza relativa dei segnali compresi tra valori di m/z 100-400. Poiché quei triterpenoidi che di massa compresa tra 410 Da e 458 Da sono quelli che, come mostrano le analisi in GC, risultano tra i più abbondanti nella resina dammar fresca, possiamo anche concludere che le condizione operative 3 non rispecchiano in maniera ottimale la composizione di triterpenoidi liberi della resina dammar, a differenza delle condizioni operative 1.
Queste misure permettono di concludere che gli oligomeri sono altamente instabili e che in FIA-ESI-MS si osservano soltanto i relativi frammenti ionici.
86
BIBLIOGRAFIA CAP. 3
(1) D.Scalarone. Caratterizzazione e studi di invecchiamento di materiali pittorici organici naturali e sintetici. Università di Torino, 200-2001.
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87
CAPITOLO
4
VALUTAZIONE DELL’EFFETTO DELL’ACIDO ACETICO
SULLA DEGRADAZIONE DELLA RESINA DAMMAR
4.1 Analisi delle stesure di riferimento di resina dammar
sottoposte a invecchiamento mediante esposizione a acido
acetico (NILU)
Eseguita la caratterizzazione dei materiali puri, e scelte le più opportune condizioni di analisi, è stato possibile interpretare i risultati ottenuti dalle analisi delle stesure di riferimento invecchiate presso il NILU, naturalmente al buio e artificialmente mediante esposizione a vapori di acido acetico per 3 giorni, 1, 2, 3 e 4 settimane, come descritto in dettaglio nel Capitolo 3. L’invecchiamento artificiale a opera dell’acido acetico è stato confrontato quindi con l’invecchiamento naturale ed è stato valutato in funzione delle diverse dosi di inquinante.
GC-MS
La tecnica GC-MS ha permesso di valutare la composizione molecolare dei triterpenoidi liberi della resina, osservando l’effetto di dosi crescenti di vapori di acido acetico sulle diverse classi di molecole triterpenoidi: dammarani, ursani e oleani. In particolare è possibile stimare una misura dello stato di ossidazione della resina dammar, relativamente a ciascuna classe di triterpenoide.
A ciascun triterpenoide è stato assegnato un numero di ossidazione, che è un valore indicativo del grado di ossidazione, calcolato in base al numero di insaturazioni e di ossigeni presenti nella propria struttura (Tabella 1). In particolare, per ciascuna classe di terpenoidi, è stato assegnato il valore 1 al
88 numero di ossidazione relativo al composto meno ossidato e il numero di ossidazione degli altri composti è stato calcolato aggiungendo 1 per ogni insaturazione aggiuntiva e 2 per ogni ulteriore ossigeno presente nella struttura della molecola.
Tabella 1. Suddivisione dei triterpenoidi identificati nella resina dammar sulla base della loro struttura (dammarani, oleani e ursani). Sono riportati inoltre per ciascun triterpenoide il relativo numero di ossidazione assegnato.
CLASSE DI APPARTENENZA TERITERPENOIDE numero di OSSIDAZIONE ASSEGNATO (no) DAMMARANI dammaradienolo 1 dammaradienone 2 idrossi-dammarenone 3 20-24-epossi-25-idrossi-dammaren-3-olo 4 20-24-epossi-25-idrossi-dammaren-3-one 5 acido dammarenolico 5 acido shoreico 7 OLEANI nor-b-amirone 2 aldeide oleanolica 3 aldeide oleanonica 4 acido oleanolico 5 acido oleanonico 6 acido tipo-asiatico 10 URSANI nor-a-amirone 2 aldeide ursolica 3 aldeide ursonica 4 acido ursolico 5 acido ursonico 6 acido asiatico 10
I triterpenoidi presenti all’interno della resina dammar non sono tutti commercialmente disponibili. Come già spiegato nel capitolo 3, non è stato quindi
89 possibile riferirsi a una retta di calibrazione costruita attraverso soluzioni standard, per eseguire un’analisi quantitativa di ogni componente presente nella resina. In questo studio è stato così necessario supporre che la curva di taratura di tutti i composti avesse la stessa pendenza e la stessa intercetta, al fine di poter per stimare la quantità relativa di ogni triterpenoide estratti dai campioni di resina. Anche se questo può essere relativamente vero per i composti simili, questo non è rigorosamente corretto per tutti i triterpenoidi. Tuttavia, lavorando sempre con concentrazioni simili, le aree cromatografiche sono state utilizzate per dare una stima, in unità arbitrarie, del relativo contenuto percentuale di ogni triterpenoide (Tr%) nei campioni di dammar .
In tutte le resine analizzate, la risoluzione cromatografica per i triterpenoidi non è stata sufficiente, infatti diversi composti co-eluiscono. Per determinare correttamente l’area cromatografica (A) di ogni componente, è stata misurata l’area di specifici rapporti m/z per ciascuna molecola (EIA) e corretta per l’abbondanza relativa di tali rapporti nello spettro di massa del componente puro (%). L’area cromatografica di ciascun composto identificato nel cromatogramma, è stata quindi ottenuta mediante la seguente formula:
A = (EIA) * (100) / (%).
Il contenuto relativo percentuale di ogni triterpenoide (Tr%) in tutti i campioni di resina è stato calcolato dividendo l’area cromatografica corretta (A) di ogni componente per la somma delle aree dei picchi determinati nel cromatogramma (ΣA) e moltiplicando per cento:
∑
⋅
=
i i iA
A
100
%
Tr
i ()Come già spiegto nel capitolo 4, non è stato quindi possibile riferirsi a una retta di calibrazione costruita attraverso soluzioni standard, e si è quidni supporre che la curve di taratura di tutti i composti avessero la stessa pendenza e la stessa intercetta, al fine di poter per stimare la quantità relativa di ogni triterpenoide estratti dai campioni di resina. Avevamo definito il contenuto relativo percentuale di ogni triterpenoide (Tr%) in tutti i campioni di resina dividendo l’area
90 cromatografica corretta (A) di ogni componente per la somma delle aree dei picchi determinati nel cromatogramma (ΣA) e moltiplicando per cento:
∑
⋅
=
i i iA
A
100
%
Tr
i ()Le Tri% di ciascun terpenoide sono state quindi normalizzate per la somma delle
quantità relative percentuali di ciascun composto appartenente alla stessa classe di molecole (dammarani, ursani, oleani): Tri D %, Tri O %, Tri U %.
Tr
iD%
norm=
Tr
iD%
∑Tr
iD%
Tr
iO%
Tr
iO%
norm=
∑Tr
iO%
Tr
iU%
norm=
Tr
iU%
∑Tr
iU%
Il valore ottenuto per ciascun tritepenoide è stato quindi moltiplicato per il corrispondente numero di ossidazione
Tr
iDox %
= Tr
iD%
norm* No
iDTr
iOox %
= Tr
iO%
norm* No
iOTr
iUox %
= Tr
iU%
norm* No
iUI valori ottenuti di TriD ox %, TriO ox %, TriU ox % sono sommati tra di loro per
ciascuna classe di triterpenoidi, ottenendo quello che definiamo il livello di ossidazione dei dammarani (liv. OxD), degli oleani (liv. OxO) e degli ursani (liv. oxU) (Tabella 2).
91
liv. ox
D= ∑Tr
iDox %
liv. ox
O= ∑Tr
iOox %
liv. ox
U= ∑Tr
iUox %
Tabella 3. Livello di ossidazione relativo a ciascuna classe di composti (dammarani, ursani, oleani) in funzione dei giorni di esposizione a vapori di acido acetico ottenuti dall’analisi GC-MS delle stesure di riferimento invecchiate artificialmente presso il NILU.
Giorni di esposizione a vapori di acido acetico
Livelli di ossidazione dammarani Livelli di ossidazione oleani Livelli di ossidazione ursani 0 3,0 4,4 4,6 3 3,2 4,6 4,7 7 3,0 4,7 4,7 14 3,1 4,9 4,7 21 3,4 5,0 5,0 28 3,9 5,0 5,0
I numeri di ossidazione di dammarani, ursani e oleani, sono stati riportati in grafico rispetto al numero di giorni di esposizione a vapori di acido acetico e sono mostrati in Figura 1.
92 y = 0,0256x + 2,9622 R² = 0,7853 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 0 5 10 15 20 25 30
giorni di esposizione a vapori di acido acetico
livelli di ossidazione dammarani
y = 0,0224x + 4,494 R² = 0,9093 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0 5 10 15 20 25 30
giorni di esposizione a vapori di acido acetico
93 y = 0,0137x + 4,6261 R² = 0,8639 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0 5 10 15 20 25 30
giorni di esposizione a vapori di acido acetico
livelli di ossidazione ursani
Fgura 1. Ossidazione delle stesure di riferimento di resina dammar esposte a dosi crescenti di vapori di acido acetico. I livelli di ossidazione per ciascuna classe di composti (dammarani, oleani e ursani) sono riportati in funzione dei giorni di esposizione.
Considerando le limitazioni delle misure quantitative effettuate in GC-MS in assenza di standard di riferimento, i valori di linearità ottenuti in questo studio sono sorprendentemente buoni. I grafici mostrano che, sebbene le pendenze siano in valore assoluto piuttosto piccole, queste sono tutte positive, indicando chiaramente un aumento del grado di ossidazione della resina all’aumentare dei giorni di esposizione, sia a carico dei triterpenoidi appartenenti alla classe dei dammarani, degli oleani, che degli degli ursani.
94
FIA-ESI-MS
In Figura 2 sono mostrati gli spettri di massa FIA-ESI-MS relativi alle stesure di riferimento di resina dammar invecchiate artificialmente e naturalmente al buio presso il NILU.
95 Figura 2. Spettri di massa FIA-ESI-MS relativi alle stesure di riferimento di resina dammar invecchiate presso il NILU: a) Dt0, naturalmente al buio, b) D3d, mediante esposizione per 3 giorni a ac. acetico, c)D1w, mediante esposizione per 1 settimana ad ac. acetico, d) D2w, mediante esposizione per 2 settimane ad ac. acetico, e) D3w, mediante esposizione per 3 settimane ad ac. acetico, f) D4w, mediante esposizione per 4 settimane ad ac. acetico.
Si può chiaramente osservare all’aumentare del periodo di esposizione ad acido acetico e quindi della dose giornaliera, una maggiore abbondanza relativa dei segnali appartenenti a molecole tritepenoidi a più alto grado di ossidazione: in Figura 3 è mostrato un ingrandimento degli spettri di massa nel range di m/z 400- 600 per la stesura invecchiata naturalmente (non esposta a vapori di acido acetico) con quella esposta per 4 settimane a vapori di acido acetico.
96 Figura 3. Spettri di massa FIA-ESI-MS relativi alle stesure di riferimento di resina dammar invecchiate presso il NILU: a) naturalmente al buio (t0), b) mediante esposizione per 4 settimane ad ac. acetico. Range di m/z: 350-600.
I profili mostrano di fatto un aumento dell’ossidazione molto più significativo di quello osservato tramite GC-MS. Infatti per esposizione a acido acetico non solo si osserva una variazione del profilo nella zona di m/z tra 409,350 e 481,359, che corrisponde al range di masse indagato anche dalla GC-MS, ma anche in quella di m/z tra 481,359 e 525,328, relativo a composti altamente ossigenati, non analizzabili in GC-MS.
Questo perché per esposizione ad acido acetico le molecole triterpenoidi hanno subito un incremento del peso molecolare, escludendo così la loro identificazione mediante il sistema GC. È stato provato che l’ossidazione dei triterpenoidi è caratterizzata da un incorporazione da uno fino a sei atomi di ossigeno,1-3 come
97 mostra anche chiaramente lo spettro in Figura 3. Quando gli atomi di ossigeno sono incorporati in più di una posizione all’interno della struttura della stessa molecola, si genera un numero di isomeri tale che può spiegare perché questi composti cadono sotto il limite di rivelabilità del sistema GC. Inoltre, quando gli atomi di ossigeno sono incorporati senza la diminuzione di atomi di idrogeno si generano gruppi funzionali idrossilici, trasformati dopo sililazione, in un gruppo OSiMe3 nell’analisi GC. Di conseguenza quando una molecola incorpora uno, due,
o sei atomi di ossigeno nella forma di un gruppo funzionale ossidrilico, il