L’attività di Akt subisce un rigido controllo da parte di proteine regolatrici, tra le quali ricordiamo la heat-shock-protein-90 (HSP90).
Si registra un aumento nell’attività di Akt a seguito di stress cellulari, quali lo shock termico, l’ipossia, lo stress ossidativo e la luce ultravioletta. Tale fenomeno di iperattivazione, indotta dai seguenti segnali di stress, viene messo in atto dalle cellule come meccanismo compensatorio, per sfuggire alla morte.
Il pathway PI3K/Akt/mTOR controlla numerosi fenomeni fisiologici tra cui la proliferazione, la progressione del ciclo cellulare, il metabolismo e l’apoptosi.
Alterazioni dell’asse PI3K/Akt/mTOR sono riscontrabili, come detto, in alcune cellule tumorali: ad esempio, l’attivazione di tale via di trasduzione è una peculiarità che accomuna le cellule leucemiche, isolate da pazienti affetti da leucemie linfoblastiche acute T[57].
Mutazioni determinanti la sovraespressione degli EGFR sono correlate al 30% circa di tutti i tumori di origine epiteliale, tra cui il tumore del polmone, della mammella, della vescica, della prostata e il carcinoma epidermoidale della testa e del collo.
In particolare, un’amplificazione delle vie di segnalazione degli EGFR è coinvolta nella regolazione di numerosi processi neoplastici, tra cui l’avanzamento del ciclo cellulare, l’inibizione dell’apoptosi e la metastatizzazione.
La via di trasduzione del segnale, in conseguenza di una overespressione di EGFR, conduce ad una abnorme proliferazione, che sfocia nella malignità del tumore. Sono stati riscontrati, infatti, elevati livelli di EGFR in pazienti oncologici affetti da neoplasie maligne, con alto rischio di recidiva e basso grado di sopravvivenza[52].
2.3.2 VEGFR
La sottofamiglia recettoriale VEGFR è composta da tre proteine-chinasi: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. I fattori di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF), che si legano a tali recettori, sono implicati sia nella vasculogenesi, che consiste nella formazione di vasi sanguigni de novo, durante lo sviluppo embrionale, sia nell’angiogenesi, la quale può essere fisiologica come nel ciclo mestruale, o patologica come nello sviluppo neoplastico. Il gene del VEGF umano è localizzato sul braccio corto del cromosoma 6 e fa parte di una famiglia di geni (PDGF/VEGF growth factor family) che codifica per i seguenti fattori di crescita: PlGF (Placental Growth Factor), VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D ed VEGF-E[58].
Il VEGF è stato classificato, a seguito di studi cristallografici a raggi X, fra le proteine facenti parte della superfamiglia dei fattori di crescita cisteinici, che include molecole le cui strutture terziarie sono stabilizzate dal “nodo cisteinico”, ovvero dal gruppo tiolico del residuo di cisteina.
Il VEGF è una glicoproteina omodimerica altamente conservata, con peso molecolare di 34-45 kDa, i cui monomeri sono legati da ponti disolfuro instauratisi fra due residui cisteinici. Entrambe le catene, disposte in senso antiparallelo, interagiscono con i recettori per mezzo di siti specifici localizzati ai due poli, attraverso interazioni idrofobiche. Riducendo i ponti disolfuro si ottengono i rispettivi monomeri, biologicamente inattivi. Grazie alla cristallografia a raggi X e alla spettroscopia NMR eteronucleare si è visto che, sia i monomeri, che il dimero di VEGF hanno strutture similari a quelle del PDGF, il fattore di crescita derivato dalle piastrine, anche se, contrariamente al PDGF, l’estremità N- terminale del VEGF presenta un’alfa-elica fondamentale per la genesi del dimero[59].
VEGF-A, proteina dimerica di 45 kDa, è il fattore maggiormente coinvolto nel processo di neovascolarizzazione, in quanto, oltre a stimolare la mitosi e la migrazione delle cellule endoteliali, induce la permeabilità microvascolare[52]. L’induzione della permeabilità
vascolare è considerato il passaggio iniziale, basilare per l’angiogenesi.
L’effetto permeabilizzante di VEGF-A è attribuibile ad un organulo presente nel citoplasma dell’endotelio vascolare, denominato organulo vescicolo-vacuolare (VVO). A livello dell’endotelio venulare, infatti, i VVO, agglomerati di vescicole e vacuoli, attivati dal VEGF-A, permettono lo stravaso delle proteine plasmatiche del lume verso lo spazio extracellulare[60].
VEGF-A è inoltre responsabile della formazione di zone di assottigliamento endoteliale, denominate fenestrazioni, in cui il lume vasale e l’interstizio si trovano ad essere separati solo da un sottile diaframma, determinante per lo stravaso dei soluti[61].
VEGF-A causa modificazioni nella morfologia delle cellule dell’endotelio e nell’organizzazione dell’actina; regola l’espressione della collagenasi, dell’urochinasi e dell’attivatore del plasminogeno tissutale, fattori determinanti nella degradazione della membrana basale e della matrice extracellulare durante l’angiogenesi[62].
Mentre alcuni processi, tra cui la variazione morfologica delle cellule endoteliali, presentano una lenta evoluzione, che va da poche ore ad alcune settimane, l’aumento della permeabilità vascolare si verifica in pochi secondi.
VEGF-A agisce legandosi ai recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 (Figura 15): di questi, il secondo è responsabile di quasi la totalità delle risposte cellulari coinvolte nello sviluppo angiogenico, mentre il primo pare modulare in senso negativo l’attività dell’altro, con lo scopo di inibire un’eccessiva neovascolarizzazione, in particolare in età embrionale[63].
Entrambi i recettori, espressi prevalentemente, ma non esclusivamente, dall’endotelio vascolare, presentano sette domini immunoglobulino-simili extracellulari, una regione transmembrana e un dominio tirosin-chinasico intracellulare.
La via di trasduzione del segnale, mediata da VEGF-A, inizia con l’autofosforilazione dei residui di cisteina localizzati nei domini citoplasmatici di VEGFR-1 e -2, cui segue la fosforilazione di ulteriori subunità proteiche e che culmina con l’attivazione delle cascate di segnalazione PI3K-Akt e MEK1-ERK1/2, implicate nella crescita tumorale.
VEGFR-1, viene legato, oltre che da VEGF-A, pure da VEGF-B, anche se la funzione di quest’ultimo non è stata ancora del tutto chiarita.
Le ricerche condotte su VEGF-B ne hanno evidenziato la presenza in tessuti con elevato metabolismo energetico, come il cervello, in particolare nell’ippocampo e nella corteccia
cerebrale. Esso sembra essere coinvolto, oltre che nella neuroprotezione, anche nella salvaguardia del cuore da danni di tipo ischemico, essendo in grado di indurre la crescita dei vasi coronarici. Nonostante ciò, a differenza degli altri componenti della famiglia dei fattori di crescita dell’endotelio vascolare, non è ancora stato chiarito il ruolo che VEGF- B ricopre nella crescita neoplastica[64].
VEGFR-2, conosciuto anche come KDR nell’uomo, è una glicoproteina recettoriale di 210- 230 kDa, espressa sia nelle cellule dell’endotelio vascolare che nei loro precursori embrionali.
L’attivazione di VEGFR-2, ad opera del legame con VEGF-A, VEGF-C e VEGF-D, determina la proliferazione, la migrazione e l’aumento della permeabilità delle cellule endoteliali[65]. Tale recettore è infatti particolarmente espresso in caso di angiogenesi attiva,
come nel ciclo riproduttivo femminile, nei processi di riparazione e rigenerazione tissutale; è evidente anche in processi patologici, quali la crescita del tumore primario e la formazione di metastasi[66]. Una sovraespressione di VEGFR-2 si evidenzia nel tumore del
polmone, della vescica, del seno, del colon e dello stomaco.
VEGFR-3, che presenta affinità di legame con VEGF-C e VEGF-D, è espresso sulle cellule endoteliali dei vasi linfatici. Grazie al legame di VEGF-C a VEGFR-3 si assiste alla formazione di nuovi vasi linfatici, a partire da vasi preesistenti, in un processo denominato linfoangiogenesi; avviene, inoltre, la differenziazione e la chemiotassi delle cellule endoteliali[67].
Essendo VEGFR-3 alla base della linfoangiogenesi, si riscontra, in svariate forme neoplastiche, come il tumore al seno, una sua iperespressione, a sostegno dei processi di metastatizzazione e invasione linfonodale.
VEGF-C, oltre ad avere effetti linfoangiogenici, mostra alcune proprietà paragonabili a quelle del VEGF-A, poiché capace di indurre la migrazione e la mitosi delle cellule endoteliali e di aumentare la permeabilità vascolare[68].
L’espressione di VEGF-D riguarda, invece, quasi esclusivamente il tessuto polmonare, tanto che il suo aumento nello sviluppo prenatale evidenzia il fondamentale compito che tale isoforma riveste nella vascolarizzazione del polmone. In particolare, VEGF-D legandosi, come abbiamo visto, ai recettori VEGFR-2 e VEGFR-3, stimola la proliferazione delle cellule endoteliali, ma non determina un aumento della permeabilità microvascolare.
VEGFR-1 VEGFR-2 VEGFR-3 VEGF-A SI SI NO VEGF-B SI NO NO VEGF-C NO SI SI VEGF-D NO SI SI VEGF-E NO SI NO PIGF SO NO NO
Figura 15. Legame fra le principali proteine VEGF ed i rispettivi recettori.