La proliferazione, la morte e il differenziamento cellulare subiscono una regolazione da parte di molecole segnale, i fattori di crescita. Nelle cellule tumorali i meccanismi deputati al controllo del corretto svolgimento di tali segnalazioni risultano alterati, mentre sono efficienti nelle cellule sane.
Le proteine chinasi, essendo coinvolte nella trasduzione del segnale, controllano i sopracitati processi cellulari e sono, dunque, un valido target nella terapia antitumorale. Considerando che il processo di fosforilazione proteica, che vede il coinvolgimento delle chinasi, ricopre un ruolo cardine nella comunicazione intracellulare, nell’omeostasi e nel funzionamento del sistema nervoso e immunitario, appare chiaro che anomalie a livello chinasico, con chinasi spesso iperespresse, sia alla base di svariate patologie, tra cui il cancro[39].
2.1 Il più grande gruppo di enzimi presenti in natura: le chinasi
Un enzima capace di trasferire un gruppo γ-fosfato dell’ATP (o meno frequentemente del GTP) a specifici substrati è chiamato “chinasi”. Mediante tale processo, definito “fosforilazione”, le chinasi possono attivare o inibire subunità proteiche e regolare, dunque, molte funzioni cellulari, quali, ad esempio, la duplicazione del DNA, la trascrizione, il controllo del ciclo cellulare, i meccanismi di trasporto ed il metabolismo energetico. La fosforilazione è un processo reversibile e tale reversibilità è garantita da proteine che rimuovono il gruppo fosfato legato covalentemente al substrato, denominate “fosfatasi”. L’omeostasi della cellula è quindi subordinata ad un rigoroso e armonico equilibrio tra chinasi e fosfatasi.
In base al substrato accettore fosforilato, le proteine chinasi possono essere classificate in tre categorie:
• tirosina chinasi, in cui il gruppo fosfato dell’ATP è trasferito ad un residuo di tirosina; • serina/treonina chinasi, in cui il gruppo fosfato è trasferito ad un residuo di serina o di
treonina;
Nonostante fosse chiara, sin dalla metà degli anni ’70, l’esistenza di una grande famiglia di proteine con attività fosforilativa, risale agli anni ’94-’95 la prima classificazione, ad opera di S.K. Hanks e T. Hunter, delle proteine chinasi eucariotiche[40]. Tale catalogazione
fu aggiornata, grazie a Manning G., e pubblicata su Science, nel 2002[39].
Nel genoma umano sono state codificate 550 chinasi (kinoma umano), di cui 518 a struttura proteica. Come riporta la classificazione, delle 518 proteine chinasi 478 sono eucariotiche (EPK), mentre 40 sono denominate proteine chinasi atipiche (APK), in quanto, nonostante presentino differenze di sequenza rispetto alle EPK, hanno comunque attività chinasica. Le proteine chinasi eucariotiche sono ulteriormente suddivise in 8 grandi categorie: TK (tyrosine kinase), TKL (tyrosine kinase-like), STE (STE20, STE11, and STE7 related), CK1 (casein kinase 1), AGC (protein kinase A, protein kinase G, and protein kinase C
related), CAMK (Ca2+/calmodulin-dependent kinases), CMGC (Cdk, MAPK, GSK, Cdk-
like related), RGC (receptor guanylyl cyclase)[41].
2.2 Le proteine tirosina chinasi
La famiglia delle tirosin-chinasi, che comprende 90 proteine, è divisa in due importanti sottofamiglie:
- RTK (receptor tyrosin kinases): costituita da 58 diversi recettori, suddivisibili in 20 gruppi (Figura 11), in base al gene da cui derivano (ALK, Axl, DDR, ErbB, Eph, FGF, Ins, LMR, Met, MuSK, PDGF, PTK7, Ret, Ror, Ros, Ryk, STYK1, Tie, Trk, VEGF). - nRTK (non receptor tyrosin kinases): 32 proteine, suddivisibili in 10 gruppi (ABL,
Figura 11[43]. Le 20 famiglie di RTKs.
Le proteine tirosin-chinasi recettoriali, localizzate sulla membrana cellulare, sono implicate nella trasduzione del segnale dall’ambiente extracellulare a quello citoplasmatico; le proteine chinasi non recettoriali, invece, trasmettono i segnali intracellulari[44].
I recettori tirosin-chinasici (RTK) sono proteine transmembrana, costituite da 5 regioni principali:
• una regione extracellulare, N-terminale, che contiene il sito di interazione per il ligando e che rappresenta la porzione più variabile del recettore;
• una sequenza transmembrana, costituita da una singola alfa-elica, di connessione tra la porzione extra e intra-cellulare;
• una regione regolatoria juxtamembrana, che separa la sequenza transmembrana dal dominio catalitico ed è solitamente conservata tra i recettori della stessa sottofamiglia; • un dominio catalitico citoplasmatico, con attività tirosin-chinasica;
• una coda C-terminale.
Il dominio tirosin-chinasico presenta una struttura bilobata, con un lobo N-terminale, costituito da un foglietto beta a 5 filamenti e un’alfa-elica, e con un lobo C-terminale, formato principalmente da strutture alfa-elica. Tra i due lobi troviamo un’inarcatura della superficie proteica, che costituisce il sito di attacco per l’ATP[45].
Tutti i membri appartenenti alle sottofamiglie di RTKs presentano analogie dimensionali nel dominio ad attività tirosin-chinasica, mentre si osservano variazioni, in termini di dimensioni, nella regione juxtamembrana e nella coda carbossi-terminale. Alcuni RTKs inoltre, ad esempio quelli appartenenti alla famiglia PDGFR, presentano un’interruzione nel dominio tirosin-chinasico di circa 100 amminoacidi[46].
L’attivazione dei recettori tirosin-chinasici (Figura 12) avviene grazie al legame del ligando sul loro dominio extracellulare. Tale interazione determina la dimerizzazione del recettore, che attiva così un processo di autofosforilazione intramolecolare dei residui tirosinici del dominio citoplasmatico. Questo processo innesca l’attività chinasica del recettore, dando vita ad una cascata di segnali biochimici facenti parte del complesso meccanismo di trasduzione del segnale.
Figura 12[47]. Struttura e attivazione di un RTK, in particolare del EGFR.
Tali reazioni intracellulari, arrivando infatti all’interno del nucleo e interagendo col DNA, possono determinare la promozione o l’arresto della crescita cellulare[48].
Sono principalmente due le strategie mediante cui i ligandi, interagendo con il proprio recettore, avviano il processo di dimerizzazione dello stesso: il ligando può legare due molecole di recettore per dare un complesso 1:2, oppure due molecole di ligando si possono
legare simultaneamente a due recettori, formando un complesso 2:2: è questo il caso, ad esempio, del VEGF e del VEGFR[49].
2.3 Tirosina chinasi e vie di segnalazione coinvolte nel cancro
Nelle cellule tumorali, al contrario di quanto si verifica fisiologicamente, il livello di attività tirosin-chinasica può subire un incremento anche di 10-20 volte. Per tale ragione, le proteine tirosina chinasi e i relativi meccanismi di trasduzione del segnale possono essere identificate come potenziali bersagli farmacologici nella terapia del cancro.
È di fondamentale importanza interpretare come alterazioni nella regolazione di tali segnali siano associate all’oncogenesi: un’eccessiva attività chinasica, infatti, determina anomalie qualitative o quantitative nella trasduzione del segnale. Nelle cellule cancerose, contrariamente a quanto si verifica in quelle sane, possono essere espressi molti più recettori per i fattori di crescita e tale sovraespressione determina la costante attivazione del sistema di trasduzione. Si possono anche riscontrare mutazioni genetiche che determinano disfunzioni recettoriali, con continua attivazione del recettore stesso, anche in assenza del fattore di crescita; si può verificare, inoltre, una up-regulation delle proteine deputate alla trasduzione del segnale, o mutazioni genetiche a livello delle stesse, con conseguente alterazione del messaggio inviato al nucleo della cellula[50].
Ad esempio, mutazioni a livello dei geni codificanti per la regione regolatoria juxtamembrana, per il dominio catalitico o per la coda carbossi-terminale sono correlate a svariati tumori solidi e a neoplasie del sistema emopoietico.
Sono molte le malattie imputabili ad un’aberrante espressione e/o attività delle tirosin- chinasi. Uno studio pubblicato sulla rivista Nature Cell Biology ha messo in luce la relazione tra la tirosina chinasi Src e l’invasività del cancro, specie quello intestinale[51];
altre sottofamiglie coinvolte nella carcinogenesi sono, ad esempio, ErbB, VEGFR, PDGFR, InsR[52], Ret.
2.3.1 ErbB
La sottofamiglia ErbB è composta da quattro recettori tirosin-chinasici: ErbB1 (EGFR o HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) e ErbB4 (HER4).
Il recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) è un recettore di membrana che lega il fattore di crescita dell’epidermide (EGF) e ha un ruolo fisiologico nella crescita, nella proliferazione e nel differenziamento cellulare. L’interazione ligando-recettore
innesca il processo di dimerizzazione, cui fa seguito l’autofosforilazione del recettore sui residui tirosinici. Si attivano, dunque, principalmente due vie di trasduzione del segnale all’interno della cellula: Ras/Raf e Inositol trifosfato 3′chinasi/Akt.