FITOALESSINE E DALL ’ AZIONE DI PROTEINE CONNESSE A PATOGENES

La sequenza e la durata degli eventi che si osservano già dai primi minuti dall’interazione ospite-patogeno variano in base al tipo di ospite e di patogeno. Tuttavia 3 eventi chiave sono comuni a tutte le interazioni, l’aumento della concentrazione di calcio citosolico e dei flussi ionici transmembrana, l’aumento dell’attività chinasica ed il verificarsi di un “burst” ossidativo e nitrosativo (Ebel e Mithofer, 1998, Bolwell, 1999).

Alla luce di questa conoscenza è significativo il ritrovamento di geni con modulazione già nelle prime 12 ore, che sembrano correlati a questi processi. In particolare si è verificata la repressione di un gene codificante la proteina legante calcio, calmodulina (Q6LCY3), l’induzione di geni codificanti un canale di K+ _{(Q9FS92) e di una H+ATPasi vacuolare}

(Q9MB47) e la repressione di geni per fosfatasi (Q8GUC2 e Q9M3V1) unita all’induzione di geni per recettori coinvolti nella fosforilazione proteica (Q8GZ99, Q8VWW7, Q9FTF3, Q5Z9P3).

Per quanto riguarda l’interazione vite-P.viticola in particolare, studi in vitro con piantine di vite resistenti al fungo hanno mostrato come all’infezione segua un meccanismo attivo di difesa, temporalmente controllato, che prevede anche l’attivazione trascrizionale di geni codificanti proteine connesse a patogenesi (PR), enzimi che sintetizzano composti fenolici nella parete ed enzimi di sintesi di fitolaessine (Kortekamp e Zyprian, 2003).

Numerosi geni significativamente modulati nell’analisi “oligo-array” codificano per proteine PR ed il loro profilo di espressione sembra essere il risultato di una complessa regolazione, genotipo dipendente, tra il meccanismo di resistenza basale e quella indotta dal patogeno fungino.

Nel genotipo resistente l’induzione a 96 hdi del gene codificante per PR1 (AJ536326) è in accordo con la capacità di tali proteine di contrastare la crescita degli oomiceti patogeni,

sebbene la loro espressione non sia specifica ma spesso effetto di un meccanismo generale di stress (Van Loon et al., 1999).

È significativo che il gene omologo ad un’osmotina (Y10992) è risultato indotto nell’individuo resistente F1 21/66 e represso precocemente nell’individuo suscettibile F1 22/73, mentre un

altro gene codificante per una taumatina (TC38581) è risultato represso in entrambi gli individui.

Vi sono infatti evidenze contrastanti in vite riguardo al ruolo di taumatine ed osmotine (PR5) nella risposta a patogeni fungini: esse mostrano una forte attività antifungina in vitro inibendo lo sviluppo fungino (Monteiro et al., 2003), ma risultano costitutivamente espresse in cultivar resistenti e suscettibili di Vitis spp. dopo infezione con P. viticola (Kortekamp, 2006).

La repressione dei due geni (Y10992 e TC38581) nell’individuo suscettibile è accompagnata dalla contemporanea induzione del gene codificante per una proteina “RING/C3HC4/PHD zinc finger-like” (Q84KA9). È noto che in piante di Arabidopsis in cui è stato sovraespresso il gene CaRFP1 che codifica per una proteina RING/C3HC4 è accompagnata dalla repressione dei geni PR5, conferendo suscettibilità a Pseudomonas syringae pv. tomato (Hong et al., 2006). Il profilo di espressione nell’individuo resistente e in ‘Teroldego’ del gene PR10.1 di V. vinifera (AJ291705), codificante per una proteina connessa a patogenesi con attività ribonucleasica, è in accordo con il ruolo ipotizzato per le proteine PR10 in cultivar di Vitis spp. resistenti e suscettibili a P. viticola (Kortekamp, 2006): l’induzione tardiva nell’individuo resistente sarebbe alla base dello sviluppo della risposta ipersensibile, l’induzione precoce nell’individuo suscettibile non sarebbe invece in grado di frenare il patogeno dopo la sua penetrazione. Infine l’ espressione costitutiva nell’individuo resistente dei geni per le chitinasi PR3 (DQ267094) e PR4 (AB105374) potrebbe rappresentare parte del meccanismo basale di resistenza, in contrasto con la repressione di PR3 in entrambi gli individui suscettibili. è diverso il caso del gene PR2 codificante una E-1,3-glucanasi (AJ277900), che è risultato esclusivamente espresso dopo infezione nell’individuo resistente.

Dal momento che la parete cellulare di P. viticola e di altre Peronosporaceae è costituita da chitina e glicano, l’espressione costitutiva o indotta di chitinasi e glucanasi potrebbe contribuire all’inibizione della crescita del fungo o degradandone direttamente la parete cellulare o generando dei frammenti che funzionano da elicitori di altri meccanismi di resistenza a valle (Robert et al., 2002, Busam et al., 1997b, Kortekamp, 2006).

Anche l’espressione di geni codificanti gli enzimi di sintesi di composti fenilpropanoidi è risultata fortemente dipendente dal genotipo.

L’induzione nel genotipo resistente dei geni 4CL (TC44994), COMT (Z54223) e DFR (X75964), codificanti rispettivamente per la 4-cumarato-CoA ligasi, la caffeico-O- metiltransferasi e la diidroflavonol 4-reduttasi, suggeriscono che in F1 21/66 la presenza del fungo stimoli sintesi di lignina e proantocianidine a differenza dei genotipi suscettibili, in cui tali geni sono repressi.

Anche l’espressione di membri delle stilbene sintasi, l’enzima di sintesi del resveratrolo, è strettamente dipendente dal “background genetico”: il gene per la StSy (S63225), isolato nel lavoro da sospensioni cellulari di Vitis vinifera cv. Optima (Melchior e Kindl, 2001), è indotto solo nell’individuo resistente (F1 21/66), mentre il gene per la StSy (X76892), isolato nel lavoro

di Sparvoli et al., 2004, è indotto negli individui F1 21/66 e ‘Teroldego’ mentre è represso

nell’individuo suscettibile F1 22/73.

Sulla base di questi risultati, il profilo di espressione del gene per la StSy (S63225), indotto esclusivamente nell’individuo resistente, è stato validato con “Real-time RT-PCR” ed analizzato anche al parentale Freiburg.

Il fatto che tale gene sia risultato costitutivamente espresso negli individui suscettibili, precocemente indotto e poi represso nel parentale Freiburg, parzialmente resistente, ed indotto gradualmente nell’individuo resistente è in accordo con pubblicazioni precedenti (Wiese et al., 2004, Borie et al, 2004, Serazetdinova et al., 2005). Risultati simili sono stati ottenuti anche in un’analisi di espressione genica che utilizza cultivar resistenti e suscettibili di

Vitis spp., trattate con Uncinula necator. Essi hanno evidenziato come il gene codificante la stilbene sintasi (S63225) venga indotto a 12 h e represso a 48 h dall’infezione nella cultivar suscettibile (Qiu W., personal communication).

Tali evidenze a livello molecolare sono in buon accordo con i risultati ottenuti a livello biochimico e presenti in letteratura (Pezet et al., 2004a): l’induzione precoce della StSy negli individui suscettibili e la conseguente sintesi di resveratrolo, non conferirebbero resistenza, poiché lo stilbene verrebbe rapidamente trasformato nel derivato glicosilato e non tossico chiamato piceide; l’induzione precoce ma progressiva del gene nell’individuo resistente garantirebbe invece un continuo apporto di resveratrolo, che, per opera di specifiche perossidasi, verrebbe dimerizzato, con la sintesi di viniferine ad azione più tossica.

COMUNICAZIONE TRA VIE DI SEGNALAZIONE COINVOLTE NELLA DIFESA E TRA VIE DI