INCORPORAZIONE DEL FLUOROFORO

Eseguito l’accoppiamento del fuloroforo, l’aaRNA marcato è stato purificato eseguendo i seguenti passaggi:

- a ciascun tubo sono stati aggiunti 105 Ƭl di “aRNA Binding Buffer” e subito dopo 75 Ƭl di etanolo 100% , pipettando 3 volte;

- la miscela è stata caricata immediatamente in una colonna “Labeled aRNA Filter Cartridge”, posizionata sopra ogni tubo, e si è centrifugato a 10.000 g per 1 min a temperatura ambiente;

- dopo aver scartato il sopranatante, la colonna è stata lavata con 500 Ƭl di “Wash buffer” e si è centrifugato a 10.000 g per 1 min a temperatura ambiente;

- dopo aver scartato il sopranatante, si è centrifugato a 10.000 g per 1 min a temperatura ambiente per eliminare i residui di “Wash buffer”;

- dopo aver trasferito la colonna in un nuovo tubo, l’aaRNA marcato è stato eluito con 10 Ƭl di H20 DEPC pre-riscaldata a 55°C, lasciando incubare a temperatura ambiente

per 2 min, e si è centrifugato a 10.000 g per 2 min a temperatura ambiente; il passaggio è stato ripetuto due volte.

Per calcolare l’efficienza di incorporazione del fluoroforo (Cy5) sono state eseguite due misure spettrofotometriche a 260 nm e a 650 nm (A max di Cy5) di una diluizione 1:70 in TE dell’aaRNA marcato.

Il numero di molecole di aRNA marcato per 1000 pb è stato calcolato con la seguente formula:

# molecole aaRNA marcato = A 650x 9010 cm-1M-1 x 1000

1000 pb A 260 H Cy5

in cui H Cy5 (650nm)= 250.000 cm-1_M-1

Il numero di molecole di aRNA marcato atteso è compreso tra 30 e 60 molecole di aRNA marcato per 1000 pb.

3.9.4 I

L’ibridazione del vetrino CustomArray™4x2K è stata eseguita secondo il protocollo “Hybridization and Imaging Protocol” (CMBX).

Prima di procedere con l’ibridazione, sono state inoltre preparate le soluzioni, la cui composizione è descritta nelle seguenti tabelle.

Tabella 14 Composizione 20X SSPE Buffer

Componente Concentrazione

NaCl 3M

Na2PO4 173mM

Tabella 15 Composizione 2X Hyb Solution

Componente Concentrazione

20X SSPE Buffer (Tabella 14) 12X

10% Tween-20 0,1%

0,5M EDTA 40mM

H20 DEPC A volume

Tabella 16 Composizione Soluzione di frammentazione 5X

Componente Concentrazione

1M Tris Acetato pH 8,1 200 mM

KOAc 500 mM

MgOAc 150 mM

H20 DEPC A volume

Tabella 17 Composizione delle soluzioni di lavaggio

Soluzione Componenti

6X SSPET 6X SSPE Buffer

0,05%Tween-20

3X SSPET 3X SSPE Buffer

0,05%Tween-20

0.5X SSPET 0.5X SSPE Buffer

0,05%Tween-20

PBST PBS 2X (Ambion)

0,1%Tween-20

PBS PBS 2X (Ambion)

Considerato che il vetrino CustomArray™4x2K è costituito da 4 “array” indipendenti, per ciascuna ibridazione si è proceduto secondo il seguente schema sperimentale:

- primo e secondo “array” sono state ibridati con 1Pg aaRNA marcato di due repliche biologiche del campione controllo;

- terzo e quarto “array” sono stati ibridati con 1Pg di aaRNA marcato di due repliche biologiche del campione trattato.

Ogni esperimento di ibridazione è stata poi eseguito in triplicato.

In ogni esperimento di ibridazione sono stati eseguiti i seguenti passaggi:

- assemblaggio del vetrino, tramite un “clamp” fornita nel kit, con una camera di ibridazione divisa in 4 settori, facendo attenzione ad esporre la superficie semiconduttrice verso l’alto;

- reidratazione del vetrino ponendo in ogni settore 30 Pl di acqua, coprendo la camera di ibridazione con dello “scotch” ed incubando a 65°C per 10 min, in un fornetto di ibridazione;

- sostituzione in ogni settore dei 30 Pl di acqua con 30 Pl di soluzione di pre- ibridazione, pipettando 3 volte. Dopo aver posto dello “scotch” sopra la camera di ibridazione, il vetrino è stato incubato a 45°C per 3 min.

Considerando i 4 settori, è stata preparata al momento una soluzione di pre- ibridazione da 150 Pl costituita dai seguenti reagenti:

75Pl Hyb Solution 2X ( Tabella 15) 51 Pl H20 DEPC

15 Pl Soluzione Denhardt 50X (Ambion) 1,5 Pl di DNA di salmone (10 mg/ml)* 7,5 Pl SDS 1 %

* il DNA di salmone è stato denaturato a 95°C per 7 min e subito posto in ghiaccio.

- frammentazione dei campioni di aaRNA marcato da ibridare (“target”), dopo aver assemblato la miscela di reazione con i seguenti reagenti:

2 Pg aaRNA marcato

1,2 Pl Soluzione di frammentazione 5X (Tabella 16) H20 DEPC a 6 Pl

Si è poi incubato a 95°C per 20 min. Dopo la frammentazione i campioni sono stati mantenuti in ghiaccio fino alla preparazione della soluzione di ibridazione;

- sostituzione in ogni settore dei 30 Pl di soluzione di pre-ibridazione con 30 Pl di soluzione di ibridazione, pipettando 3 volte. Dopo aver posto dello “scotch” e dell’alluminio sopra la camera di ibridazione, il vetrino è stato incubato in un fornetto di ibridazione a 45°C in rotazione per tutta la notte.

Per ogni campione da ibridare la soluzione di ibridazione di 30 Pl era costituita dai seguenti reagenti:

15 Pl Hyb Solution 2X (Tabella 15) 7,5 Pl Formamide deionizzata

0,3 Pl DNA di salmone (10 mg/ml) denaturato 1,2 Pl SDS 1%

3.9.5 L

Prima di procedere ai lavaggi del vetrino la soluzione SSPET 6X è stata pre-riscaldata a 50°C per 10 min.

I lavaggi sono quindi stati eseguiti secondo i seguenti passaggi:

- rimozione del vetrino dal fornetto di ibridazione e sostituzione dei 30 Pl della soluzione di ibridazione con 30 Pl di soluzione SSPET 6X pre-riscaldata in ogni settore di ibridazione;

- incubazione del vetrino nel fornetto di ibridazione a 45°C in rotazione per 5 min, dopo aver posto dello “scotch” sopra la camera di ibridazione;

- esecuzione di 4 lavaggi in successione in ogni settore di ibridazone, utilizzando in successione 30 Pl delle soluzioni SSPET3X, SSPET 0,5X, PBST (Tabella 17), pipettando 3 volte e aspettando 1 min tra un lavaggio e l’altro;

- esecuzione di 2 lavaggi con 30 Pl della soluzione PBS (Tabella 17), intervallati da 1 min di incubazione.

Ultimati i lavaggi, la camera di ibridazione è stata rimossa dal vetrino, che è stato poi a sua volta estratto dalla “clamp”. Prima di procedere all’acquisizione del segnale, sulla superficie semiconduttrice del vetrino sono state poste alcune gocce di Imaging solution™ ed è stata posizionata accuratamente una LifterSlip™, entrambe fornite con il vetrino, prestando attenzione di porre i lati ruvidi della LifterSlip™ verso la superficie semiconduttrice e di non fare bolle. Prima di procedere alla scansione è stato inoltre rimosso l’eccesso di Imaging solution.™

3.9.6 L

Per la scansione del vetrino è stato utilizzato l’apparato di scansione per vetrini microarray ScanArray4000XL (Perkin Elmer). Tale strumento è costituito da un laser in grado di eccitare il fluoroforo utilizzato per la marcatura dei campioni e da un sistema di scansione basato su un microscopio confocale per raccogliere la fluorescenza emessa in corrispondenza degli “spot”. L’intensità della fluorescenza viene quindi misurata attraverso dei fotomoltiplicatori e i dati relativi vengono raccolti da un apposito “software”.

Lo strumento è stato pilotato via software con il programma ScanArray Express. Sono stati impostati i seguenti parametri:

- Scan resolution: 5 Pm - Scan Speed: Half

- Fluorophores: Cys5

I parametri PMT gain e Laser Power sono stati regolati in modo da avere un segnale attorno al 75%. Le potenze sono state abbassate in caso di un segnale saturo da parte di alcuni “spot”. Al termine della scansione, le immagini acquisite sono state salvate ed esportate in formato .tif ed il vetrino è stato posto in PBS1X per mantenerlo idratato.

La quantificazione del segnale è stata eseguita tramite MicroArray Imager™ (CMBX).

Dopo aver caricato il file .xlm, che contiene le informazioni relative al disegno dei “probe” su vetrino e il file immagine .tif, acquisito durante la scansione, la fase successiva è consistita nell’acquisire i dati posizionando una griglia sull’immagine scansionata del vetrino, in coincidenza della griglia presente sulla superficie semiconduttrice. Il programma ha poi eseguito la quantificazione dell’intensità di fluorescenza di ogni “spot” facendo la media del segnale dei pixel inclusi nei circoletti che delimitano ogni “spot”.

L’acquisizione finale dei dati di espressione è avvenuta tramite l’esportazione di un file .txt.