V ARIABILITÀ NELLA PRODUZIONE DI FITOALESSINE
3 MATERIALI E METODI 1 MATERIALE VEGETALE
3.5 MESSA A PUNTO DI UN METODO DI ISOLAMENTO DI VINIFERINE
Per la messa a punto del metodo sono state utilizzate le prime 10 foglie di 2-3 germogli di 17 individui, campionate a 6 giorni dall’infezione artificiale con P. viticola eseguita sulle piante in campo. Le foglie campionate da ciascun individuo sono state poi riunite per avere il maggior quantitativo possibile per l’estrazione in HPLC.
Nell’analisi è stata utilizzata acqua MilliQ, tutti gli altri solventi sono stati forniti da Carlo Erba e presentano un grado di purezza per HPLC.
3.5.1 E
STRAZIONEIl materiale fogliare infettato con P. viticola è stato pesato, trasferito in un pallone da 5l, in cui sono stati aggiunti circa 4l di metanolo, e lasciato a macerare nel solvente per 2 giorni al buio, a temperatura ambiente e in atmosfera satura di azoto, in modo da evitare possibili reazioni di ossidazione. Dopo 2 gg il solvente è stato recuperato e ridotto ad un volume di 200 ml con evaporatore rotante. Anche il materiale fogliare è stato recuperato e sottoposto ad una seconda estrazione; in questo caso le foglie sono prima state macinate in metanolo e al macinato è stato aggiunto metanolo fino ad un volume di 500 ml. Il materiale è stato lasciato a macerare nel solvente per 1 giorno al buio, a temperatura ambiente e in atmosfera satura di azoto dopo di che il solvente è stato recuperato e il macinato è stato eliminato.
Al fine di valutare la quantità di stilbeni presenti e l’efficienza dell’estrazione, 5 ml di entrambi gli estratti sono stati prelevati, portati ad un volume di 0,5 ml (concentrato 10 volte) con evaporatore rotante, purificati su cartuccia Isolute ENV+ 100 mg/3ml (International Sorbent
Technology) e preparati per l’analisi HPLC-DAD-MS secondo la stessa metodica preparativa
utilizzata per la caratterizzazione degli stilbeni.
3.5.2 C
ROMATOGRAFIA“
FLASH”
SU RESINA“I
SOLUTEENV+”
CONHPLC
PREPARATIVOLa corsa cromatografica è stata condotta con HPLC preparativo “Shimadzu SCL-10 AVP”, equipaggiato con un rilevatore UV-VIS Shimadzu SPD-10 AVP, con pompe 8A e un “software Class VP” (Shimadzu Corp.).
Per la cromatografia flash sono stati utilizzati 20 g di resina di “polistirene/divinilbenzene ENV+ bulk isolute sorbent” (International Sorbent Technology Ltd ), con dimensione dei granuli compresa tra 40-70 Pm e dimensione media dei pori di 60 Pm. La resina è stata impaccata con acqua in una colonna “Isolute SPE syringe column” (IST Ltd) da 150 ml, chiusa alle estremità con due dischi “Isolute spe accessories” (IST Ltd). La resina impaccata è stata poi attivata con 200 ml di metanolo e 300 ml di acqua.
Il sopranatante proveniente dalla prima estrazione (200 ml), dopo essere stato filtrato a pressione ridotta su filtro “Durapore” da 0,22 Pm (Millipore), è stato mescolato a 10 g di resina
attivata e portato a secco con evaporatore rotante. La resina è stata risospesa in circa 50 ml di acqua, riunita alla resina rimasta nella colonna e reimpaccata con 200 ml di acqua.
La colonna è stata montata sul sistema HPLC, senza collegarla al rilevatore UV-VIS, ed eluita a temperatura ambiente, ad un flusso di 25 ml/min, con la seguente sequenza di solventi:
- 500 ml Acqua;
- 2 l Miscela pentano:diclorometano (2:1); - 500 ml Acetato di etile;
- 500 ml Metanolo.
Le frazioni in pentano/diclorometano, acetato di etile e metanolo sono state portate a secco con evaporatore rotante, risospese in 50 ml di metanolo (concentrate 4 volte rispetto all’estratto) e iniettate in HPLC-DAD-MS per verificare la presenza di stilbeni. La frazione in acqua è stata invece iniettata tal quale.
3.5.3 C
ROMATOGRAFIA“
FLASH”
SU RESINA“T
OYOPEARLHW 40 S”
CONHPLC
PREPARATIVOQuesta corsa cromatografica è stata eseguita con lo stesso sistema HPLC impiegato nella precedente cromatografia, utilizzando però 20 g di resina “Toyopearl HW 40 S” (Tosoh Corp). La resina è stata impaccata con acqua in una colonna “Isolute SPE syringe column” (IST Ltd) da 150 ml, chiusa alle estremità con due dischi “Isolute spe accessories” (IST Ltd).
La soluzione metanolica contenente gli stilbeni, proveniente dalla precedente cromatografia, è stata mescolata a 10 g di resina, precedentemente impaccata e portata a secco con evaporatore rotante.
La resina secca è stata risospesa in circa 50 ml di acqua e caricata in testa alla colonna; la colonna è stata reimpaccata con 200 ml di acqua.
La colonna è stata poi montata sul sistema HPLC, lavata con 500 ml di acqua ad un flusso di 10 ml/min e collegata, dopo lavaggio, al rivelatore DAD. Il cromatogramma UV-VIS è stato registrato a 280 nm.
La fase mobile utilizzata nella separazione cromatografica era costituita da acqua (solvente A) e da metanolo (solvente B).
La corsa cromatografica è stata eseguita a temperatura ambiente in 80 minuti, ad un flusso costante di 10 ml/min, nelle seguenti condizioni:
- gradiente lineare da 0% a 100% di solvente B in 60 minuti; - 100% di solvente B fino ad 80 minuti.
Tutto il materiale eluito dalla colonna è stato raccolto in frazioni da 25 ml.
Tutte le frazioni raccolte sono state iniettate tal quali in HPLC-DAD-MS per verificarne il contenuto in stilbeni.
3.5.4 C
ROMATOGRAFIA SU COLONNA“D
ISCOVERYHS C18”
CONHPLC
PREPARATIVOLa separazione finale dei composti stilbenici è stata eseguita con HPLC preparativo (Shimadzu SCL-10 AVP), utilizzando una colonna “Discovery HS C18” (Supelco) di 250x50 mm, a granulometria di 10 Pm, ed una pre-colonna “Pelliguard LC-18”. A protezione della colonna è stato montato, a monte della pre-colonna un filtro PEEK da 2 Pm (Gilson).
La fase mobile utilizzata nella separazione cromatografica era costituita da acqua (solvente A) e da acetonitrile (solvente B).
Prima dell’analisi la colonna è stata lavata con 300 ml di acetonitrile e poi condizionata con 500 ml di acetonitrile al 25% in acqua.
Le frazioni contenenti stilbeni provenienti dalla precedente cromatografia sono state riunite, portate a secco e risospese in 50 ml di metanolo; 5 ml di questa soluzione sono stati iniettati in colonna e la corsa cromatografica è stata eseguita a temperatura ambiente, ad un flusso di 40 ml/min, con un gradiente lineare da 25% a 55% del solvente B in 60 minuti.
Tutto il materiale eluito in corrispondenza dei picchi è stato raccolto separatamente e iniettato tal quale in HPLC-DAD-MS per identificare i singoli composti.